Untersuchungen zum Ectodomain shedding des Receptor for advanced glycation endproducts

Zu den Liganden des Zelloberfl��chenrezeptors RAGE geh��ren AGEs, S100-Proteine, HMGB1 und A��. RAGE wird daher eine Rolle bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen sowie Diabetes, Arteriosklerose und Krebs zugesprochen. Des Weiteren geht eine Verringerung der Menge an sRAGE h��ufig mit diesen Krankheiten einher. Aus diesen Gr��nden stellt die pharmakologische Stimulierung der Proteolyse von RAGE eine vielversprechende Therapieform dar. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Steigerung der sRAGE-Bildung ��ber PAC1-, V2- und OT-Rezeptoren m��glich ist. Die Untersuchung der PAC1-Signalwege zeigte, dass PKC��/PKC��I, CaMKII, Ca2+-Ionen, PI3-Kinase und der MAP-Kinase-Weg wichtig f��r die Stimulierung sind und dass der PKA-Weg nicht beteiligt ist. Die dreimonatige Behandlung von M��usen mit PACAP-38 weist darauf hin, dass eine Stimulierung des Ectodomain Sheddings von RAGE auch in vivo erfolgen kann. Die Untersuchung der Signalwege, ausgehend von den V2- und OT-Rezeptoren, zeigte, dass ebenfalls PKC��/PKC��I, CaMKII, Ca2+-Ionen zur Aktivierung der Proteasen f��hren, dagegen konnte weder ein Einfluss des PKA- noch des MAP-Kinase-Weges festgestellt werden. Au��erdem wurden sowohl MMP-9 als auch ADAM-10 als RAGE-spaltende Proteasen identifiziert. Die n��here Untersuchung der RAGE-Spaltstelle erbrachte, dass keine spezifische Sequenz, sondern vielmehr die Sekund��rstruktur eine Rolle bei der Erkennung durch die Proteasen spielt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde weiterhin ein anti-RAGE Antik��rper anhand einer neu entwickelten Methode zun��chst gereinigt und dann erfolgreich an ein mit dem Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin markiertes Polymer gekoppelt. Die Stimulierung der Proteolyse von Meprin �� wurde auch untersucht und es konnte ebenfalls eine Beteiligung von ADAM-10 an der Spaltung nachgewiesen werden.

Induction of RAGE shedding by activation of G-protein-coupled receptors

The multiligand Receptor for Advanced Glycation End products (RAGE) is involved in various pathophysiological processes, including diabetic inflammatory conditions and Alzheimers disease. Full-length RAGE, a cell surface-located type I membrane protein, can proteolytically be converted by metalloproteinases ADAM10 and MMP9 into a soluble RAGE form. Moreover, administration of recombinant soluble RAGE suppresses activation of cell surface-located RAGE by trapping RAGE ligands. Therefore stimulation of RAGE shedding might have a therapeutic value regarding inflammatory diseases. We aimed to investigate whether RAGE shedding is inducible via ligand-induced activation of G protein-coupled receptors (GPCRs). We chose three different GPCRs coupled to distinct signaling cascades: the V2 vasopressin receptor (V2R) activating adenylyl cyclase, the oxytocin receptor (OTR) linked to phospholipase C��, and the PACAP receptor (subtype PAC1) coupled to adenylyl cyclase, phospholipase C��, calcium signaling and MAP kinases. We generated HEK cell lines stably coexpressing an individual GPCR and full-length RAGE and then investigated GPCR ligand-induced activation of RAGE shedding. We found metalloproteinase-mediated RAGE shedding on the cell surface to be inducible via ligand-specific activation of all analyzed GPCRs. By using specific inhibitors we have identified Ca2+ signaling, PKC��/PKC��I, CaMKII, PI3 kinases and MAP kinases to be involved in PAC1 receptor-induced RAGE shedding. We detected an induction of calcium signaling in all our cell lines coexpressing RAGE and different GPCRs after agonist treatment. However, we did not disclose a contribution of adenylyl cyclase in RAGE shedding induction. Furthermore, by using a selective metalloproteinase inhibitor and siRNAmediated knock-down approaches, we show that ADAM10 and/or MMP9 are playing important roles in constitutive and PACAP-induced RAGE shedding. We also found that treatment of mice with PACAP increases the amount of soluble RAGE in the mouse lung. Our findings suggest that pharmacological stimulation of RAGE shedding might open alternative treatment strategies for Alzheimers disease and diabetes-induced inflammation.

