Zeitaufgelöste Fluoreszenzmessungen zur Faltung und Pigmentbindung des Lichtsammlerproteins LHC II aus Photosystem II

Zusammenfassung Der Lichtsammlerkomplex (LHCII) aus PhotosystemII hoeherer Pflanzen kann in vitro rekonstituiert werden. Es werden drei Reaktionszeiten (<10 s; <1 min; <10 min) aufgeloest. Dabei werden bei allen Reaktionszeiten Pigmente durch das Apoprotein gebunden. Chlorophylle (Chl a und Chl b) und Xanthophylle wirken limitierend auf die Rekonstitution. Chl a beschleunigt die zweite Reaktionszeit, ein ausgeglichenes Chl a/b-Verhaeltnis verkürzt die dritte Reaktionszeit. Ein molekularer Mechanismus als Interpretation dieser Effekte wird vorgeschlagen. Native Lipide verlaengern nichtspezifisch die Rekonstitution. Abiotische Faktoren haben einen spezifischen Einfluss auf die Rekonstitution. Spezifische Einfluesse der o. a. Bedingungen auf die thermische Stabilitaet des rekonstituierten LHCII wurden bestimmt.

Modellkomplexe zur Untersuchung der Radikal-Metall-Wechselwirkung innerhalb des wasseroxidierenden Zentrums im Photosystem II

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zweikernige Modellkomplexe zur Untersuchung der Radikal-Metallwechselwirkung innerhalb des wasseroxidierenden Zentrums des Photo¬systems II synthetisiert und eine magneto-strukturelle Korrelation dieser Komplexe erstellt. Als Liganden wurden diverse sechs- bis siebenzähnige Chelatliganden verwendet, welche über zwei Koordinationstaschen und eine verbrückende Phenolatgruppe verfügen. Zwei daran gebundene Manganionen liegen in einer wohl definierten Umgebung nicht koordinativ gesättigt vor. An die freien Koordinationsstellen können weitere ein bis zwei Brückenliganden binden, bei denen es sich in dieser Arbeit hauptsächlich um Carboxylate handelt. Durch die Verwendung eines diamagnetischen Brückenliganden konnte die magnetische Spin-Spin-Austauschwechselwirkung zwischen den spintragenden Manganionen über die verbrücken¬de Phenolatgruppe bestimmt werden. Komplexe, welche über Manganionen in den gleichen Oxidationsstufen, aber über unterschiedliche Carboxylatbrückenliganden verfügen, weisen ähnliche magnetische Austauschwechselwirkungen zwischen den Metallzentren auf. Diese Beobachtung konnte durch eine strukturelle Ähnlichkeit dieser Komplexe erklärt werden. Mittels Aufsummieren der Bindungslängen der verbrückenden Phenolateinheit zu beiden Zentralionen kann innerhalb dieser Komplexe jeweils die Länge des Wechselwirkungspfades erhalten werden, welcher die magnetische Austauschwechselwirkung maßgeblich beein¬flusst. Je länger der Wechselwirkungspfad ist, desto kleiner ist die Austausch¬wechsel¬wirkung. Durch Austausch der diamagnetischen Carboxylate durch paramagnetische benzoat¬substituierte Nitronyl Nitroxid Radikale wurden den Komplexen ein bis zwei weitere Spinzentren hinzugefügt, welche mit den Spins der Zentralionen wechselwirken können. Simulationen der magnetischen Suszeptibilitätsmessungen liefern Werte für die magneti¬schen Austausch¬wechselwirkungen zwischen den Nitronyl Nitroxid Radikalen und den Manganionen, die in allen Fällen schwach ferromagnetisch zwischen 0 und 4,7 cm-1 sind. In einer Auftragung dieser Austauschwechselwirkungen gegen die Mangan-Carboxylat-Bindungs¬längen von strukturell charakterisierten äquivalenten acetatverbrückten Komplexen, kann eine lineare Abhängigkeit gezeigt werden.

Die Biogenese von Chlorophyll-a/b-bindenden Lichtsammelkomplexen : Topographie des Apoproteins bei der Thylakoidinsertion

Die Biogenese von Chlorophyll-a/b-bindenden Lichtsammelkomplexen: Topographie des Apoproteins bei der Thylakoidinsertion Der wichtigste Chlorophyll a/b-bindende Lichtsammelkomplex höherer Pflanzen ist der an Photosystem II assoziierte LHCII. Die kerncodierten Apoproteine dieses Pigment-Protein Komplexes werden posttranslational in den Chloroplasten importiert und mit Hilfe des plastidären

Pigmentbindung verschiedener Mitglieder der erweiterten Chlorophyll a/b-Proteinfamilie und des wasserlöslichen Chlorophyll-Proteins WSCP

In dieser Arbeit wurde die Pigmentbindung verschiedener Pflanzenproteine untersucht, um daraus Rückschlüsse auf ihre Funktion zu ziehen. PsbS, die S-Untereinheit des Photosystems II, konnte mit Pigmenten isoliert werden. Es wurde kein Hinweis auf eine spezifische Wechselwirkung der Chromophore gefunden, Ergebnisse wie pigmentabhängig stärkere Helixbildung unterstützen jedoch die Vermutung, PsbS fungiere als transienter Pigmentcarrier. Die Sequenzverwandten OHP, Sep1 und Sep2 binden entweder keine Pigmente oder nur so schwach, dass eine Bindung mit den verwendeten Methoden nicht nachweisbar ist.WSCP aus Blumenkohl ist ein wasserlösliches chlorophyllbindendes Protein mit unbekannter Funktion. In dieser Arbeit wurde ein rekombinantes WSCP mit N-terminal angehängtem His-Tag hergestellt und überexprimiert. WSCP-his tetramerisiert pigmentabhängig und bindet Chlorophylle, nicht aber Carotinoide. In seinen biochemischen und spektroskopischen Eigenschaften gleicht das rekombinante dem nativen WSCP und kann als Werkzeug für Untersuchungen zur Funktion herangezogen werden. Rekonstitutionsexperimente mit Chlorophyll-Derivaten zeigten, dass der Phytolrest für die Oligomerisierung des Proteins verantwortlich ist. WSCP bindet außerdem die Chlorophyll-Vorstufen Chlorophyllid und Mg-Protoporphyrin IX. Es könnte sich um ein Carrierprotein handeln, welches die Vorstufen von der Chloroplastenhülle durch das Stroma zur Thylakoidmembran transportiert. Der Fall eines chlorophyllbindenden Pflanzenproteins ohne Carotinoide ist einmalig. Messungen zu Photostabilität und Singulettsauerstoffbildung zeigten, dass es dennoch gebundenes Chlorophyll vor photooxidativer Schädigung schützt.

