Charakterisierung und Stabilit��t von Arthropoden-H��mocyanin

H��mocyanine sind gro��e, multimere Sauerstofftransport- proteine, die frei gel��st in der H��molymphe von Arthropoden und Mollusken vorkommen.Zur Charakterisierung verschiedener Arthropoden-h��mocyanine wurden deren molare Massen bestimmt. Die mit einer Vielwinkel-Laser-Lichtstreuapparatur ermittelten Molekulargewichte zeigten eine grosse Schwankungsbreite. Dies konnte auf Ungenauigkeiten der zur Berechnung der Molekulargewichte verwendeten spezifischen Extinktions- koeffizienten und Brechungsindex-Inkremente zur��ckgef��hrt werden.Mit der Methode der Massenspektrometrie (MALDI-TOF) bestimmte Molekulargewichte einzelner Untereinheiten des H��mocyanins der Vogelspinne <i style='mso-bidi-font-style: normal'>Eurypelma californicum</i> zeigten eine sehr gute ��bereinstimmung mit aus der Sequenz errechneten Werten.F��r das 24-mere Spinnenh��mocyanin von <i style='mso-bidi-font-style:normal'>Eurypelma californicum</i> wurde die Stabilit��t gegen��ber GdnHCl und der Temperatur auf den verschiedenen strukturellen Ebenen des Proteins untersucht.Viele Stabilit��tsuntersuchungen werden an kleinen Proteinen durchgef��hrt, deren Entfaltung kooperativerfolgt. Bei gr����eren Proteinen mit unterschiedlichen strukturellen Bereichen (Dom��nen) ist der Entfaltungs-prozess weitaus komplexer. Ziel war es, durch die Denaturierung des Spinnen-H��mocyanins Erkenntnisse ��ber die Stabilit��t und Entfaltung der verschiedenen strukturellen Ebenen eines so gro��en Proteinkomplexes zu gewinnen.Ein wichtiges Charakteristikum f��r die Interpretation der Entfaltungsexperimente ist die starke L��schung der Tryptophanfluoreszenz im oxygenierten Spinnen-H��mocyanin. Die L��schung kann vollst��ndig durch F��rster-Transfer erkl��rt werden kann. Sie bleibt auf die einzelnen Untereinheiten beschr��nkt und stellt somit ein reines O₂-Beladungssignal dar.Unter Einwirkung von GdnHCl dissoziiert das native, 24-mere Spinnen-H��mocyanin ohne die Entstehung langlebiger Inter- mediate. Die Untereinheiten werden durch das Oligomer stabilisiert. Die Entfaltung eines Monomers, der Unter- einheit <u>e</u>, folgt einer Hierarchie der verschiedenen strukturellen Ebenen des Molek��ls. Die Entfaltung beginnt zun��chst von au��en mit der Auflockerung der Terti��rstruktur. Der Kern von Dom��ne II mit dem aktiven Zentrum weist hingegen eine besondere Stabilit��t auf.Die ausgepr��gte Hitzestabilit��t des <i style='mso-bidi-font-style:normal'>Eurypelma</i>-H��mocyanins h��ngt vom Oligomerisierungsgrad, dem verwendeten Puffer und dessen Ausgangs-pH-Wert ab und spiegelt offensichtlich die extremen Lebensbedingungen im Habitat wider.

3D-Cryo-Elektronenmikroskopie des 4x6-H��mocyanins der Vogelspinne Eurypelma californicum unter Oxy- und Deoxybedingungen