Molekulare Charakterisierung der Centrin-Isoformen in der Retina von S��ugetieren

Centrine sind Mitglieder einer hoch konservierten ��berfamilie von Ca2+-bindenden Proteinen mit EF-Hand Motiven. Bislang sind vier Centrin-Isoformen bei S��ugern beschrieben worden, die in diversen Zellen in der Regel mit Centriolen von Centrosomen oder Centrosomen-verwandten Strukturen assoziiert sind. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden die vier Centrin-Isoformen bez��glich der Expression in verschiedenen Geweben untersucht. Dabei lag der Hauptfokus auf Untersuchungen der Centrine in den Photorezeptorzellen der Retina. Analysen auf subzellul��rer Ebene brachten Klarheit ��ber die differenzielle Lokalisation der verschiedenen Isoformen in der Retina. Mit Hilfe von verschiedenen Methoden konnten Wechselwirkungspartner in der Retina identifiziert werden, die eine Rolle in der visuellen Signaltransduktionskaskade spielen. Dabei k��nnten Centrine einem Regelmechanismus angeh��ren, der wichtige Translokationsprozesse dieser Proteine regelt. In den Photorezeptorzellen der S��ugetierretina werden die vier Isoformen exprimiert, die in den Strukturen des Cilienapparates differenziell lokalisiert sind. Dabei beschr��nkt sich ihre Lokalisation entweder auf den Basalk��rper (Centrin 4), auf das Verbindungscilium (Centrin 1) oder sie sind in beiden Strukturen zu finden (Centrin 2 und 3). In den nicht- Photorezeptorzellen der Retina sind die Isoformen Centrin 2 und 3 zudem an den Centriolen der Centrosomen lokalisiert. In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass alle Centrin-Isoformen in ein und derselben Zelle, der Photorezeptorzelle, koexprimiert werden und dabei subzellul��r kolokalisiert sind. Im Weiteren konnte die ubiquit��re Expression von Centrin 2 und 3 in allen untersuchten Geweben an Centrosomen best��tigt werden. Centrin 1 und 4 hingegen werden nur in Geweben mit Cilien-tragenden Zellen exprimiert. Die Funktion der Centrine wird nicht nur durch Bindung von Ca2+, sondern auch durch Phosphorylierungen reguliert. Alle Sequenzen der Centrine weisen diverse m��gliche Phosphorylierungsstellen f��r unterschiedliche Proteinkinasen auf. Die Ergebnisse aller durchgef��hrten in vitro und ex vivo Phosphorylierungs ���Assays��� zeigen eine licht-abh��ngige Phosphorylierung der Centrin-Isoformen in der Retina. Dabei war in der dunkel-adaptierten Retina die Phosphorylierung vor allem von Centrin 1 und 2 erh��ht. Weiterf��hrende Experimente mit Kinase-Inhibitoren wiesen darauf hin, dass vor allem die Proteinkinase CKII eine bedeutende Rolle bei der Centrin-Phosphorylierung in der Retina einnimmt. Centrine sind die ersten Cytoskelettkomponenten, deren Phosphorylierungsgrad lichtabh��ngig moduliert wird. Diese Ergebnisse weisen auf einen Signalweg, der zwischen der visuellen Signaltransduktionskaskade und der Regulation der Centrin-Aktivit��t vermittelt, hin. Bei der Suche nach Centrin-Bindungspartnern gelang mit Hilfe von Centrin 1 Blot ���Overlay Assays��� der Durchbruch. Der neuartige Ansatz zeigte, dass ausschlie��lich Ca2+-aktiviertes Centrin 1 mit Proteinen aus der Retina interagierte. Nach der Identifikation eines 37 kDa-Proteins als die ��-Untereinheit des visuellen G-Proteins Transducin wurden die Untersuchungen auf diesen Interaktionspartner fokussiert. Die Ergebnisse der hier durchgef��hrten biochemischen und biophysikalischen Protein-Protein Interaktionsexperimente zeigen insgesamt folgendes: ��� Alle vier Centrine interagieren mit Transducin, wobei Centrin 3 die geringste Affinit��t zu Transducin hat. ��� Die Assemblierung der Centrin���G-Protein-Komplexe ist strikt Ca2+-abh��ngig. ��� Die Centrine binden sowohl an das isolierte Gt����-Heterodimer als auch an den heterotrimeren Gt-holo-Proteinkomplex, nicht aber an Gt��. Die quantitativen immunoelektronenmikroskopischen Analysen zeigen im Weiteren, dass sich die Komplexe aus Transducin und Centrin 1 bis 3 wahrscheinlich in einer Subdom��ne des Verbindungsciliums der Photorezeptorzellen ausbilden. Dabei d��rfte die Ausbildung der Komplexe an der Regulation der lichtinduzierten Translokation von Transducin zwischen Innen- und Au��ensegment der Photorezeptorzellen beteiligt sein. Dieser Translokationsmechanismus wird als ein wichtiger Bestandteil der Langzeitadaption der Signaltransduktionskaskade der S��ugerretina diskutiert. Der neuartige Regelmechanismus der molekularen Translokationen, in dem Centrine involviert sind, ist au��ergew��hnlich und d��rfte ��ber die speziellen Photorezeptorzellen hinaus von weit reichender Bedeutung sein.

