Identifizierung und Charakterisierung cis regulatorischer Elemente des humanen Gens für Keratin 20 in vitro und im transgenen Mausmodell

ZusammenfassungKeratin 20 (K20) ist ein Intermediärfilament, das als Strukturelement in den Epithelien des Intestinaltrakts und den Merkelzellen der Haut exprimiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene K20 Expressionsvektoren generiert, mit denen regulatorische Elemente des humanen Gens für K20 charakterisiert wurden. Analysiert wurde der Bereich von –4,8 kb bzw. –21,5 kb bis 12,9 kb vom Transkriptionsstart. Die Vektoren, welche die Sequenz von –21,5 kb bis 12,9 kb umfassten, konnten die Expression des EGFP Reportergens in HT-29 Zellen signifikant steigern. Zwei Enhancer-Elemente zwischen –21,5 und –18,4 kb bzw. –18,4 und –14,9 kb verstärkten die Expression der Reporterkonstrukte in vitro signifikant. Die Analyse der Vektoren in transgenen Mäusen zeigte, dass diese das Transgen gewebespezifisch exprimieren. Mit dem Bereich von –4,8 kb bis 12,9 kb ließ sich transgenspezifische mRNA Expression in intestinalen Geweben mittels RT-PCR nachweisen. Die Verwendung der Sequenz von –21,5 kb bis 21,8 kb steigerte die Expression in vivo nicht weiter.Für die gewebespezifische Expression des K20 Vektors reicht die 4,8 kb 5´upstream Sequenz aus, der Bereich bis –21,5 kb verstärkt die Expression in vitro, allerdings fehlen für die starke gewebespezifische Expression von Transgenen in vivo noch weitere Kontrollelemente.

Cis- und trans-Regulation bei Drosophila-T-Box-Genen

Die räumliche und zeitliche Organisation von Genexpression ist für die Entwicklung und das Funktionieren eines jeden Lebewesens von immenser Bedeutung. Dazu laufen eine Vielzahl von Regulationsprozessen auf unterschiedlichen Ebenen ab. In dieser Arbeit wurden im ersten Teil Untersuchungen zur Genregulation des Drosophila optomotor-blind Genes und zur Funktion des Omb Proteins durchgeführt. Eine Mutante, der ein großer Teil der upstream regulatory region (URR) fehlt wurde erzeugt, aus einer Vielzahl von Linien isoliert und molekular charakterisiert. Die biologischen Auswirkungen dieser Deletion werden in Shen et al. (2008) beschrieben. Plasmide zur Erzeugung transgener Fliegen, mit deren Hilfe eine bereits von Sivasankaran et al. (2000) durchgeführte Enhancer-reporter-Analyse vervollständigt werden sollte, wurden hergestellt. Die bereits bekannte Inversion In(1)ombH31 wurde molekular kartiert. Eine Reihe von Konstrukten mit Punktmutationen in der Omb T-Domäne wurden generiert, die unter anderem über deren Funktion hinsichtlich DNA-Protein Interaktion und einer potentiellen Metallionenbindefähigkeit (ATCUN) hin Aufschluss geben sollen. Des Weiteren wurde eine Reihe von P-Element-Deletionslinien auf den Verlust eines alternativen omb Transkriptionsstartpunktes hin untersucht, mit dem Ziel eine vollständige Protein-Nullmutante zur Verfügung zu haben. Der zweite Abschnitt dieser Arbeit befasste sich mit der Erzeugung von Dpp-GFP-Fusionskonstrukten, mit deren Hilfe weitere Erkenntnisse über den Dpp-Langstreckentransport erhofft werden. Es wurde außerdem damit begonnen bei einem weitern Drosophila T-Box Transkriptionsfaktor, Optomotor-blind related gene-1 (Org-1), eine Reihe von Varianten mit homopolymeren polyAlanin und polyGlutamin Expansionen unterschiedlicher Länge herzustellen. Durch Experimente mit diesen Konstrukten soll Aufschluss darüber gewonnen werden, ob Glutamin-Expansionen, wie in der Literatur vorgeschlagen, aktivierend und Alanin-Expansionen in Transkriptionsfaktoren vielleicht reprimierend auf Genaktivität wirken. Letztlich wurden in dieser Arbeit im Rahmen des DROSDEL Projektes (Ryder et al., 2004, 2007) Deletionen in der distalen Hälfte des Chromosomenarms 3R hergestellt. Der DROSDEL Deletionskit, der durch eine Kooperation europäischer Labore entstand stellt der Drosophila Forschung einen umfassenden Satz molekular basengenau definierter Defizienzen zur Verfügung.