Arthropodenh��mocyanine und Molluskenh��mocyanine, die extrazellul��ren Atmungsproteine der Arthropoden und Mollusken, unterscheiden sich grunds��tzlich im Aufbau, besitzen aber ��hnliche aktive Zentren, welche in ihrer oxydierten Form f��r die Blauf��rbung der H��mocyanine verantwortlich sind. Sauerstoff wird im Bindungszentrum zwischen zwei, von sechs Histidinen ligandierten, Kupfer(I)Ionen gebunden. Arthropodenh��mocyanine bauen sich artspezifisch aus 1, 2, 4, 6, oder 8 Hexameren mit D3-Symmetrie auf. Die Untereinheiten von je ca. 75 kDa falten sich in drei Dom��nen unterschiedlicher Funktionen. Der komplexe, hierarchische Zusammenbau der Arthropodenh��mocyanine h��ngt von der Heterogenit��t der Untereinheiten ab. Die 7 verschieden Sequenzen des 4x6-H��mocyanins von Eurypelma californicum (EcHc) sind biochemisch in der Quart��rstruktur lokalisiert. Bislang fehlte noch ein unabh��ngig erstelltes 3D-Modell der geometrischen Gesamtstruktur welche die hexamere und monomere Topographie eindeutig zeigt. Dessen Erstellung war Gegenstand dieser Arbeit, in Verbindung mit der Zielsetzung, die 3D-Rekonstruktion in den beiden extremen physiologischen Zust��nden, mit und ohne gebundenen Sauerstoff, zu erzeugen. Dazu wurden in einer eigens entwickelten Atmosph��ren-Pr��parationskammer die Proteine in L��sung schockgefrorenen und mittels Cryo-3D-Elektronenmikroskopie gemessen. Aus den daraus gewonnen Projektionsbildern lie��en sich mit der ���Single Particle Analyse��� die 3D-Informationen zur��ckberechnen. Die 3D-Rekonstruktionen wurden mit der publizierten R��ntgenkristallstruktur des hexameren Referenz-H��mocyanins der Languste Panulirus interruptus verifiziert. Die Rekonstruktionen erlaubten die eindeutige Messung diverser in der Literatur diskutierter Parameter der Architektur des 4x6-EcHc und dar��ber hinaus weiterer geometrischer Parameter, welche hier erstmals ver��ffentlicht werden. SAXS-Daten sagen extreme Translationen und Rotationen von Teilquart��rstrukturen zwischen oxy- und deoxy-EcHc voraus, was von den 3D-Rekonstruktionen der beiden Zust��nde nicht best��tigt werden konnte: Die 16 �� Rekonstruktion der Deoxyform weicht geometrisch nicht von der 21 �� Rekonstruktion der Oxyform ab. Die Einpassung der publizierten R��ntgenstruktur der Untereinheit II des H��mocyanin des Pfeilschwanzkrebses Limulus polyphemus in die Rekonstruktionen unterst��tzt eine auf der hexameren Hierarchieebene lokalisierte Dynamik der Oxygenierung. Mittels Einpassung modellierter molekularer Strukturen der EcHc-Sequenzen konnte eine erste Vermutung zur Lokalisation der beiden zentralen Linker-Untereinheiten b und c des 4x6-Molek��ls gemacht werden: Demnach w��rde Untereinheit b in den exponierten Hexameren des Molek��ls liegen. Aussagen ��ber die Quart��rstrukturbindungen auf molekularer Ebene aufgrund der Einpassung modellierter molekularer Daten in die Rekonstruktionen sind als spekulativ einzustufen: a) Die Aufl��sung der Rekonstruktion ist verbesserungsw��rdig. b) Es gibt keine ad��quate Vorlage f��r eine verl��ssliche Strukturvorhersage; die verschiedenen EcHc-Sequenzen liegen nur als Modellierung vor. c) Es w��re eine flexible Einpassung notwendig, um Ungenauigkeiten in den modellierten Strukturen durch Sekund��rstrukturanpassung zu minimieren.

Molecular phylogenetic inferences on the position of the Mollusca within the Lophotrochozoa