Conditional and transgenic mouse models as tools to study the role of TGFbeta, BMP signaling in skeletal development

Die TGFbeta/BMP Signaltransduktionskaskade ist wichtig f��r viele Entwicklungsprozesse fast aller embryonaler sowie extraembryonaler Gewebe und sie ist ebenso essentiell bei der Aufrechterhaltung der Hom��ostase im adulten Organismus. In vielen Mausmodellen und Zellkulturversuchen wurde gezeigt, dass Liganden dieses Signalweges in verschiedene Stadien der Knorpel- und Knochenentwicklung involviert sind. BMPs sind beispielsweise ma��geblich an der fr��hen Kondensation und Bildung des Knorpels und sp��ter an Proliferation und Hypertrophie der Chondrozyten beteiligt. BMPs k��nnen ektopisch Knochenbildung ausl��sen und das Expressionsmuster der Liganden und spezifischen Rezeptoren in der Wachstumsfuge l��sst auf eine wichtige Rolle der BMPs in der Wachstumsfuge schlie��en. Der gezielte knock out der BMP-Rezeptoren Bmpr1a und Bmpr1b in proliferierenden Chondrozyten f��hrt zur Ausbildung einer generellen Chondrodysplasie. Smad1, Smad5 und Smad8 sind die Mediatoren der BMP-Signalkaskade. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle und Funktion der Smad1- und Smad5-Proteine in der Wachstumsfuge untersucht werden. Hierzu wurden konditionale Smad1-knock out-M��use mit einer transgenen Mauslinie gekreuzt, die die Cre-Rekombinase spezifisch in proliferierenden Chondrozyten exprimiert. Diese M��use wurden mit und ohne heterozygotem Smad5-Hintergrund charakterisiert. Bei einem knock out von Smad1 allein konnte ein leichte Verk��rzung der Wachstumsfuge beobachtet werden, wobei pr��hypertrophe und hypertrophe Zone gleicherma��en betroffen waren. Dieser Ph��notyp war verst��rkt in M��usen mit zus��tzlichem heterozygotem Smad5-Hintergrund. Eine Verringerung der Proliferationsrate konnte zusammen mit einer verminderten Ihh-Expression nachgewiesen werden. Zus��tzlich konnte anhand von R��ntgenaufnahmen eine Dysorganisation der nasalen Region und ein fehlendes nasales Septum beobachtet werden. Produktion und Mineralisation der extrazellul��ren Matrix waren nicht beeintr��chtigt. Um die Rolle der BMP- und TGFbeta-Signalkaskaden w��hrend der endochondralen Ossifikation zu vergleichen, wurden transgene M��use generiert, in denen die TGFbeta-Signalkaskade spezifisch in proliferierenden Chondrozyten gest��rt war. Zwei Mauslinien, die ��hnliche Ph��notypen zeigten, wurden untersucht. Esl1 ist ein TGFbeta-bindendes Protein, von dem man annimmt, dass es die TGFbeta-Signalkaskade inhibieren kann. Esl1-knock out-M��use sind kleiner als Wildtypm��use und die ��berexpression von Esl1 in proliferierenden Chondrozyten f��hrt zu einer Verl��ngerung der Wachstumsfuge und einer verst��rkten Proliferationsrate. Knorpelmarker, wie Col2a1 und Sox9 sind in diesen M��usen herunterreguliert, w��hrend Col10a1 und Ihh als Marker f��r die hypertrophe und pr��hypertrophe Zone herunterreguliert waren. Dies f��hrt zu der Annahme, dass mehr Zellen in die terminale Differenzierung eintreten. Bei transgenen M��usen, in denen ein dominant-negativer (dn) TGFbeta-Rezeptor in proliferierenden Chondrozyten ��berexprimiert wurde, konnte eine verl��ngerte pr��hypertrophe Zone, eine erh��hte Ihh-Expression, sowie eine verst��rkte Proliferationsrate beobachtet werden. Zus��tzlich konnte in homozygoten Tieren ein craniofacialer Ph��notyp beschrieben werden, der zu Problemen bei der Nahrungsaufnahme und damit zu einer starken Wachstumsbeeintr��chtigung f��hrte. Die BMP- und TGFbeta-Signalkaskaden haben m��glicherweise antagonistische Effekte in der Wachstumsfuge. W��hrend der Ausfall von BMP in proliferierenden Chondrozyten aufgrund einer gesunkenen Proliferationsrate zu einer Verk��rzung der Wachstumsfuge f��hrte, kann man in M��usen mit einer St��rung der TGFbeta-Signalkaskade eine verst��rkte Proliferation in einer daher verl��ngerten Wachstumsfuge beobachten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Generation einer transgenen Mauslinie, die die Cre-Rekombinase spezifisch in hypertrophen Chondrozyten exprimiert. Promoterstudien mit transgenen M��usen weisen darauf hin, dass ein putatives AP1-Element, etwa 4 kb vor dem ersten Exon des Col10a1 gelegen, wichtig f��r die spezifische Expression in hypertrophen Chondrozyten ist. Ein Konstrukt, dass vier Kopien dieses Elements und den basalen Promoter enth��lt, wurde benutzt, um die Cre-Rekombinase spezifisch zu exprimieren. Diese Mauslinie befindet sich in der Testphase und erste Daten deuten auf eine spezifische Expression der Cre-Rekombinase in hypertrophen Chondrozyten hin.

