Direct electron transfer to cytochrome c oxidase investigated by electrochemistry and time-resolved surface-enhanced infrared absorption spectroscopy

Cytochrom c Oxidase (CcO), der Komplex IV der Atmungskette, ist eine der Häm-Kupfer enthaltenden Oxidasen und hat eine wichtige Funktion im Zellmetabolismus. Das Enzym enthält vier prosthetische Gruppen und befindet sich in der inneren Membran von Mitochondrien und in der Zellmembran einiger aerober Bakterien. Die CcO katalysiert den Elektronentransfer (ET) von Cytochrom c zu O2, wobei die eigentliche Reaktion am binuklearen Zentrum (CuB-Häm a3) erfolgt. Bei der Reduktion von O2 zu zwei H2O werden vier Protonen verbraucht. Zudem werden vier Protonen über die Membran transportiert, wodurch eine elektrochemische Potentialdifferenz dieser Ionen zwischen Matrix und Intermembranphase entsteht. Trotz ihrer Wichtigkeit sind Membranproteine wie die CcO noch wenig untersucht, weshalb auch der Mechanismus der Atmungskette noch nicht vollständig aufgeklärt ist. Das Ziel dieser Arbeit ist, einen Beitrag zum Verständnis der Funktion der CcO zu leisten. Hierzu wurde die CcO aus Rhodobacter sphaeroides über einen His-Anker, der am C-Terminus der Untereinheit II angebracht wurde, an eine funktionalisierte Metallelektrode in definierter Orientierung gebunden. Der erste Elektronenakzeptor, das CuA, liegt dabei am nächsten zur Metalloberfläche. Dann wurde eine Doppelschicht aus Lipiden insitu zwischen die gebundenen Proteine eingefügt, was zur sog. proteingebundenen Lipid-Doppelschicht Membran (ptBLM) führt. Dabei musste die optimale Oberflächenkonzentration der gebundenen Proteine herausgefunden werden. Elektrochemische Impedanzspektroskopie(EIS), Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) und zyklische Voltammetrie (CV) wurden angewandt um die Aktivität der CcO als Funktion der Packungsdichte zu charakterisieren. Der Hauptteil der Arbeit betrifft die Untersuchung des direkten ET zur CcO unter anaeroben Bedingungen. Die Kombination aus zeitaufgelöster oberflächenverstärkter Infrarot-Absorptionsspektroskopie (tr-SEIRAS) und Elektrochemie hat sich dafür als besonders geeignet erwiesen. In einer ersten Studie wurde der ET mit Hilfe von fast scan CV untersucht, wobei CVs von nicht-aktivierter sowie aktivierter CcO mit verschiedenen Vorschubgeschwindigkeiten gemessen wurden. Die aktivierte Form wurde nach dem katalytischen Umsatz des Proteins in Anwesenheit von O2 erhalten. Ein vier-ET-modell wurde entwickelt um die CVs zu analysieren. Die Methode erlaubt zwischen dem Mechanismus des sequentiellen und des unabhängigen ET zu den vier Zentren CuA, Häm a, Häm a3 und CuB zu unterscheiden. Zudem lassen sich die Standardredoxpotentiale und die kinetischen Koeffizienten des ET bestimmen. In einer zweiten Studie wurde tr-SEIRAS im step scan Modus angewandt. Dafür wurden Rechteckpulse an die CcO angelegt und SEIRAS im ART-Modus verwendet um Spektren bei definierten Zeitscheiben aufzunehmen. Aus diesen Spektren wurden einzelne Banden isoliert, die Veränderungen von Vibrationsmoden der Aminosäuren und Peptidgruppen in Abhängigkeit des Redoxzustands der Zentren zeigen. Aufgrund von Zuordnungen aus der Literatur, die durch potentiometrische Titration der CcO ermittelt wurden, konnten die Banden versuchsweise den Redoxzentren zugeordnet werden. Die Bandenflächen gegen die Zeit aufgetragen geben dann die Redox-Kinetik der Zentren wieder und wurden wiederum mit dem vier-ET-Modell ausgewertet. Die Ergebnisse beider Studien erlauben die Schlussfolgerung, dass der ET zur CcO in einer ptBLM mit größter Wahrscheinlichkeit dem sequentiellen Mechanismus folgt, was dem natürlichen ET von Cytochrom c zur CcO entspricht.