Die phylogenetische Position der Mollusken innerhalb der Trochozoa sowie die interne Evolution der Klassen der Mollusca sind weitgehend unbekannt und wurden in meiner Arbeit anhand molekularer Merkmale untersucht. Phylogenomische Analysen zeigten in der Vergangenheit eine gute Aufl��sung f��r urspr��ngliche Speziationsereignisse. Daher wurden hier drei neue EST Datens��tze generiert: f��r Sipunculus nudus (Sipuncula), Barentsia elongata (Kamptozoa) und Lepidochitona cinerea, (Polyplacophora, Mollusca). Zus��tzlich wurden gezielt Gene verschiedener Mollusken mittels RT-PCR amplifiziert. rnSowohl Kamptozoen als auch Sipunculiden wurden aufgrund morphologischer Kriterien bisher als m��gliche Schwestergruppe der Mollusken gehandelt, aber die hier erzielten Ergebnisse zur Evolution der H��merythrine, Gen-Anordnungen der mitochondrialen Genome und phylogenetische Analysen der ribosomalen und der mitochondriellen Proteine st��tzen diese Hypothese nicht. Die Position der Kamptozoa erwies sich hier generell als unbest��ndig; phylogenomische Analysen deuten eine N��he zu den Bryozoen an, aber diese Position wird stark durch die Auswahl der Taxa beeinflusst. Dagegen weisen meine Analysen klar auf eine n��here Beziehung zwischen Annelida und Sipuncula hin. Die ribosomalen Proteine zeigen Sipuncula (und Echiura) sogar als Subtaxa der Anneliden. Wie den Mollusken fehlt den Sipunculiden jegliche Segmentierung und meine Ergebnisse legen hier die M��glichkeit des Verlusts dieses Merkmals innerhalb der Anneliden bei den Sipunculiden nahe. Innerhalb der Mollusken wurden die Solenogastren bereits als Schwestergruppe aller rezenten Mollusken vorgeschlagen. Im Rahmen meiner Arbeit wurden von drei verschiedenen Solenogastren-Arten die ersten zuverl��ssigen 18S rRNA-Sequenzen ermittelt, und es zeigte sich, dass alle bisher ver��ffentlichten 18S-Sequenzen dieser Molluskenklasse h��chst unvollst��ndig oder fehlerhaft sind. rnRibosomale Proteine sind gute phylogenetische Marker und hier wurden die Auswahl und Anzahl dieser Gene f��r phylogenetische Analysen optimiert. ��ber Sonden-basierte Detektion wurde eine sampling-Strategie getestet, die im Vergleich mit standard-phylogenomischen Ans��tzen zuk��nftige molekulare Stammbaumrekonstruktionen mit gr����erem Taxonsampling erm��glicht.rn

3D-Strukturanalyse von Molluskenh��mocyaninen aus elektronenmikroskopischen Bildern

Diese Arbeit pr��sentiert die bislang h��chst aufgel��sten KryoEM-Strukturen f��r ein Cephalopoden h��mocyanin Dekamer (Nautilus pompilus H��mocyanin, NpH) und ein Gastropoden H��mocyanin Didekamer (keyhole limpet hemocyanin isoform 1). Durch die Methoden des ���molecular modelling��� und ���rigid-body-fiting��� wurde auch eine detaillierte Beschreibung beider Strukturen auf atomarem Niveau erstmalig m��glich. H��mocyanine sind kupferhaltige Sauerstoff-Transportproteine die frei gel��st in Blut zahlreicher Arthropoden und Mollusken vorkommen. Allgemein sind Molluskenh��mocyanine als Dekamere (Hohlzylinder aus 5 Untereinheiten-dimere) oder Didecamere (Zusammenlagerung von zwei Dekameren) zu finden. Durch Anlagerung weiterer Dekamere bilden sich teilweise tubul��re Multidekamere. H��mocyanine der Cephalopoden bestehen ausschlie��lich aus solit��ren Decameren. In Octopus und Nautilus bestehen die 10 Untereinheiten aus 7 funktionellen Einheiten(FU-a bis FU-g), wobei jede FU ein Sauerstoffmolek��l binden kann. FUs a-f bilden die Wand des ringf��rmigen Molek��ls und 10 Kopien der FU-g bilden einen sogenannten ���inneren Kragenkomplex���. Das im Rahmen dieser Arbeit erstelltes molekulares Modell von NpH kl��rt die Struktur des Dekamers vollst��ndig auf. Wir waren zum ersten Mal in der Lage das Untereinheiten-dimer, den Verlauf der Polypeptidkette und 15 unterschiedliche Kontaktstellen zwischen FUs zu identifizieren. Viele der inter-FU-Kontakte weisen Aminos��urenkonstellationen auf, die die Basis f��r die ��bertragung allosterischer Wechselwirkungen zwischen FUs darstellen k��nnten und Hinweise f��r den Aufbau der allosterische Einheit geben. Potentielle Bindungsstellen f��r N-glykosidische Zucker und bivalente Kationen wurden auch identifiziert. Im Gegensatz zu NpH, kommen Gastropoden H��mocyanine (inkl. KLH) haupts��chlich als Didekamere vor und der Kragenkomplex wird in diesem Fall aus 2 FUs gebildet (Fu-g und FU-h). Die zus��tzliche C'-terminale FU-h zeichnet sich durch eine spezielle Verl��ngerung von ~ 100 Aminos��uren aus. KLH stammt aus der kalifornische Schnecke Megathura crenulata und kommt seit mehreren Jahrzehnten als Immunostimulator in der immunologischen Grundlagenforschung und klinischen Anwendung zum Einsatz. KLH weist zwei Isoformen auf, KLH1 und KLH2. Das vorliegende Modell von KLH1 erlaubt die komplexe Architektur dieses riesigen Proteins in allen Details zu verstehen, sowie einen Vergleich zum dem NpH Dekamer auf atomare Ebene. Es wurde gefunden, dass das Untereinheitensegment a-b-c-d-e-f-g, sowie die equivalenten Kontaktstellen zwichen FUs stark konserviert sind. Dies deutet darauf hin, dass in Bezug auf die ��bertragung allosterische Signale zwischen benachbarten FUs, grundlegende Mechanismen in beiden Molek��len beibehalten wurden. Weiterhin, konnten die Verbindungen zwischen den zwei Dekameren ertsmalig identifiziert werden. Schlie��lich, wurde die Topologie der N-glycosidischen Zucker, welche f��r die immunologische Eigenschaften von KLH1 von gro��er Bedeutung sind, auch aufgekl��rt. Somit leistet die vorliegende Arbeit einen wesentlichen Schritt zum Verst��ndnis der Quart��rstruktur und Funktion der Molluskenh��mocyanine.rn