Charakterisierung funktioneller Dom��nen von Centrin-Isoformen

Centrine sind kleine Ca2+-bindende Proteine aus der Familie der EF-Hand Proteine. Erstmals wurden Centrine als Hauptbestandteil der kontraktilen Flagellenwurzeln von Gr��nalgen beschrieben. Mittlerweile konnten Centrine in nahezu allen eukaryotischen Organismen nachgewiesen werden. In S��ugetieren wurden bis zu vier Isoformen identifiziert, die an Centrosomen oder davon abgeleiteten Strukturen, wie Spindelpolk��rpern und Basalk��rper, aber auch in ��bergangszonen von Cilien exprimiert werden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Centrine im zellul��ren Kontext der Photorezeptorzellen nicht nur durch die Bindung von Ca2+ reguliert werden, sondern auch durch reversible Phosphorylierungen. Die Phosphorylierung der Centrin-Isoformen findet in der Retina von Vertebraten lichtabh��ngig w��hrend der Dunkeladaption statt. Die Protein Kinase CK2 (CK2) ist f��r die beschriebenen lichtabh��ngigen Phosphorylierungen hauptverantwortlich. Obwohl alle Centrin-Isoformen mehrere m��gliche Zielsequenzen f��r die CK2 besitzen, kommt es nur zur Phosphorylierung einer einzigen Aminos��ure in Cen1p, Cen2p und Cen4p. Im Gegensatz dazu stellt die Isoform Cen3p kein Substrat f��r die CK2 dar. Zudem wurden hier erstmals Phosphatasen identifiziert, die in der Lage sind Centrine zu dephosphorylieren. Die Dephosphorylierung durch die PP2C������und PP2C��� ist sehr spezifisch, da keine andere Phosphatase der Retina die CK2-vermittelte Phosphorylierung der Centrine r��ckg��ngig machen kann. Hoch aufl��sende licht- und elektronenmikroskopische Analysen zeigten erstmals, dass die Centrine sowohl mit der CK2 als auch mit der PP2C��� im Verbindungscilium der Photorezeptorzellen colokalisiert sind. Cen1p und CK2 sind in der Lage, direkt an Mikrotubuli zu binden, was die notwendige r��umliche N��he zwischen Enzymen und Substrat herstellt. Bisherige Arbeiten zeigten, dass alle Centrine Ca2+-abh��ngig mit dem visuellen G-Protein Transducin interagieren. Diese Wechselwirkung d��rfte an der Regulation der lichtabh��ngigen Translokation des visuellen G-Proteins Transducin zwischen dem Au��en- und dem Innensegment der Photorezeptorzelle beteiligt sein. In der vorliegenden Arbeit zeigten Interaktionsstudien, dass die Bindungsaffinit��ten der Centrine f��r Transducin durch die CK2-vermittelte Phosphorylierung drastisch verringert wurden. Dieser beobachtete Effekt beruht auf deutlich verringerten Ca2+-Affinit��ten der Centrin-Isoformen nach der CK2-vermittelten Phosphorylierung. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuartiger Regulationsmechanismus der Centrine in den Photorezeptorzellen der Vertebraten beschrieben. Centrine werden nicht nur durch Ca2+-Bindung zur Bildung von Protein Komplexen stimuliert, sondern durch die Phosphorylierung zum Aufl��sen dieser Komplexe angeregt. Damit reguliert die CK2-vermittelte, lichtabh��ngige Phosphorylierung der Centrine m��glicherweise ebenfalls die adaptive Translokation des visuellen G-Proteins Transducin zwischen dem Au��en- und Innensegment der Photorezeptorzellen.