Novel porphyrin amino acids as building blocks for artificial photosynthetic reaction centers : photoinduced energy and electron transfer

This thesis reports on the synthesis and characterisation of trans-(M)AB2C meso-substituted porphyrin amino acid esters (PAr) (M = 2H or Zn) with tunable electron donating and electron withdrawing Ar substituents at B positions (Ar = 4-C6H4OnBu, 4-C6H4OMe, 2,4,6-C6H2Me3, 4-C6H4Me, C6H5, 4-C6H4F, 4-C6H4CF3, C6F5). These porphyrins were used as key building blocks for photosynthetic LHC (LHC = light-harvesting antenna complex) and RC (RC = reaction center) model compounds.rnBased on free-base or zinc(II) porphyrin amino acid esters and porphyrin acids several amide linked free-base bis(porphyrins) PAr1-PAr2 (Ar1 = 2,4,6-C6H2Me3, C6F5 and Ar2 = 2,4,6-C6H2Me3, 4-C6H4F, 4-C6H4CF3, C6F5), mono metallated bis(porphyrin) PAr1-(Zn)PAr2 (Ar1 = 2,4,6-C6H2Me3 and Ar2 =4-C6H4F) and its doubly zincated complexes (Zn)PAr1-(Zn)PAr2 were prepared. In the fluorescence spectra of free-base bis(porphyrins) the porphyrin with the strongest electron donating power of Ar substituents at B positions is the light emitting unity. The emission of mono metallated bis(porphyrin) occurs only from the free-base porphyrin building block. This phenomenon is caused by an efficient energy transfer likely via the Dexter through-bond mechanism.rnLinking of anthraquinone (Q) as electron acceptor (A) to the N-terminus of porphyrin amino acid esters ((M)PAr) and aminoferrocene (Fc) as electron donor (D) to the C-terminus of the porphyrin resulting in Q-(M)PAr-Fc triads (M = 2H or Zn, Ar = 4-C6H4OnBu, 4-C6H4OMe, 2,4,6-C6H2Me3, 4-C6H4Me, C6H5, 4-C6H4F, 4-C6H4CF3, C6F5) with tunable electron density at the porphyrin chromophore. In these triads initial oxidative PET (Q←(M)PAr) and reductive PET ((M)PAr→Fc) (PET = photoinduced electron transfer) are possible. Both processes leads to an emission quenching of (M)PAr. The efficiency of the PET pathways occurring in the Marcus normal region is controlled by the specific porphyrin electron density.rnAmide-linked conjugates PAr-Fc (Ar = 2,4,6-C6H2Me3, C6F5) and Fmoc-Fc-PAr1 (N-Fmoc-Fc = N-Fmoc protected 1,1’-ferrocene amino acid; Ar1 = C6H5, 4-C6H4F, 4-C6H4CF3, C6F5) as well as hinges PAr2-Fc-PAr1 (Ar1 = C6H5, 4-C6H4F and Ar2 = 2,4,6-C6H2Me3) were studied with respect to the reductive PET. The PET driving force (−GET) in dyads increases with the increasing electron withdrawing character of Ar substituents. Additionally, intramolecular energy transfer between porphyrins PAr1 and PAr2 is feasible in the hinges via the Förster mechanism.rn

Untersuchungen zum Mechanismus der zellulären und zellfreien DNA-Schädigung durch photosensibilisierende Arzneistoffe