Stabilisierung des pflanzlichen Lichtsammlers LHCIIb

LHCIIb, das Hauptlichtsammlerprotein des Photosystem II, ist eines der am besten untersuchten Membranproteine. Die Frage, wie die Struktur des Pigment-bindenden Proteins stabilisiert wird, konnte bisher allerdings noch nicht geklärt werden. Im Gegensatz zu anderen Membranproteinen sind im Falle des LHCIIb auch Bereiche außerhalb der Membran an der Stabilisierung beteiligt. Der Beitrag der luminalen Schleifendomäne zur Stabilisierung des LHCIIb wurde untersucht, indem Mutanten mit einzelnen Aminosäureaustauschen in diesem Bereich bezüglich ihrer Stabilität verglichen wurden. Die luminale Schleife trägt zur thermischen Stabilität des LHCIIb bei und stabilisiert den Pigment-Protein-Komplex in Gegenwart von SDS, wobei verschiedene Mutationen diese beiden Aspekte der Stabilisierung in unterschiedlichem Maße beeinflussen. Ein weiteres Ziel der Dissertation war die Entwicklung eines evolutiven Verfahrens zur Stabilitätsverbesserung des LHCIIb. Mithilfe eines geeigneten Selektionskriteriums sollten stabile Mutanten des LHCIIb aus einer Bibliothek von Zufallsmutanten selektiert werden. Dazu wurde das Lhcb1-Protein als Phage-Display exprimiert und auf der Bakteriophagenoberfläche rekonstituiert. Verschiedene Eigenschaften des Pigment-Protein-Komplexes wurden als mögliche Selektionskriterien in Betracht gezogen und getestet. Das Selektionsverfahren, stabile Mutanten durch proteolytische Degradation ungefalteter Proteine zu isolieren, erwies sich schließlich als erfolgreich.

Zeitaufgelöste Messung der Faltung und Pigmentbindung des Lichtsammlerproteins LHCIIb anhand verschiedener spektroskopischer Monitore

Über die Biogenese des Lichtsammelkomplexes des Photosystems II höherer Pflanzen (LHCII) in der Thylakoidmembran der Chloroplasten existieren wenige Daten. Deswegen soll die Aufklärung des Faltungsmechanismus in vitro anhand von zeitaufgelösten Messungen der Rückfaltung des Komplexes Rückschlüsse auf die Situation in vivo ermöglichen.Zur Beobachtung der Rückfaltung wurden Methoden der Fluoreszenz- und CD-Spektroskopie verwendet. Die Pigmentbindung und die Ausbildung von α-helikaler Sekundärstruktur erfolgt in einem schnelleren und einem langsameren apparenten Schritt (Sekunden und Minuten); beide Vorgänge sind eng gekoppelt und limitiert durch die Bindung der Carotinoide. In der schnelleren Phase ist die Bindung von Chl a und Lutein ausreichend für die Zunahme an α-helikaler Struktur. Ein thermodynamisch stabiler Komplex erfordert die Bindung von Chl b und Carotinoiden. In der schnellen Phase bindet Chl a vor Chl b und Lutein mindestens so schnell wie Chl b; beide Pigmente limitieren die Bindung von Chl b. Chl b ist notwendig für die Ereignisse der langsameren Phase.Bzgl. der Situation in vivo deuten die Daten auf (1) eine aktive Rolle der Pigmentbindung für die Membraninsertion des Proteins, (2) einen Schutz vor Photooxidation der Chlorophylle durch die obligatorische Carotinoidbindung und (3) die Möglichkeit der Umsetzung von LHCII-gebundem Chl a zu Chl b.

Einzelmolekülspektroskopische Studien an Farbstoff-markierten Chlorophyll-a/b-Lichtsammlerkomplexen und Untersuchungen zur Integration der Komplexe in elektrochemische Solarzellen

Die zentrale Funktion des Hauptlichtsammlerkomplexes des Photosystems II, LHCII, besteht in der Absorption von Sonnenlicht und der Bereitstellung von Energie für die photosynthetische Ladungstrennung im Reaktionszentrum des Photosystems. Auch in der Regulation der Photosynthese spielt der LHCII eine wichtige Rolle, da die Energieverteilung zwischen Photosystem I und Photosystem II im Rahmen des sog. „State Transition“-Prozesses über die Verteilung der Lichtsammlerkomplexe zwischen den beiden Photosystemen gesteuert wird. Im Blickfeld des ersten Teils dieser Arbeit stand die konformative Dynamik der N-terminalen Domäne des LHCII, die wahrscheinlich in die Regulation der Lichtsammlung involviert ist. Gemeinsam mit Mitarbeitern des 3. Physikalischen Instituts der Universität Stuttgart wurde an der Etablierung einer Methode zur einzelmolekülspektroskopischen Untersuchung der Dynamik des N-Terminus gearbeitet. Als Messgröße diente der Energietransfer zwischen einem Fluoreszenzfarbstoff, der an die N-terminale Domäne gekoppelt war, und den Chlorophyllen des Komplexes. Die Funktion des LHCII als effiziente Lichtantenne bildete die Grundlage für den zweiten Teil dieser Arbeit. Hier wurde untersucht, in wie weit LHCII als Lichtsammler in eine elektrochemische Solarzelle integriert werden kann. In der potentiellen Solarzelle sollte die Anregungsenergie des LHCII auf Akzeptorfarbstoffe übertragen werden, die in der Folge Elektronen in das Leitungsband einer aus Titandioxid oder Zinndioxid bestehenden porösen Halbleiterelektrode injizierten, auf der Komplexe und Farbstoffe immobilisiert waren.