Die Rolle von GABA- und Glyzinrezeptoren w��hrend der radialen Migration kortikaler Neurone in der pr��natalen Maus

F��r die Entwicklung des zerebralen Kortex ist die radiale Migration von Neuronen von elementarer Bedeutung. F��r diese radiale Migration sind extrazellul��re Signale, die mit den Neuronen interagieren und eine Umgestaltung des Zytoskeletts vermitteln, notwendig. Zu den extrazellul��ren Signalen geh��rt auch der Neurotransmitter GABA, der ��ber Depolarisation der Neurone einen Ca2+-Einstrom vermittelt und dadurch die Modulation der Migration ��ber Ca2+-abh��ngige Signalwege erm��glicht. Auch von Taurin ist bekannt, dass es die neuronale Migration beeinflusst. Fr��here Studien zeigten, dass die Depolarisation von GABAA-Rezeptoren durch GABA zu einem Migrationsstop f��hrt, wohingegen Picrotoxin-sensitive Rezeptoren die Migration von der Ventrikul��ren Zone in die Intermedi��re Zone des pr��natalen Kortex vermitteln. Obwohl zu den Picrotoxin-sensitiven Rezeptoren GABAA-, GABAC- und bestimmte Glyzinrezeptoren geh��ren, wurde die Rolle von GABAC- und Glyzinrezeptoren w��hrend der radialen Migration nie ��berpr��ft. Ziel dieser Dissertation war deshalb, den Einfluss von GABAC- und Glyzinrezeptoren auf die radiale Migration zu untersuchen. Unter Verwendung von Migrationsanalysen, Fluoreszenzmessungen, molekularbiologischen und histologischen Methoden wurde gezeigt, dass GABAC-Rezeptoren im unteren Bereiche des pr��frontalen Kortex exprimiert werden, ihre Aktivierung durch GABA in der Intermedi��ren Zone zu einer Depolarisation f��hrt, dass GABAC-Rezeptoren die Migration f��rdern und dieser Effekt ��ber den migrationsstoppenden Effekt der GABAA-Rezeptoren dominiert. Durch Aktivierung der Glyzinrezeptoren f��rdert Taurin die Migration.

Differentiation and extracellular matrix interactions of chondrocytes in response to signaling molecules and biomaterials for cartilage repair = Differenzierung und Interaktionen von Chondrozyten mit der extrazellul��ren Matrix als Reaktion auf Signalmolek��le und Biomaterialien f��r die Wiederinstandsetzung von Knorpel

Chondrocytes live isolated in the voluminous extracellular matrix of cartilage, which they secrete and is neither vascularized nor innervated. Nutrient and waste exchanges occur through diffusion leading to low oxygen tension around the cells. Consequently even normal cartilage under normal physiological conditions suffers from a poor reparative potential that predisposes to degenerative conditions, such as osteoarthritis of the joints, with significant clinical effects.rnOne of the key challenges in medicine is the structural and functional replacement of lost or damaged tissues. Current therapeutical approaches are to transplant cells, implant bioartificial tissues, and chemically induce regeneration at the site of the injury. None of them reproduces well the biological and biomechanical properties of hyaline cartilage.rnThis thesis investigates the re-differentiation of chondrocytes and the repair of cartilage mediated by signaling molecules, biomaterials, and factors provided in mixed cellular cultures (co-culture systems). As signaling molecules we have applied prostaglandin E2 (PGE2) and bone morphogenetic protein 1 (BMP-1) and we have transfected chondrocytes with BMP-1 expressing vectors. Our biomaterials have been hydrogels of type-I collagen and gelatin-based scaffolds designed to mimic the architecture and biochemistry of native cartilage and provide a suitable three-dimensional environment for the cells. We have brought chondrocytes to interact with osteosarcoma Cal 72 cells or with murine preosteoblastic KS483 cells, either in a cell-to-cell or in a paracrine manner.rnExogenous stimulation with PGE2 or BMP-1 did not improve the differentiation or the proliferation of human articular chondrocytes. BMP-1 induced chondrocytic de-differentiation in a dose-dependent manner. Prostaglandin stimulation from gelatin-based scaffolds (three-dimensional culture) showed a certain degree of chondrocyte re-differentiaton. Murine preosteoblastic KS483 cells had no beneficial effect on human articular chondrocytes jointly cultivated with them in hydrogels of type I collagen. Although the hydrogels provided the chondrocytes with a proper matrix in which the cells adopted their native morphology; additionally, the expression of chondrocytic proteoglycan increased in the co-cultures after two weeks. The co-culture of chondrocytes with osteoblast-like cells (in transwell systems) resulted in suppression of the regular de-differentiation program that passaged chondrocytes undergo when cultured in monolayers. Under these conditions, the extracellular matrix of the chondrocytes, rich in type-II collagen and aggrecan, was not transformed into the extracellular matrix characteristic of de-differentiated human articular chondrocytes, which is rich in type-I collagen and versican.rnThis thesis suggests novel strategies of tissue engineering for clinical attempts to improve cartilage repair. Since implants are prepared in vitro (ex-vivo) by expanding human articular chondrocytes (autologous or allogeneic), we conclude that it will be convenient to provide a proper three-dimensional support to the chondrocytes in culture, to supplement the culture medium with PGE2, and to stimulate chondrocytes with osteoblastic factors by cultivating them with osteoblasts.rn