Entwicklung eines immunologischen Testsystems zur Detektion des marinen Biotoxins Domoins��ure

Domoins��ure ist ein von mehreren Arten mariner Kieselalgen der Gattung Pseudonitzschia produziertes Toxin, welches w��hrend einer Algenbl��te in Molluscen wie z.B. der Miesmuschel Mytilus sp. akkumuliert werden kann. Beim Verzehr solch kontaminierter Muscheln k��nnen sowohl beim Menschen als auch bei Tieren erhebliche Vergiftungserscheinungen auftreten, die von ��belkeit, Kopfschmerzen und Orientierungsst��rungen bis hin zum Verlust des Kurzzeitged��chtnisses (daher auch als amnesic shellfish poisoning bekannt) reichen und in einigen F��llen t��dlich enden. rnDie heute g��ngigen Methoden zur Detektion von Domoins��ure in Muschelgewebe wie Fl��ssigkeitschromatographie und Maus-Bioassay sind zeit- und kostenintensiv bzw. in Anbetracht einer Verbesserung des Tierschutzes aus ethischer Sicht nicht zu vertreten. Immunologische Testsysteme stellen eine erstrebenswerte Alternative dar, da sie sich durch eine vergleichsweise einfache Handhabung, hohe Selektivit��t und Reproduzierbarkeit auszeichnen.rnDas Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein solches immunologisches Testsystem zur Detektion von Domoins��ure zu entwickeln. Hierf��r wurden zun��chst Antik��rper gegen Domoins��ure gewonnen, wof��r das Toxin wiederum als erstes ��ber die Carbodiimid-Methode an das Tr��gerprotein keyhole limpet hemocyanin (KLH) gekoppelt wurde, um eine Immunantwort ausl��sen zu k��nnen. Kaninchen und M��use wurden mit KLH-DO-Konjugaten nach vorgegebenen Immunisierungsschemata immunisiert. Nach vier Blutabnahmen zeigte das polyklonale Kaninchenantiserum eine ausreichend hohe Sensitivit��t zum Antigen; das nachfolgende Detektionssystem wurde mit Hilfe dieses polyklonalen Antik��rpers aufgebaut. Zwar ist es gegen Ende der Arbeit auch gelungen, einen spezifischen monoklonalen Antik��rper aus der Maus zu gewinnen, jedoch konnte dieser aus zeitlichen Gr��nden nicht mehr im Detektionssystem etabliert werden, was durchaus w��nschenswert gewesen w��re. rnWeiterhin wurde Domoins��ure im Zuge der Entwicklung eines neuartigen Testsystems an die Tr��gerproteine Ovalbumin, Trypsininhibitor und Casein sowie an Biotin konjugiert. Die Kopplungserfolge wurden im ELISA, Western Blot bzw. Dot Blot nachgewiesen. Die Ovalbumin-gekoppelte sowie die biotinylierte Domoins��ure dienten im Folgenden als die zu messenden Gr����en in den Detektionsassays- die in einer zu untersuchenden Probe vorhandende, kompetitierende Domoins��ure wurde somit indirekt nachgewiesen. rnDer zul��ssige H��chstwert f��r Domoins��ure liegt bei 20 ��g/g Muschelgewebe. Sowohl mit Biotin-DO als auch mit OVA-DO als den zu messenden Gr����en waren Domoins��urekonzentrationen unterhalb dieses Grenzwertes nachweisbar; allerdings erwies sich der Aufbau mit Biotin-DO um das ca. 20-fache empfindlicher als jener mit OVA-DO. rnDie in dieser Arbeit pr��sentierten Ergebnisse k��nnten als Grundlage zur Etablierung eines kommerzialisierbaren immunologischen Testsystems zur Detektion von Domoins��ure und anderen Biotoxinen dienen. Nach erfolgreicher Validierung w��re ein solches Testsystem in seiner Handhabung einfacher als die g��ngige Fl��ssigkeitschromatographie und besser reproduzierbar als der Maus-Bioassay.rn