Ursachen der unterschiedlichen Oligomerisierung von Lichtsammelproteinen

Die verschiedenen Lichtsammelproteine (Lhc-Proteine) höherer Pflanzen unterscheiden sich im Oligomerisierungsverhalten. Im Photosystem II existieren 6 Lhc-Proteine, die entweder die monomeren Lichtsammelkomplexe (LHC) CP24 (Lhcb6), CP26 (Lhcb5) und CP29 (Lhcb4) oder den trimeren LHCII (Lhcb1, Lhcb2 und Lhcb3) bilden. Im Photosystem I sind laut Kristallstruktur vier Lhc-Proteine lokalisiert, die als Heterodimere organisiert vorliegen. Der schwerpunktmäßig untersuchte LHCI-730 setzt sich aus Lhca1 und Lhca4 zusammen, während der LHCI-680 aus Lhca2 und Lhca3 besteht. Das Ziel der Arbeit bestand in der Identifizierung der für das unterschiedliche Oligomerisierungsverhalten verantwortlichen Proteinbereiche und Aminosäuren. Die für diese Arbeit generierten Consensussequenzalignments verschiedener Lhca- und Lhcb-Proteine vieler Arten unterstützen die Folgerungen aus Strukturdaten und anderen Sequenzalignments, dass den LHCs eine gemeinsame Monomerstruktur zu Grunde liegt. Die Helices 1 und 3 weisen weitgehend sehr hohe Sequenzidentitäten auf, während die N- und C-Termini, die zwei Schleifenregionen und die Helix 2 nur schwach konserviert sind. Falls die Bereiche mit hoher Sequenzübereinstimmung für das Zustandekommen ähnlicher monomerer LHC-Strukturen verantwortlich sind, könnten in den schwach konservierten Domänen die Ursachen für das unterschiedliche Oligomerisierungsverhalten lokalisiert sein. Aufgrund dessen wurden die schwach konservierten Domänen des monomerisierenden Lhcb4, des mit dem Lhca1 dimerisierenden Lhca4 und des Trimere bildenden Lhcb1 gegen die entsprechenden Domänen der anderen Proteine ausgetauscht und bezüglich ihres Oligomerisierungsverhaltens untersucht. Im Lhca4 konnten mit der Helix 2 und der stromalen Schleife zwei für eine Heterodimerisierung essentielle Domänen gefunden werden. Im Lhcb1 waren neben dem N-Terminus auch die 2. Helix und die stromale Schleifendomäne unentbehrlich für eine Trimerisierung. Zusätzlich waren Dimerisierung und Trimerisierung bei Austausch der luminalen Schleife beeinträchtigt. Ein geringer Beitrag zur Lhcb1-Trimerisierung konnte auch für den C-Terminus belegt werden. Ein zusätzliches Ziel der Arbeit sollte der Transfer der Oligomerisierungseigenschaften durch umfangreichen Domänentausch von einem auf ein anderes Protein sein. Der Transfer der Fähigkeit zur Dimerbildung durch Substitution gegen essentielle Lhca4-Domänen (50% luminale Schleife, 100% Helix 2 und 100% stromale Schleife) gelang beim Lhcb4, nicht aber beim Lhcb1. Der Transfer der Trimerisierungsfähigkeit auf Lhca4 und Lhcb4 scheiterte. Eine Lhca1-Mutante mit allen für eine Dimerisierung essentiellen Lhca4-Domänen, die durch Interaktion einzelner Moleküle untereinander multimere LHCs bilden sollte, war bereits in ihrer Monomerbildung beeinträchtigt. Eine Übertragung der Oligomerisierungsfähigkeit auf andere Proteine durch massiven Domänentransfer gestaltete sich somit schwierig, da vermutlich im mutierten Protein immer noch ursprüngliche Tertiärstrukturanteile enthalten waren, die nicht mit den transferierten Proteinbestandteilen kompatibel sind. Bei zukünftigen Experimenten zur Klärung der Transferierbarkeit der Oligomerisierungseigenschaft sollten deswegen neben dem unberücksichtigten 1. Teil der luminalen Schleife auch wenig konservierte Aminosäuren in der 1. und 3. Helix Beachtung finden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die LHCI-730-Dimerisierung im Detail zu untersuchen. Mutationsanalysen bestätigten den von früheren Untersuchungen bekannten Einfluss des Isoleucins 103 und Histidins 99. Letzteres geht möglicherweise durch sein gebundenes Chlorophyll eine Interaktion mit dem Lhca1 ein. Das Phenylalanin 95 stellte sich ebenfalls als ein wichtiger Interaktionspartner heraus und könnte in Wechselwirkung mit einem zwischen Lhca1 und Lhca4 lokalisierten Phosphatidylglycerin treten. Das ebenfalls an der Dimerbildung beteiligte Serin 88 des Lhca4 könnte auf Grund der räumlichen Nähe bei Modellierungen direkt mit dem am C-Terminus des Lhca1 lokalisierten Glycin 190 interagieren. Darüber hinaus wurde ein in der luminalen Lhca4-Schleife lokalisiertes Phenylalanin 84 als Interaktionspartner des Tryptophans 185 im C-Terminus von Lhca1 identifiziert. Der simultane Austausch des Isoleucins 109 und Lysins 110 in der stromalen Schleife des Lhca4, konnte deren Einfluss auf die Dimerisierung belegen. Nachdem bislang an der Dimerbildung beteiligte Aminosäuren am N- und C-Terminus des Lhca1 und Lhca4 identifiziert werden konnten, wurden in dieser Arbeit viele an einer Dimerbildung beteiligten Proteinbereiche und Aminosäuren in der Helix 2 und den Schleifenregionen des Lhca4 identifiziert. Um alle an der Lhca1-Lhca4-Interaktion beteiligten Aminosäuren aufzuklären, müssten durch Mutationsanalysen die in der stromalen Lhca4-Schleife vermuteten Interaktionspartner des für die Dimerisierung wichtigen Tryptophans 4 am N-Terminus von Lhca1 identifiziert, und die in der Helix 3 des Lhca1 vermuteten Interaktionspartner der Helix 2 des Lhca4 ermittelt werden.