cis-Regulation des Drosophila-melanogaster-Gens optomotor-blind

Die zeitliche und räumliche Expression von Genen trägt zu einem entscheidenden Ausmaß zu der Entwicklung eines Organismus bei. Unter vielen Faktoren spielt dabei die transkriptionelle Regulation eine wichtige Rolle. Diese basiert auf Anwesenheit und Binden von regulatorischen Proteinen an cis-regulatorischen Sequenzen (CRMs) und deren Einfluss auf die Transkriptionsmaschinerie am Promotor. Veränderungen der CRMs können zu Veränderungen der Genexpression führen, und somit einen Beitrag zur morphologischen Evolution leisten. rnIn dieser Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation des Drosophila melanogaster Gens optomotor-blind insbesondere in den pupalen Tergiten untersucht. In einem Enhancer-Reporter screen wurde eine regulatorische Region in Intron IV, die Reportergen-Expression in den pupalen Tergiten treibt, identifiziert. Große Teile dieser Region (ombTU10 und ombTU11) trieben Reportergen-Expression in einem omb-ähnlichen Muster. Eine weitere Region (ombTU12) trieb Expression in einem für Hh-Zielgene typischen Expressionsmuster. Für ombTU12 konnte eine Hh-Abhängigkeit nachgewiesen werden. Die für Hh-Zielgene typische Enhanceraktivität konnte in dem Subfragment ombTU12Amin lokalisiert werden, welches zwei konservierte Bindestellen des Effektors der Hh-Signaltransduktionskaskase, Cubitus interruptus (Ci), enthält. Eine deutliche Abhängigkeit der Expression dieses Fragments von den Ci-Bindestellen konnte bisher aber noch nicht nachgewiesen werden.rnDeletionen verschiedener Bereiche dieser Tergitenenhancer-Region aus dem endogenen Gen sollten Aufschluss über deren Notwendigkeit in der Regulation von omb geben. Die Deletion des Fragments ombTU10 (ΔombTU10-2) führte zu einer Variabilität in der Pigmentierung der Abdominalsegmente A5 und A6 der Weibchen. Eine Deletion von Teilen des hh-responsiven Fragments ombTU12 (ΔombTU12A) zeigte keinen abdominalen Phänotyp. Dies deutet auf eine redundante Wirkung der Fragmente untereinander, oder mit einem weiteren bisher nicht identifizierten Tergitenenhancer im omb-Locus hin.rnFragmente, die in den pupalen Tergiten Reportergen-Expression trieben, waren zum Teil auch in Imaginalscheiben von Larven aktiv. Desweiteren wurde gezeigt, dass Fragmente, die in Isolation Reportergen-Expression trieben, als Fusionskonstrukt mit benachbarten genomischen Sequenzen keine Expression zeigten und somit im genomischen Kontext inaktiv sein können. Demzufolge sind nicht nur Aktivator- sondern auch Repressorregionen für die korrekte Expression eines Gens von Bedeutung.rnDie Analyse von omb Enhancer-Trap Insertionen zeigte, dass von drei untersuchten Typen (PlacW, PGalW und PGawB) nur Insertionen vom letzteren in den pupalen Tergiten aktiv waren. Von vier PGawB Insertionen waren nur drei aktiv. Es ist denkbar, dass die Orientierung der inaktiven Insertion für die mangelnde Responsivität verantwortlich ist.rn