Molekularbiologische Charakterisierung der beiden Untereinheiten des Mega-H��mocyanins der Schnecke Melanoides tuberculata

Bei dem 2010 von unserer Arbeitsgruppe entdeckten Mega-H��mocyanin handelt es sich um einen stark abgewandelten Typ des respiratorischen Proteins H��mocyanin, bestehend aus zwei flankierenden regul��ren Dekameren und einem zentralen Mega-Dekamer. Diese sind aus zwei immunologisch verschiedenen Untereinheiten mit ~400 bzw. ~550 kDa aufgebaut, die in unserer Arbeitsgruppe bereits proteinbiochemisch charakterisiert wurden. Im Zuge dieser Untersuchungen konnte zudem eine 3D-Rekonstruktion des Oligomers (13,5 MDa) mit einer Aufl��sung von 13�� erstellt werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Aufkl��rung der Prim��rstruktur beider Polypeptide bei der Schnecke Melanoides tuberculata (MtH). Es gelang, die cDNAs der beiden Untereinheiten vollst��ndig zu sequenzieren. Die zu typischen Dekameren assemblierende MtH400-Untereinheit umfasst 3445 Aminos��uren und besitzt eine theoretische Molekularmasse von 390 kDa. Nach dem Signalpeptid von 23 Aminos��uren L��nge folgen die f��r Gastropoden-H��mocyanine typischen funktionellen Einheiten FU-a bis FU-h. Insgesamt verf��gt die MtH400-Untereinheit ��ber sechs potentielle N-Glykosylierungsstellen. Die MtH550-Untereinheit, welche mit 10 Kopien das Mega-Dekamer bildet, umfasst 4999 Aminos��uren und besitzt eine theoretische Molekularmasse von 567 kDa. Damit handelt es sich bei dieser Untereinheit um die zweitgr����te jemals bei einem Protein detektierte Polypeptidkette. Die MtH550-Untereinheit besteht aus einem Signalpeptid von 20 Aminos��uren L��nge und den typischen Wand-FUs (FU-a bis FU-f). Daran anschlie��end folgen sechs weitere Varianten der FU-f (FU-f1 bis FU-f6). Die MtH550-Untereinheit verf��gt ��ber insgesamt zw��lf potentielle N-Glykosylierungsstellen. Anhand der ermittelten Prim��rstrukturdaten wird klar, dass der auff��llig vergr����erte Kragenbereich des Mega-Dekamers aus je 10 Kopien der FU-f1 bis FU-f6 besteht. Die ermittelten Sequenzdaten der beiden MtH-Untereinheiten weisen im Vergleich zu anderen H��mocyanin Sequenzen einige sehr charakteristische Indels sowie un��bliche N-Glykosylierungsstellen auf. Es war zudem m��glich, anhand einer molekularen Uhr den Entstehungszeitpunkt des Mega-H��mocyanins zu datieren (145 �� 35 MYA). Sowohl die Topologie als auch die berechneten Trennungszeitpunkte des an allen Verzweigungen gut unterst��tzten Stammbaums stimmen mit den bisher publizierten und auf H��mocyanindaten basierenden molekularen Uhren ��berein.