Terrylendiimide als Biolabel und funktionelle Farbstoffe

In dieser Arbeit werden neue Rylenimide und Anwendungsmöglichkeiten für diese Farbstoffklasse beschrieben, die sich durch hohe Photostabilitäten und hohe Fluoreszenzquantenausbeute auszeichnet. Ziel dieser Arbeit war es, durch systematische Wahl der Substituenten in den Imidstrukturen und/oder den bay-Regionen von Rylendiimidfarbstoffen vollkommen neue Produkteigenschaften zu verwirklichen, Reaktionen bzw. Anwendungen zu ermöglichen und den Aufbau von komplexeren Chromophorarchitekturen zu gestatten. Das Strukturmotiv des Terrylendiimids nahm dabei die zentrale Rolle ein. Die Arbeit wurde in vier Kapitel aufgeteilt. Das Ziel des ersten Kapitels war es, wasserlösliche Terrylendiimide zur Untersuchung von biologischen Proben im Wellenlängenbereich über 600 nm einzusetzen. Ein wasserlösliches Terrylendiimid erwies sich dabei als deutlich photostabiler als zwei weitverbreitete Fluoreszenzfarbstoffe. Eine erste Proteinmarkierung mit monofunktionellem Farbstoff wurde an Proteinmolekülen erfolgreich durchgeführt. Durch gezielte Modifikationen konnten zwei Terrylendiimide hergestellt werden, die sich noch deutlich besser zum Abbilden von Zellstrukturen eignen. In dem zweiten Kapitel spielte die Löslichkeit von Rylendiimiden in organischen Lösungsmitteln eine zentrale Rolle. Es wurde eine Rylendiimidserie hergestellt, deren löslichkeitssteigernde Gruppen eine Organisation der Moleküle in ausgedehnten Stapelstrukturen nicht verhindern. Mit dieser Serie konnte das flüssigkristalline Verhalten und die Selbstorganisation in der Rylendiimidreihe untersucht werden. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde die Selbstorganisation der Diimide in Donor-Akzeptor Gemischen untersucht. In STM-Experimenten konnten für alle drei Diimide selbstorganisierte Monoschichten mit dem Rastertunnelmikroskop mit molekularer Auflösung abgebildet werden. Darüber hinaus wurden in diesem Kapitel die ersten organischen Feldeffekttransistoren (OFET) auf der Basis des synthetisierten Terrylendiimids beschrieben. Im Rahmen eines Projektes in dem die elektronische Energieübertragung in Donor-Akzeptor-Diaden mit Hilfe von Einzelmolekülspektroskopie untersucht wird, wurde eine Perylendiimid-Terrylediimid Diade hergestellt. Die geringere Photostabilität des Donors ermöglichte zeitaufgelöste Einzelmolekül-messungen der Akzeptoremission mit und ohne Energietransfer vom Donor auf den Akzeptor. Durch diese Messungen konnten die Zeitkonstanten des Energietransfers für einzelne Diaden ermittelt werden. Ein weiterer Chromophor aus diesem Donor-Akzeptor-Paar soll die Möglichkeit eröffnen, den Energiefluß im Molekül gezielt zu manipulieren. Dazu wurde ein Donorchromophor mit zwei Akzeptoren in einem Multichromophor kombiniert. Im Rahmen der Synthesen dieser Arbeit wurden Terrylendiimide hergestellt, die in einer Imidstruktur eine Halogenfunktion trugen. Diese waren wichtige Synthesebausteine zum Aufbau von komplexen Chromophorarchitekturen. Ziel eines weiteren Kapitels war es, ein Terrylendiimid herzustellen, das als Sensibilisatorfarbstoff gemeinsam mit dem Haupt-Antennenkomplex von höheren Pflanzen LHCII in einer photoelektrochemischen Farbstoff-Solarzelle integriert werden konnte. Das hergestellte Terrylendiimid mit Carbonsäuregruppe eignete sich für Farbstoffsolarzellen auf Zinndioxidbasis.

Pflanzlicher Lichtsammler (LHCII) in Hybridkomplexen mit organischen Farbstoffen und anorganischen Halbleiter-Nanokristallen (Quantum dots)