Kaiso und CTCF regulieren geprägte Gene in cis und in trans

Geprägte Gene besitzen die Besonderheit, dass sie jeweils nur von einem Allel exprimiert werden und in der Regel in Imprinting Clustern (ICs) im Genom vorliegen. Bei der Regulation in solchen ICs spielen differentiell methylierte Imprinting Kontrollregionen (ICRs) und dort stattfindende Proteinbindungen eine wichtige Rolle. Die essentielle Bedeutung der CTCF-Bindung an die ICR1 in 11p15.5 für die Expressionsregulation der geprägten Gene H19 und IGF2 ist bereits bekannt. In der vorliegenden Arbeit sollte die Bindung von Kaiso an die unmethylierte ICR1 bei humanen Zellen mit maternaler uniparentaler Disomie von 11p15 (upd(11p15)mat) nachgewiesen und die genaue Bindungsverteilung von Kaiso und CTCF in den B-Repeats der Kontrollregion bestimmt werden. Cis-regulatorische und chromosomenübergreifende transkriptionelle Effekte der ICR1-Proteinbindungen sollten dann durch qPCR-Analysen geprägter Gene bei Zellen mit maternaler und paternaler upd(11p15) und nach siRNA-basierter Herunterregulation der beiden Proteine in Zellen mit upd(11p15)mat analysiert werden. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass Kaiso an die unmethylierte ICR1 bindet. Dabei kann zumindest von einer Bindestellennutzung in der distalen ICR1-Hälfte ausgegangen werden. Für CTCF hingegen wurde eine Nutzung aller analysierten Repeats in beiden ICR1-Hälften gefunden. In der maternalen bzw. paternalen upd(11p15) entspricht die Expression der 11p15.5-Gene IGF2, H19, CDKN1C und KCNQ1OT1 dem jeweiligen Disomie-Status. Von den nicht auf Chromosom 11 gelegenen geprägten Genen zeigen MEST und PLAGL1 bei Zellen mit upd(11p15)pat sowie PEG3 und GRB10 bei der upd(11p15)mat eine stärkere Expression. Ein CTCF-knockdown in Zellen mit upd(11p15)mat führt zur IGF2-Expressionssteigerung. Dies tritt in noch stärkerem Maße beim knockdown von Kaiso auf, wobei hier zusätzlich eine gesteigerte Expression von H19 vorliegt. Des Weiteren findet man beim CTCF-knockdown einen MEST-Expressionsanstieg und beim Kaiso-knockdown gesteigerte Expressionen der Gene PEG3, GRB10 und PLAGL1. Damit lassen sich sowohl eigenständige cis-regulatorische Effekte der ICR1-Bindung beider Proteine auf geprägte Gene des IC1 als auch chromosomenübergreifende Effekte erkennen. Vor allem die starken H19-Expressionsanstiege beim Kaiso-knockdown treten korrelierend mit Veränderungen von geprägten Genen anderer Chromosomen auf. Damit unterstützen die Daten die Theorie, dass die Expressionsregulation geprägter Gene koordiniert in einer Art Netzwerk stattfinden könnte und dabei bestimmte Faktoren wie H19 und PLAGL1 eine übergeordnete Regulatorfunktion besitzen, wie es in Vergangenheit in der Maus beschrieben wurde. Die Expressionsanalysen von PLAGL1 und MEST deuten darüber hinaus durch ihre tendenziell übereinstimmenden Werte bei der paternalen upd mit hypermethylierter ICR1 und den knockdowns auf die Existenz von Chromatin-Interaktionen zwischen der ICR1 und Abschnitten auf den Chromosomen 6 und 7 hin, ggf. mit einem entsprechenden lokalen Effekt der Proteine in diesen Loci. Proteinbindungen an die maternale ICR1 scheinen damit sowohl cis-regulatorisch die Transkription der geprägten Gene IGF2 und H19 zu beeinflussen als auch durch die H19-Expression ein funktionelles Netzwerk geprägter Gene als trans-Faktor zu regulieren und für Interaktionen zwischen verschiedenen Chromosomen mit transkriptionsregulierender Wirkung verantwortlich zu sein.