Charakterisierung und Expression zweier multimerer H��molympheproteine der Schnecke Biomphalaria glabrata

Die tropische S��sswasserschnecke Biomphalaria glabrata geh��rt zu der Familie der Planorbidae, welche als einziges Taxon der Gastropoden H��moglobin als Sauerstofftransportprotein verwenden. Als Zwischenwirt des Bilharzioseerregers Schistosoma mansoni ist B. glabrata von tropenmedizinischer Interesse. Das extrazellul��re BgHb zeigt sich mit einem Anteil von 95% als Hauptprotein in der H��molymphe. Dieses setzt sich aus Polypeptidketten mit je 240kDa zusammen. Diese wiederrum lassen sich in 13-H��m-Dom��nen und eine deutlich kleinere N-terminalen nicht H��m-Dom��ne untergliedern. Die Sequenzierung von zwei der drei Untereinheiten des BgHb (BgHb1, BgHb2) erm��glichte die rekombinante Expression ganzer Untereinheiten in Insektenzellen, und die Expression einiger BgHb2-Konstrukte in E. coli Zellen. Im Rahmen meiner Arbeit gelang es, BgHb1 in biologisch aktiver Form in Insektenzellen zu exprimieren. Das aus dem ��berstand der Insektenzellen aufgereinigte rekombinante BgHb1 zeigte eine immunologische Identit��t mit nativen BgHb. Strukturelle Analysen belegten zudem die Assemblierung des rekombinanten BgHb1 zu einer dem nativen Protein gleichenden Quart��rstruktur. Demnach konnte in meiner Arbeit der Nachweis erbracht werden, dass eine einzelne Isoform in der Lage ist, zur Quart��rstruktur zu assemblieren. Zus��tzlich ergaben Sauerstoffbindungsanalysen, dass das rekombinante BgHb1 reversibel Sauerstoff binden kann.rnIn den restlichen 5% der B. glabrata H��molymphe zeigt sich ein rudiment��res H��mocyanin, welches f��r den Sauerstofftransport keine Rolle zu spielen scheint, und ein rosettenf��rmiges Protein, das es aufzukl��ren galt. Durch massenspektrometrische Analysen erhaltene Peptidfragmente zeigten eine hohe Sequenz��hnlichkeit zu den l��slichen Acetylcholin -Bindeproteinen anderer Mollusken. Diese AChBP zeigen eine hohe Sequenz��hnlichkeit zur Ligandenbindedom��ne von Rezeptoren der Cys-Loop-Proteinfamilie.rnDatenbankrecherchen deckten die Existenz zweier Isoformen auf

3D-ultrastructure, functions and stress responses of rhogocytes from the freshwater gastropods Biomphalaria glabrata and Lymnaea stagnalis

Rhogocytes, also termed ���pore cells���, exist free in the hemolymph or embedded in the connective tissue of different body parts of molluscs, notably gastropods. These unique cells can be round, elongated or irregularly shaped, and up to 30 ��m in diameter. Their hallmark is the so-called slit apparatus: i.e. pocket-like invaginations of the plasma membrane creating extracellular lacunae, bridged by cytoplasmic bars. These bars form distinctive slits of ca. 20 nm width. A slit diaphragm composed of proteins establishes a molecular sieve with holes of 20 x 20 nm. Different functions have been assigned to this special molluscan cell type, notably biosynthesis of the hemolymph respiratory protein hemocyanin. It has further been proposed, but not proven, that in the case of red-blooded snail species rhogocytes might synthesize the hemoglobin. However, the secretion pathway of these hemolymph proteins, and the functional role of the enigmatic slit apparatus remained unclear. Additionally proposed functions of rhogocytes, such as heavy metal detoxification or hemolymph protein degradation, are also not well studied. This work provides more detailed electron microscopical, histological and immunobiochemical information on the structure and function of rhogocytes of the freshwater snails Biomphalaria glabrata and Lymnaea stagnalis. By in situ hybridization on mantle tissues, it proves that B. glabrata rhogocytes synthesize hemoglobin and L. stagnalis rhogocytes synthesize hemocyanin. Hemocyanin is present, in endoplasmic reticulum lacunae and in vesicles, as individual molecules or pseudo-crystalline arrays. The first 3D reconstructions of rhogocytes are provided by means of electron tomography and show unprecedented details of the slit apparatus. A highly dense material in the cytoplasmic bars close to the diaphragmatic slits was shown, by immunogold labeling, to contain actin. By immunofluorescence microscopy, the protein nephrin was localized at the periphery of rhogocytes. The presence of both proteins in the slit apparatus supports the previous hypothesis, hitherto solely based on similarities of the ultrastructure, that the molluscan rhogocytes are phylogenetically related to mammalian podocytes and insect nephrocytes. A possible secretion pathway of respiratory proteins that includes a transfer mechanism of vesicles through the diaphragmatic slits is proposed and discussed. We also studied, by electron microscopy, the reaction of rhogocytes in situ to two forms of animal stress: deprivation of food and cadmium contamination of the tank water. Significant cellular reactions to both stressors were observed and documented. Notably, the slit apparatus surface and the number of electron-dense cytoplasmic vesicles increased in response to cadmium stress. Food deprivation led to an increase in hemocyanin production. These observations are also discussed in the framework of using such animals as potential environmental biomarkers.