Der Lichtsammelkomplex II (LHCII) höherer Pflanzen ist eines der häufigsten Membranproteine der Welt. Er bindet 14 Chlorophylle und 4 Carotinoide nicht kovalent und fungiert in vivo als Lichtantenne des Photosystems II. Eine optimale Absorption von Licht ist auch bei Solarzellen entscheidend und es liegt nahe hier dasselbe Prinzip zu verwenden. Dafür bietet sich der Einsatz biologischer Komponenten wie des LHCII an. Dieser wurde evolutionär für eine effektive Absorption und Weiterleitung von Sonnenenergie optimiert. Zusätzlich lässt er sich in vitro in rekombinanter Form rekonstituieren. Für eine eventuelle Nutzung des LHCII in technologischen Anwendungen bedarf es der Interaktion mit anderen, vorzugsweise synthetischen Komponenten. Daher wurde die Bindung und der Energietransfer zwischen dem LHCII und organischen Fluoreszenzfarbstoffen sowie anorganischen „Quantum dots“ (QDs) untersucht. rnMit Donorfarbstoffen wurde die Grünlücke des LHCII funktionell geschlossen. Dafür wurden bis zu vier Fluoreszenzfarbstoffe kovalent an den LHCII gebunden. Diese Interaktion erfolgte sowohl mit Maleimiden an Cysteinen als auch mit N-Hydroxysuccinimidylestern an Lysinen. Die Assemblierung, Struktur und Funktion des Pigment-Protein-Komplexes wurde durch die Fluoreszenzfarbstoffe nicht gestört.rnAuf der Suche nach einem Farbstoff, der als Akzeptor die vom LHCII aufgenommene Energie übernimmt und durch Elektronenabgabe in elektrische Energie umwandelt, wurden drei Rylenfarbstoffe, ein Quaterrylen und zwei Terrylene, untersucht. Der LHCII konnte mit allen Farbstoffen erfolgreich markiert werden. Für die Nutzung der Hybridkomplexe ergaben sich allerdings Probleme. Das Quaterrylen beeinträchtigte aufgrund seiner Hydrophobizität die Rekonstitution des Proteins, während bei beiden Terrylenen der Energietransfer ineffizient war.rn Zusätzlich zu den Standard-Verknüpfungen zwischen Farbstoffen und Proteinen wurde in dieser Arbeit die „native chemische Ligation“ etabliert. Hierfür wurde eine LHCII-Mutante mit N-terminalem Cystein hergestellt, markiert und rekonstituiert. Messdaten an diesem Hybridkomplex ließen auf einen Energietransfer zwischen Farbstoff und Protein schließen. rnIn Hybridkomplexen sollen langfristig zur Ladungstrennung fähige Typ II-QDs Anwendung finden, wobei der LHCII als Lichtantenne dienen soll. Bis diese QDs verwendet werden können, wurden grundlegende Fragen der Interaktion beider Materialen an Typ I-QDs mit Energietransfer zum LHCII untersucht. Dabei zeigte sich, dass QDs in wässriger Lösung schnell aggregieren und entsprechende Kontrollen wichtig sind. Weiterführend konnte anhand der Trennung von ungebundenem und QD-gebundenem LHCII die Bindung von LHCII an QDs bestätigt werden. Dabei wurden Unterschiede in der Bindungseffizienz in Abhängigkeit der verwendeten LHCII und QDs festgestellt. Durch Herstellung von Fusionsproteinen aus LHCII und Affinitätspeptiden konnte die Bindung optimiert werden. Ein Energietransfer von QDs zu LHCII war nicht sicher nachzuweisen, da in den Hybridkomplexen zwar die QD- (Donor-) Fluoreszenz gelöscht, aber die LHCII- (Akzeptor-) Fluoreszenz nicht entsprechend stimuliert wurde.rnZusammenfassend wurden in dieser Arbeit einige Hybridkomplexe hergestellt, die in weiterführenden Ansätzen Verwendung finden können. Auf die hier gewonnenen Erkenntnisse über Interaktionen zwischen LHCII und synthetischen Materialien kann jetzt weiter aufgebaut werden.

Einzelmolekül-Untersuchungen zu Faltung und Zusammenbau des Lichtsammelkomplexes LHCII

Zusammenfassungrn Der Faltungsprozess des Hauptlichtsammelkomplexes des Photosystems II aus höheren Pflanzen (light harvesting complex II, LHCII) wurde bereits mehrfach untersucht, die Experimente hierzu fanden stets im Ensemble statt. Anhand der bislang veröffentlichten Faltungskinetiken des LHCII aus höheren Pflanzen lassen sich aber keine eindeutigen Aussagen bezüglich der Diversität der Faltungswege treffen. Daher sollten im Rahmen dieser Arbeit Faltungskinetiken einzelner LHCII-Moleküle während der Komplexbildung aufgenommen werden, um weitergehende Informationen zum Faltungsmechanismus zu erhalten und zur Frage, ob hier mehrere unterschiedliche Wege eingeschlagen werden.rnHierfür war zunächst die Etablierung einer Oberflächenimmobilisierung mit Glas als Trägermaterial notwendig. Nachdem Versuche, diese Immobilisierung über einen His6-tag oder über einen heterobifunktionellen Linker zu bewerkstelligen, nicht zum Erfolg geführt haben, konnte eine Immobilisierung des Biotin-markierten Proteins an Oberflächen-gebundenes Avidin erreicht werden. Die Qualität dieser Immobilisierung wurde hierbei sowohl über Bindungsversuche mit fluoreszenzfarbstoffmarkiertem Protein als auch über eine direkte Kontrolle der Oberflächenbeschaffenheit mittels Rasterkraftmikroskopie überprüft. Die für die folgenden Versuche optimale Belegungsdichte wurde im konfokalen Fluoreszenzmikroskop ermittelt. Zudem wurde sichergestellt, dass die Proteine vereinzelt auf der Oberfläche immobilisiert vorliegen.rnAuf dieser Basis wurden LHCII-Komplexe, die zuvor in vitro rekonstituiert wurden, immobilisiert und Versuche zur kontrollierten Denaturierung unternommen, um Zerfalls-kinetiken im Verfahren der internen Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (total internal reflection fluorescence, TIRF) aufnehmen zu können. Hierbei traten Schwierigkeiten bezüglich der Lebensdauer der Komplexe unter Laser-Belichtung auf, da sich die Löschung der Fluoreszenz durch Zerstrahlung der Pigmente einerseits oder Dissoziation der LHCII andererseits nicht unterscheiden ließen. Auch durch verschiedene Maßnahmen zur Erhöhung der Lebensdauer konnte diese nicht in dem Maße gesteigert werden, wie es experimentell notwendig gewesen wäre.rnFür das eigentliche Hauptziel dieser Arbeit – die Aufzeichnung von Einzelmolekül-Faltungskinetiken – war die Entwicklung einer Methode zur Rekonstitution oberflächen-immobilisierter LHCII-Apoproteine notwendig. Dieses Ziel wurde mithilfe einer Detergenzmisch-Rekonstitution erreicht. Der Erfolg der Rekonstitution konnte experimentell sowohl im Fluorimeter anhand des komplexinternen Energietransfers auf einen kovalent an das Protein gebundenen Infrarot-Fluorophor als auch im TIRF-Verfahren direkt beobachtet werden. Auch hier konnte nach ca. 80 Sekunden ein Ausbleichen der Komplexe während der Belichtung durch den Anregungs-Laser beobachtet werden.rnIn Versuchen zur Beobachtung des Komplexbildungsvorganges zeigte sich, dass die Rekonstitution offenbar durch die Belichtung massiv gestört wird. Ein weiteres Problem war eine sehr starke Hintergrundfluoreszenz, ausgelöst durch die zur Rekonstitution notwendige Pigmentlösung, die trotz der TIRF-Anregung von ausschließlich oberflächengebundenem Material die Fluoreszenz der Komplexe überlagerte. Somit konnte die Rekonstitution oberflächenimmobilisierter LHCII-Proteine zwar in Vorher-Nachher-Aufnahmen gezeigt werden, der Faltungsprozess an sich konnte dagegen im Rahmen dieser Arbeit nicht aufgezeichnet werden.