Influence of the chemokine CXCL12 on the progression and the signaling in colorectal cancer

Das Chemokin CXCL12 (auch bekannt als SDF-1) ist ein kleines Protein (8-14) KDa, das in sechs Isoformen exprimiert wird (SDF-1��, SDF-1��, SDF-1��, SDF- 1��, SDF-1�� und SDF-1��) von einem einzigen Gen, dass die Leukozyten-Wanderung regelt und variabel in einer Reihe von normalen und Krebsgeweben exprimiert wird.rnCXCL12 spielt verschiedene Rollen in der Tumorpathogenese. Es wurde nachgewiesen, dass CXCL12 das Tumorwachstum und die Malignit��t f��rdert, die Tumorangiogenese st��rkt, sich an der Metastasierung beteiligt und zu immunsuppressiven Netzwerken innerhalb des Tumormikromilieus beitr��gt. Daher liegt es nahe, dass der CXCL12/CXCR4-Signalweg ein wichtiges Ziel ist f��r die Entwicklung von neuartigen Krebstherapien.rnUm Licht auf die Rolle der Chemokin CXCL12 Splicevarianten in der Entwicklung von Krebs zu werfen und die m��gliche physiologische Relevanz und ihre m��glichen funktionellen Unterschiede bei Darmkrebs zu verstehen, haben wir alle CXCL12 Splicevarianten (alpha, beta, gamma, delta, epsilon und theta) in die kolorektalen Zelllinie SW480 und die Melanomzellinie D05 transfiziert und exprimiert.rnrnDiese Arbeit wurde erstellt, um die folgenden Ziele zu erreichen. Untersuchung der Rolle von CXCL12 Splicevarianten bei der Vermittlung von Tumorprogression, Adh��sion, Migration, Invasion und Metastasierung von Darmkrebs. Untersuchung, ob die CXCL12 Variantenwege ein wichtiges Ziel f��r die Entwicklung von Krebstherapien darstellen.rn��� Um eine in vivo Mausmodell zu entwickeln, um die Rolle der CXCL12 Varianten im Rahmen des Tumorwachstums zu verstehen.rnrnUnsere Ergebnisse zeigen, dass:Der CXCL12 G801A Polymorphismus ist ein Low-Penetranz Risikofaktor f��r die Entwicklung von Darmkrebs. Der CXCL12-Gen-Polymorphismus rs1801157 ist mit dem T-Status (Tumor-node-Metastasen) assoziiert. Es gab keine Beziehung zwischen CXCL12-Gen-Polymorphismus rs1801157 und Fernmetastisen oder LN metastasen. Alle sechs CXCL12 Splicevarianten werden im Darmkrebs und in gesunder Kolon mucosa exprimiert. Die h��chste Expression wird bei SDF-1alpha, dann SDF-1 beta gefunden. Alle sechs CXCL12 Varianten zeigen erh��hte Tumorzellproliferation in vitro. SDF-1beta, gefolgt von SDF-1alpha zeigte die gr����te Aktivit��t im Proliferationsassay.rn��� Alle sechs CXCL12 Varianten induzieren die Tumorzelladh��sion.SDF-1beta dann SDF-1alpha zeigte die gr����te Aktivit��t im Rahmen des Adh��sionsassay. Alle sechs CXCL12 Varianten erh��hten die Zellmigration und Invasion von Tumorzellen in vitro. SDF-1theta und SDF-1epsilon 1theta zeigten die gr����te Aktivit��t, w��hrend die schw��chste Aktivit��t mit SDF-1alpha und SDF-1beta beobachtet wurde. Alle sechs CXCL12 Varianten aktivieren Akt und (MAPK) Mitogen- acktivatedierte Protein kinase Wege und damit die Regulierung viele essentieller Prozesse in Tumorzellen, wie Proliferation, Migration, Invasion und Adh��sion. Es ist interessant festzustellen, dass AMD3100 die CXCL12 Splicevarianten inhibriert, die AKT-MEK-1/2-Phosphorylierung induzieren.rnDer Inhibitor AMD3100 unterdr��ckt stark die CXCL12 Varianten -delta, -epsilon und theta-und unterdr��ckt schwach CXCL12-gamma. w��hrend es keine signifikante Wirkung auf CXCL12-alpha und beta hatte. Es hat m��glicherweise Auswirkungen auf mehrere gro��e Signalwage in Bezug auf Proliferation, Migration und Invasions.rn��� Es ist wichtig anzumerken, dass die Hemmung von CXCL12-Varianten durch AMD3100 einen der m��glichen Ansa��tze in der Krebstherapie darstellen kann.Wir schlagen vor, dass weitere Studien erwogen werden, die wir brauchen, um die biologische Aktivit��t dieser neuen CXCL12 Varianten bei verschiedenen Arten von Krebs klar zu verstehen.