Einige Arzneistoffe verursachen unter dem Einfluss von Sonnenlichtstrahlung folgenschwere Hautveränderungen. In der Arbeit wurden für sechs Photosensibilisatoren erstmals „Fingerabdrücke“ des zellfreien und zellulären photoinduzierten DNA Schadens in Form von Schadensprofilen erstellt. Untersucht wurden das Phenothiazin Chlorpromazin, sowie dessen Derivate 2-Hydroxypromazin, Chlorpromazinsulfoxid und Promazin; die Fluorchinolone Ciprofloxacin und Lomefloxacin; sowie Doxycyclin und Methylenblau unter Bestrahlung mit künstlich erzeugtem Sonnenlicht. Neben Strangbrüchen in der DNA konnten durch den Einsatz von spezifischen DNA-Reparaturendonukleasen als Sonden die Mengen an oxidativen Purinmodifikationen, oxidative Pyrimidinmodifikationen und abasische Stellen bestimmt werden. Durch Verwendung von modulierenden Zusätzen wurde die Beteiligung von reaktiven Sauerstoffspezies überprüft. Besonders bei den Phenothiazinen zeigten sich Besonderheiten hinsichtlich der DNA-Schädigung. Promazin induziert unter Photoaktivierung, vermutlich über einen reduktiven Angriff an der DNA, eine hohe Anzahl sonst selten beobachteter Läsionen, nämlich abasischen Stellen und Dihydropyrimidine. Photoaktiviertes Chlorpromazin konnte in Zellen unerwarteterweise wahrscheinlich über die Reaktion von Photolyseprodukten mit einem endogenen Chromophor sonnenlichtinduzierte oxidative DNA-Modifikationen verhindern. Eine Schädigung zellfreier DNA fand nur statt, wenn der Photosensibilisator im Überschuss gegenüber den DNA-Basenpaaren vorlag, vermutlich weil ansonsten die Photolyse des Chlorpromazins durch Interkalation in die DNA verhindert wurde. Fluorchinolone zeigten eine starke Generierung von DNA-Strangbrüchen in Zellen, welche möglicherweise auf photoinduzierte Reaktionen der Arzneistoffe mit der eukaryotischen Topoisomerase zurückzuführen ist. Die Korrelation der gemessenen DNA-Schäden mit der Mikrokerninduktion führte zu der Annahme, dass besonders abasische Stellen bei der Entstehung von Mikrokernen eine Rolle spielen könnten.

Time-resolved surface enhanced resonance Raman spectro-electrochemistry of heme proteins

The membrane protein Cytochrome c Oxidase (CcO) is one of the most important functional bio-molecules. It appears in almost every eukaryotic cell and many bacteria. Although the different species differ in the number of subunits, the functional differences are merely marginal. CcO is the terminal link in the electron transfer pathway of the mitochondrial respiratory chain. Electrons transferred to the catalytic center of the enzyme conduce to the reduction of molecular oxygen to water. Oxygen reduction is coupled to the pumping of protons into the inter-membrane space and hence generates a difference in electrochemical potential of protons across the inner mitochondrial membrane. This potential difference drives the synthesis of adenosine triphosphate (ATP), which is the universal energy carrier within all biological cells. rnrnThe goal of the present work is to contribute to a better understanding of the functional mechanism of CcO by using time-resolved surface enhanced resonance Raman spectroscopy (TR-SERRS). Despite intensive research effort within the last decades, the functional mechanism of CcO is still subject to controversial discussions. It was the primary goal of this dissertation to initiate electron transfer to the redox centers CuA, heme a, heme a3 and CuB electrochemically and to observe the corresponding redox transitions in-situ with a focus on the two heme structures by using SERRS. A measuring cell was developed, which allowed combination of electrochemical excitation with Raman spectroscopy for the purpose of performing the accordant measurements. Cytochrome c was used as a benchmark system to test the new measuring cell and to prove the feasibility of appropriate Raman measurements. In contrast to CcO the heme protein cc contains only a single heme structure. Nevertheless, characteristic Raman bands of the hemes can be observed for both proteins.rnrnIn order to investigate CcO it was immobilized on top of a silver substrate and embedded into an artificial membrane. The catalytic activity of CcO and therefore the complete functional capability of the enzyme within the biomimetic membrane architecture was verified using cyclic voltammetry. Raman spectroscopy was performed using a special nano-structured silver surface, which was developed within the scope of the present work. This new substrate combined two fundamental properties. It facilitated the formation of a protein tethered bilayer lipid membrane (ptBLM) and it allowed obtaining Raman spectra with sufficient high signal-to-noise ratios.rnSpectro-electrochemical investigations showed that at open circuit potential the enzyme exists in a mixed-valence state, with heme a and and heme a3 in the reduced and oxidized state, respectively. This was considered as an intermediate state between the non-activated and the fully activated state of CcO. Time-resolved SERRS measurements revealed that a hampered electron transfer to the redox center heme a3 characterizes this intermediate state.rn