Oberflächenuntersuchungen von Metalla-Tetraazaporphyrinen

Ziel dieser Arbeit war es, ein System zu entwickeln, in dem ein durch Licht induzierter Elektronentransfer stattfinden kann. Dazu wurden ein Kupfer(II)- und ein Zink(II)Tetraazaporphyrin mit acht 4-tert-Butylphenyl-Substituenten synthetisiert (Cu4Dinit, Zn4Dinit). Die Energielücke von 1,85 eV zwischen HOMO und LUMO von Cu4Dinit in Lösung wurde mit Hilfe von Cyclovoltammetrie und UV/Vis-Messungen bestimmt. Somit ist sie größer als für Cu4Dinit Moleküle, die auf einer Oberfläche (Wolfram(100)) liegen und mit STM-, STS-Messungen untersucht wurden. Hier beträgt die Energielücke 1,35 eV, was durch eine Drehung der Phenylringe in die Ebene der Pyrrolringe des Makrozyklus und somit durch eine bessere Überlappung der Orbitale erklärt werden kann. Um die Wechselwirkung der Moleküle mit der Oberfläche zu untersuchen, wurde Cu4Dinit, wie oben beschrieben, auf Magnetit aufgedampft. Dadurch wurde ausschließlich die Wechselwirkung zwischen den Elektronenspins des Kupfer(II)-ions und den Elektronenspins des Eisens im Magnetit betrachtet. Durch Messungen der Röntgenabsorption und des XMCD-Effektes konnten das Spinmoment, Bahnmoment und das Gesamtmoment des Kupfers berechnet und eine anisotrope Kopplung des Elektronenspins des Kupferions zum Magnetit, in Abhängigkeit der Magnetisierungsrichtung des Magnetits, festgestellt werden. Wenn der Magnetit senkrecht zur Oberfläche (out-of-plane) magnetisiert ist, ist die Kopplung ferromagnetisch, während bei einer Magnetisierungsrichtung parallel zur Ebene (in-plane) des Magnetits der Elektronenspin des Kupfers antiferromagnetisch mit dem des Eisens koppelt. Dadurch muss der Hamiltonian, der die Wechselwirkung zwischen zwei Spins beschreibt, bei einer anisotropen Kopplung um einen ansiotropen Term ergänzt werden. Das Ergebnis, dass der Elektronenspin des Kupferions durch die Richtung der Magnetisierung des Magnetits beeinflusst werden kann, eröffnet neue Wege, um die Spinkonfiguration von auf der Oberfläche liegenden Molekülen mit ungepaarten Elektronen, wie die zentralen Metallionen der Makrozyklen aber auch die Elektronenspins anderer metallorganischer Komplexe oder molekulare Magnete, durch ein externes Magnetfeld zu beeinflussen. rnDurch die stöchiometrische Templatreaktion von Pyrazino[2,3-f][1,10]-phenanthrolin-2,3-di-carbonitril (Dicnq), Bis(4-tert-Butylphenyl)-fumarodinitril (Dinit) und Kupfer(II)-acetat wurde eine Koordinationsmöglichkeit für ein Ruthenium(II)-ion in einem Tetraazaporphyrin hergestellt und so die Makrozyklen Cu3Dinit1Dicnq und Zn3Dinit1Dicnq synthetisiert, mit Rutheniumionen versetzt und ebenfalls mit Hilfe von Röntgenabsorptionsmessungen und XMCD untersucht. Durch die Vergleiche mit Zn3Dinit1Dicnq und den jeweiligen Verbindungen mit koordinierten Rutheniumionen (Cu3Dinit1Dicnq-1Ru, Zn3Dinit1Dicnq-1Ru) konnte gezeigt werden, dass eine Verschiebung der Elektronendichte des Rutheniumions zu dem zentralen Kupferion des Makrozyklus stattgefunden hat und durch die Koordination eines Rutheniumions in der Peripherie des Tetraazaporphyrins die energetische Lage der Kupferorbitale beeinflusst wird.rnDer Einfluss von vier koordinierten Ruthenium(II)-ionen auf das zentrale Kupferion wurde an Hand des in dieser Arbeit hergestellten Kupfer(II)phenanthralocyanins (Cu4Dicnq) untersucht, das aus vier Dicnq-Liganden und Kupfer(II)-acetat synthetisiert wurde. Auf Grund der schlechten Löslichkeit wurde für die Koordination der Rutheniumionen der Prekursor [Ru(bipy)2Dicnq](PF6)2 hergestellt und daraus der Makrozyklus in einer Templatsynthese mit Kufper(II)-ionen gebildet. Durch diese neue Syntheseroute war es möglich, die Verbindung Cu4Dicnq-4Ru herzustellen und ebenfalls durch Röntgenabsorption und XMCD zu untersuchen und so das Spin- und Bahnmoment zu ermitteln. Ein Teil der Elektronendichte des Rutheniumions in dieser Verbindung wird auf die zusätzlich an das Rutheniumion koordinierten 2,2'-Bipyridine und nicht auf den Makrozyklus, wie in Cu3Dinit1Dicnq-1Ru, geschoben. Trotzdem konnte die Funktionsweise als Modell des Photosystems II durch eine Oxidation durch die Bestrahlung mit einer Quecksilberlampe mit para-Benzochinon beobachtet werden. Dies bestätigte die Funktionsweise des Kupfer(II)phenanthralocyanins mit koordinierten Rutheniumionen, da ein durch Licht induzierter Elektronenübergang auf das para-Benzochinon stattgefunden hat.rn