Zellul��re und molekulare Mechanismen der angeborenen Immunit��t

Die myeloide Zelllinie MUTZ-3 konnte als geeignetes Modellsystem zur Charakterisierung der TREM-1-Signaltransduktion etabliert werden, da diese TREM-1 und dessen essentielles Adaptermolek��le DAP12 funktional exprimiert. ��bereinstimmend mit bisherigen Daten wurden die Kinasen PI3K und p38-MAPK als wichtige Regulatoren in der Signalweiterleitung nach TREM-1-Aktivierung identifiziert, wobei sich einige Unterschiede in der exakten Signalhierarchie zwischen monozyt��ren und granulozyt��ren Zellen ergaben. So erfolgt die Aktivierung von PI3K und p38-MAPK in PMN unabh��ngig voneinander und in monozyt��ren Zellen findet die Aktivierung von p38-MAPK vor der Akt-Phosphorylierung statt und ist f��r Letztere notwendig. Zudem ist die Ca2+-Mobilisierung in PMN nur von PI3K abh��ngig und in monozyt��ren Zellen von PI3K und p38-MAPK. Bei der durch TLR- oder NLR-Koligation gesteigerten TREM-1-Aktivierung sind PI3K und p38-MAPK ebenfalls zentrale Regulatoren. Es ergaben sich ebenfalls Unterschiede in der exakten TREM-1-Signaltransduktion.rnrnEin Mausmodell f��r invasive Aspergillose (IA) wurde erfolgreich etabliert, wobei die wichtige Rolle der PMN bei der Abwehr von Pilzinfektionen durch deren Depletion mit unterschiedlichen Antik��rpern belegt wurde. F��r das Abt��ten von A. fumigatus-Konidien sind oxidative und nicht-oxidative PMN-Effektormechanismen notwendig. Dabei konnte die essentielle Rolle der oxidativen PMN-Effektorfunktionen anhand NADPH-Oxidase-defizienter p47phox-/- und gp91phox-/- M��use f��r das ��berleben von Pilzinfektionen gezeigt werden. Dagegen war die Infektion von Neutrophiler Elastase defizienter ELANE M��use nicht letal. Dies deutet darauf hin, dass diese als prototypische Serinprotease und wichtiger Bestandteil der NET-Formation nicht essentiell f��r das ��berleben von IA ist oder durch andere, nicht-oxidative Effektormechanismen kompensiert werden kann. Keinen Einfluss auf die IA hatte die Depletion von Arginin mittels ADI-PEG, da weder das ��berleben der M��use noch das Abt��ten der Pilzkonidien beeinflusst wurde. Au��erdem wurden keine Ver��nderung in der Einwanderung und Aktivierung von PMN nach Infektion quantifiziert. Dagegen induzierte die Defizienz in ADAMTS13 (ADAMTS13-/- M��use) eine verminderte Rekrutierung von PMN, einhergehend mit erh��hter Mortalit��t, vermindertem Abt��ten von A. fumigatus-Konidien und erh��hter Sch��digung der Lunge bei IA. Da in vitro keine generellen oder pilzspezifischen Defekte der PMN quantifiziert wurden, muss ADAMTS13 die Einwanderung der PMN beeinflussen. Normalerweise spaltet die Protease ADAMTS13 den von-Willebrand-Faktor (vWF), der die Quervernetzung und das Anhaften von Blutpl��ttchen an besch��digte Gef����w��nde steuert. Ob und wie ADAMTS13 oder der vWF die verminderte PMN-Einwanderung bei Pilzinfektionen verursacht, muss weiter untersucht werden.rnrnZusammenfassend verbessern die erhaltenen Daten f��r eine zellspezifische TREM-1-Signaltransduktion, ein von oxidativen und nicht-oxidativen PMN-Effektorfunktionen abh��ngiges sowie Arginin-unabh��ngiges Abt��ten vom Pilz A. fumigatus als auch der Einfluss von ADAMTS13 und vWF bei der Rekrutierung von PMN nach A. fumigatus-Infektion unser Verst��ndnis der angeborenen Immunit��t. Diese Erkenntnisse dienen der zuk��nftigen Entwicklung von Therapien zur Behandlung von schweren Entz��ndungsreaktionen wie Aspergillose und Sepsis.