Atmospheric heterogeneous reactions of N 2 O 5 and NO 3 radicals with mineral dust particles

Die heterogenen Reaktionen von N2O5 bzw. NO3 auf mineralischen Staubpartikeln wurden untersucht, um deren Einfluss auf den Abbau atmosphärischer Stickoxide (NOx) sowie auf die chemische Veränderung der Staubpartikel während ihres Transportes durch die Atmosphäre besser verstehen zu können. Die experimentellen Studien wurden bei Atmosphärendruck, Raumtemperatur und unterschiedlichen relativen Luftfeuchten durchgeführt. Der Aufnahmekoeffizient γ(N2O5) von N2O5 auf dispergiertem Staub aus der Sahara wurde zu 0,020 ± 0,002 (1σ) bestimmt, unabhängig von der relativen Feuchte (0 - 67 %) sowie der N2O5-Konzentration (5x1011 - 3x1013 Moleküle cm-3).rnDie Analyse der Reaktionsprodukte in der Gasphase sowie auf der Partikeloberfläche führt zu der Annahme, dass N2O5 auf der Staubpartikeloberfläche zu Nitrat hydrolysiert wird. Es konnte kein Einfluss der relativen Feuchte auf den Aufnahmekoeffizienten ermittelt werden, was durch das vorhandene interlamellare Wasser, welches bis zu 10 % der Partikelmasse betragen kann, erklärbar ist. Der gemessene Wert des Aufnahmekoeffizienten ist unabhängig von der Eingangs-N2O5-Konzentration, was sich über die sehr große innere Oberfläche der Partikel erklären lässt. Dennoch ließ sich durch eine vorherige Konditionierung der Partikel mit gasförmigem HNO3, was eine Nitratanreicherung an der Oberfläche bewirkt, die Effizienz der N2O5-Aufnahme auf die Staubpartikel reduzieren. Zusätzliche Studien befassten sich mit der Bestimmung des Aufnahmekoeffizienten von N2O5 auf Illit-Partikeln und auf Teststaub aus Arizona. Bei einer relativen Luftfeuchte von 0 % wurden für γ(N2O5) Werte von 0,084 ± 0,019 (1σ) für Illit und von 0,010 ± 0,001 (1σ) für Arizona Teststaub ermittelt.rnUnter Anwendung einer neuartigen Messmethode, die auf der zeitgleichen Messung der Konzentrationsabnahme von NO3 und N2O5 relativ zueinander beruht, wurde das Verhältnis γ(NO3)/γ(N2O5) der Aufnahmekoeffizienten von NO3 und N2O5 auf Saharastaub zu 0,9 ± 0,4 (1σ) bestimmt. Dieser Wert war unabhängig von der relativen Feuchte, den NO3- und N2O5-Konzentrationen sowie der Reaktionszeit, obwohl eine Oberflächendeaktivierung für beide Spurenstoffe beobachtet wurde.