HLA class II mismatch alleles as targets of the alloreactive CD4 T-cell response

In allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT), alloreactive T lymphocytes of donor origin mediate the beneficial graft-versus-leukemia effect but also induce graft-versus-host disease (GvHD). Since human leukocyte antigens (HLA) mismatch alleles represent major targets of alloreactive T lymphocytes, patient and donor are usually matched for the class I molecules A, B, C, and for the class II molecules DRB1 and DQB1, in order do reduce the risk of GvHD. The HLA-DPB1 locus, however, is still ignored in donor selection. Interestingly, clinical studies have demonstrated that disparities at HLA-DQB1 alleles as well as distinct HLA DPB1 mismatch constellations do not adversely affect the outcome of allo-HSCT. It has also been shown that HLA class II is predominantly expressed on hematopoietic cells under non-inflammatory conditions. Therefore, this PhD thesis focused on the application of CD4 T cells in adoptive immunotherapy of leukemias.rnIn the first part of this thesis we developed a rapid screening approach to detect T-cell reactivity of donors to single HLA class II mismatch alleles. Allo-HLA reactivity was measured in naive, memory, and entire CD4 T cells isolated from PBMC of healthy donors by flow cytometric cell sorting according to expression of the differentiation markers CD45RA, CD45RO, CD62L, and CCR7. T-cell populations were defined by a single marker to facilitate translation into a clinical-grade allo-depletion procedure. Alloreactivity to single HLA-DR/-DQ mismatch alleles was analyzed in short-term mixed lymphocyte reactions (MLR) in vitro. As standard antigen-presenting cells, we used the HLA-deficient cell line K562 upon electroporation with single HLA-DR/-DQ allele mRNA. We observed in IFN-γ ELISpot assays that allo-HLA-reactivity preferentially derived from subsets enriched for naive compared to memory T cells in healthy donors, irrespective of the HLA mismatch allele. This separation was most efficient if CD62L (P=0.008) or CD45RA (P=0.011) were used as marker. Median numbers of allo-HLA-reactive effector cells were 3.5-fold and 16.6-fold lower in CD62Lneg and CD45RAneg memory CD4 T cells than in entire CD4 T cells, respectively. In allele-specific analysis, alloreactivity to single HLA-DR alleles clearly exceeded that to HLA-DQ alleles. In terms of alloproliferation no significant difference could be observed between individual CD4 T-cell subsets. rnThe second part of this thesis dealed with the generation of allo-HLA-DQ/-DP specific CD4 T cells. Naive CD45RApos CD4 T cells isolated from healthy donor PBMC by flow cytometric cell sorting were stimulated in MLR against single allo-HLA-DQ/-DP alleles transfected into autologous mature monocyte-derived dendritic cells by mRNA electroporation. Rapidly expanding HLA-DQ/-DP mismatch reactive T cells significantly recognized and cytolysed primary acute myeloid leukemia (AML) blasts, fibroblasts (FB) and keratinocytes (KC) in IFN-γ ELISpot and 51chromium release assays if the targets carried the HLA DQ/ DP allele used for T cell priming. While AML blasts were recognized independent of pre-incubating them with IFN-γ, recognition of FB and KC required IFN-γ pre treatment. We further investigated HLA class II expression on hematopoietic and non-hematopoietic cells by flow cytometry. HLA class II was not detected on primary FB, KC, and non-malignant kidney cells, but was expressed at significant levels on primary AML blasts and B-LCL. Up-regulation of HLA class II expression was observed on all cell types after pre-incubation with IFN-γ.rnIn summary, the novel K562-HLA based MLR approach revealed that naive-depleted CD4 T-cell subsets of healthy individuals contain decreased allo-HLA reactivity in vitro. We propose the application of CD45RAneg naive-depleted CD4 T cells as memory T cell therapy, which might be beneficial for HLA-mismatched patients at high-risk of GvHD and low-risk of leukemia relapse. Memory T cells might also provide important post-transplant immune functions against infectious agents. Additionally, the screening approach could be employed as test system to detect donors which have low risks for the emergence of GvHD after allo-HSCT. In the second part of this thesis we developed a protocol for the generation of allo-HLA-DQ/-DP specific CD4 T cell lines, which could be applied in situations in which patient and donor are matched in all HLA alleles but one HLA-DQ/-DP allele with low GvHD potential. These T cells showed lytic activity to leukemia cells while presumably sparing non-hematopoietic tissues under non-inflammatory conditions. Therefore, they might be advantageous for allo-HSCT patients with advanced stage AML after reduced-intensity conditioning and T-cell depletion for the replenishment of anti-leukemic reactivity if the risk for disease relapse is high. rn

Die Rolle der IFN-gamma Signalübertragung und von MyD88 in der Angiotensin-II-induzierten vaskulären Dysfunkion, Inflammation und arteriellen Hypertonie