Oligodendroglial exosomes in glia to neuron signaling

In the CNS, myelinating oligodendrocytes and axons form a functional unit based on intimate cell-cell interactions. In addition to axonal insulation serving to increase the conduction velocity of electrical impulses, oligodendrocytes provide trophic support to neurons essential for the long-term functional integrity of axons. The glial signals maintaining axonal functions are just at the beginning to become uncovered. Yet, their determination is highly relevant for all types of demyelinating diseases, where lack of glial support significantly contributes to pathology. rnThe present PhD thesis uncovers exosomes as a novel signaling entity in the CNS by which cargo can be transferred from oligodendrocytes to neurons. Exosomes are small membranous vesicles of endocytic origin, which are released by almost every cell type and have been implicated in intercellular communication. Oligodendrocytes secrete exosomes containing a distinct set of proteins as well as mRNA and microRNA. Intriguingly, oligodendroglial exosome release is stimulated by the neurotransmitter glutamate indicating that neuronal electrical activity controls glial exosome release. In this study, the role of exosomes in neuron-glia communication and their implications on glial support was examined. Cortical neurons internalized and accumulated oligodendroglial exosomes in the neuronal cell soma in a time-dependent manner. Moreover, uptake occurred likewise at the somatodendritic and axonal compartment of the neurons via dynamin and clathrin dependent endocytosis. Intriguingly, neuronal internalization of exosomes resulted in functional retrieval of exosomal cargo in vitro and in vivo upon stereotactic injection of Cre recombinase bearing exosomes. Functional recovery of Cre recombinase from transferred exosomes was indicated by acquired reporter recombination in the target cell. Electrophysiological analysis showed an increased firing rate in neurons exposed to oligodendroglial exosomes. Moreover, microarray analysis revealed differentially expressed genes after exosome treatment, indicating functional implications on neuronal gene expression and activity. rnTaken together, the results of this PhD thesis represent a proof of principle for exosome transmission from oligodendrocytes to neurons suggesting a new route of horizontal transfer in the CNS.rn

The physiological role of APP in the activation of neuroprotective signaling mechanisms

Accumulating evidence indicates that loss of physiological amyloid precursor protein (APP) function leads to enhanced susceptibility of neurons to cellular stress during brain aging. This study investigated the neuroprotective function of the soluble APP ectodomain sAPP��. Recombinant sAPP�� protected primary hippocampal neurons and neuroblastoma cells from cell death induced by trophic factor deprivation. This protective effect was abrogated in APP-depleted neurons, but not in APLP1-, APLP2- or IGF1-R-deficient cells, indicating that expression of holo-APP is required for sAPP��-dependent neuroprotection. Strikingly, recombinant sAPP��, APP-E1 domain and the copper-binding growth factor-like domain (GFLD) of APP were able to stimulate PI3K/Akt survival signaling in different wildtype cell models, but failed in APP-deficient cells. An ADAM10 inhibitor blocking endogenous sAPP�� secretion exacerbated neuron death in organotypic hippocampal slices subjected to metabolic stress, which could be rescued by exogenous sAPP��. Interestingly, sAPP��-dependent neuroprotection was unaffected in neurons of APP-��CT15 mice which lack the intracellular C-terminal YENPTY motif of APP. In contrast, sAPP��-dependent Akt signaling was completely abolished in APP mutant cells lacking the C-terminal G-protein interaction motif and by specifically blocking Gi/o-dependent signaling with pertussis toxin. Collectively, the present thesis provides new mechanistic insights into the physiological role of APP: the data suggest that cell surface APP mediates sAPP��-induced neuroprotection via Go-protein-coupled activation of the Akt pathway.