Zur Karbonatsedimentologie, Biofazies und sequenzstratigraphischen Architektur eines fossilen Hochenergie-Schelfs aus dem Neogen der Algarve (Mioz��n, S��dportugal)

Die neogene Lagos-Portim��o Formation (Unter- bis Mittelmioz��n) bildet einen Teil der Steilk��ste der Algarve (S-Portugal) und besteht aus einer zyklischen Wechsellagerung von Karbonaten und Sand-steinen. Die vorliegende Arbeit bietet ein Modell zur sedimentologischen, faziellen und stratigraphischen Entwicklung dieser Einheit an. Basierend auf Profilen entlang der gesamten lateralen Erstreckung der Einheit wurden verschiedene Gel��nde- und Labormethoden angewandt, um ein Modell entwickeln zu k��nnen. Messungen des Sr87/86-Isotopenverh��ltnisses sollten Klarheit bez��glich der stratigraphischen Position bringen. Die laterale Korrelation der Profile erfolgte ��ber lithologische und fazielle Ansprachen. Unterst��tzend wurden einzelne Profile mit einem tragbaren Gammaray-Spektrometer gemessen. Es wurden vier Leithorizonte etabliert, die sich durch fazielle Merkmale und spezielle Fossilf��hrung defi-nieren lassen. Die Mikrofazies wurde qualitativ und quantitativ analysiert. Als statistisches Verfahren wurde unter anderem eine hierarchische Clusteranalyse durchgef��hrt, ��ber welche f��nf Biofaziestypen des warm-temperierten Klimabereichs unterschieden werden. Die Fossilf��hrung wird von Mollusken, Bryozoen und Rotalgen dominiert. Ausnahmen bilden stratigraphisch isolierte Vorkommen von kolo-nialen Korallen, die jedoch keine Riffk��rper aufbauen. Die Ergebnisse aller zuvor erw��hnten Untersuchungen deuten auf Ablagerungen eines nicht-tropischen Hochenergie-Schelfs hin. Sediment��re Zyklen sind oftmals unvollst��ndig, es treten Hartgr��nde und Auf-arbeitungs- bzw- Kondesationshorizonte auf. Die geochemische Altersdatierung weist Altersspr��nge und -inversionen auf. Ein Vergleich mit dem SW-australischen Schelf und dem von James et al. (1994) eingef��hrten Modell des shaved shelf bietet sich aufgrund der ��hnlichkeit der Sedimentgesteine und des ozeanographischen Settings an. Weiterhin werden zeitgleiche bzw. faziell ��hnliche Becken vergleichend diskutiert. Das Sedimentationsgeschehen der Lagos-Portim��o Formation wird ma��geblich durch eine halokinetisch bedingte unregelm����ige Subsidenz und Hebung beeinflu��t. Der Salzdom von Albufeira war w��hrend der Sedimentation der Einheit mehrfach in Bewegung. Rutschungspakete, Entlastungsspalten und Sanddikes zeugen davon. Die sequenzstratigraphische Interpretation bietet einen neuen Ansatz, in dem sie von Hochstand-Sandsteinen und Tiefstand-Karbonaten ausgeht.