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle von myelomonozytären Zellen, IFN-gamma (Interferon gamma), MyD88 (myeloid differentiation factor 88) und zugrundeliegenden Signalwege in der Angiotensin II (ATII)-induzierten vaskulären Inflammation, Dysfunktion und arteriellen Hypertonie untersucht. Wie bereits veröffentlichte Vordaten aus meiner Arbeitsgruppe zeigten, schützt die Depletion von Lysozym M (LysM)+ myelomonozytären Zellen (Diphteriatoxin-vermittelt in Mäusen, die transgen für den humanen Diphtheriatoxin-Rezeptor sind, LysMiDTR Mäuse) vor der ATII-induzierten vaskulären Dysfunktion und arterieller Hypertonie, und kann durch adoptiven Zelltransfer von Wildtyp Monozyten wiederhergestellt werden. In meiner Arbeit konnte ich zeigen, dass die Rekonstitution von Monozyten-depletierten LysMiDTR Mäusen mit Wildtyp Monozyten den Phänotyp der vaskulären Dysfunktion wiederherstellen kann, die Rekonstitution mit gp91phox-/y oder Agtr1-/- Monozyten jedoch nicht. Die Hypertonus-mediierenden Effekte dieser infiltrierenden Monozyten scheinen demnach von der intakten ATII und NADPH Oxidase Signalübertragung in diesen Zellen abhängig zu sein. Vermutlich ebenfalls für die Aktivierung der Monozyten funktionell wichtig sind IFN-gamma, produziert durch NK-Zellen, und der Transkriptionsfaktor T-bet (T-box expressed in T cells), exprimiert von NK-Zellen und Monozyten. IFN-gamma-/- Mäuse waren partiell geschützt vor der ATII-induzierten vaskulären Dysfunktion und charakterisiert durch reduzierte Level an Superoxid im Gefäß im Vergleich zu ATII-infundierten Wildtyp Mäusen. IFN-gamma-/- und T-bet defiziente Tbx21-/- Mäuse zeichneten sich ferner durch eine reduzierte ATII-mediierte Rekrutierung von NK1.1+ NK-Zellen, als ein Hautproduzent von IFN-gamma, sowie CD11b+GR-1low Interleukin-12 (IL-12) kompetenten Monozyten aus. Durch Depletions- und adoptive Transferexperimente konnte ich in dieser Arbeit NK-Zellen als essentielle Mitstreiter in der vaskulären Dysfunktion identifizieren und stellte fest, dass T-bet+LysM+ myelomonozytäre Zellen für die NK-Zellrekrutierung in die Gefäßwand und lokale IFN-gamma Produktion benötigt werden. Damit wurde erstmals NK-Zellen eine essentielle Rolle in der ATII-induzierten vaskulären Dysfunktion zugeschrieben. Außerdem wurde der T-bet-IFN-gamma Signalweg und die gegenseitige Monozyten-NK-Zellaktivierung als ein potentielles therapeutisches Ziel in kardiovaskulären Erkrankungen aufgedeckt. Des Weiteren identifizierte ich in meiner Arbeit MyD88 als ein zentrales Signalmolekül in der ATII-getriebenen Inflammation und vaskulären Gefäßschädigung. MyD88 Defizienz reduzierte den ATII-induzierten Anstieg des systolischen Blutdrucks und die endotheliale und glattmuskuläre vaskuläre Dysfunktion. Zusätzlich waren die vaskuläre Superoxid-Bildung sowie die Expressionslevel der NADPH Oxidase, der wichtigsten Quelle für oxidativem Stress im Gefäß, in ATII-infundierten MyD88-/- Mäusen im Vergleich zum Wildtyp reduziert. Mit Hilfe von durchflusszytometrischen Analysen deckte ich zudem auf, dass die ATII-induzierte Einwanderung von CD45+ Leukozyten, insbesondere CD11b+Ly6G-Ly6Chigh inflammatorischen Monozyten in MyD88-/- Mäusen signifikant abgeschwächt war. Diese Resultate wurden durch immunhistochemische Untersuchung von Aortengewebe auf CD68+, F4/80+ und Nox2+ Makrophagen/Phagozyten sowie Expressionsanalysen von Inflammationsmarkern untermauert. Analysen der mRNA Expression in Aortengewebe zeigten ferner eine in Wildtyp Mäusen nach ATII Infusion tendenziell gesteigerte Expression von inflammatorischen Monozytenmakern sowie eine abnehmende Expression von reparativen Monozytenmarken, während dieser Shift zu einem proinflammatorsichen Phänotyp in MyD88-/- blockiert zu sein schien. Dies zeigt eine Rolle von MyD88 in der terminalen Differenzierung von myelomonozytären Zellen an. Um dies weitergehend zu untersuchen und aufzudecken, ob die MyD88 Effekte abhängig sind von Zellen der hämatopoetischen Linie oder Gewebszellen, wurden Knochenmarktransferexperimente durchgeführt. MyD88 Defizienz in Knochenmark-abstammende Zellen reduzierte die ATII-induzierte vaskuläre Dysfunktion und Infiltration der Gefäßwand mit CD45+ Leukozyten und inflammatorischen myelomonozytären Zellen. Die protektiven Effekte der MyD88 Defizienz in der Angiotensin II-induzierten Inflammation konnten nicht auf Signalwege über die Toll-like Rezeptoren TLR2, -7 oder -9 zurückgeführt werden, wie die Untersuchung der vaskulären Reaktivität entsprechender Knockout Mäuse zeigte. Zusammenfassend konnte ich in meiner Arbeit zeigen, dass die Infiltration der Gefäßwand mit Nox2+AT1R+T-bet+MyD88+ myelomonozytären Zellen und die Wechselwirkung und gegenseitige Aktivierung dieser Zellen mit IFN-gamma produzierenden NK-Zellen eine zentrale Bedeutung in der Pathogenese der Angiotensin II (ATII)-induzierten vaskulären Dysfunktion, Inflammation und arteriellen Hypertonie einnehmen.