Identifizierung und Charakterisierung cis regulatorischer Elemente des humanen Gens für Keratin 20 in vitro und im transgenen Mausmodell

ZusammenfassungKeratin 20 (K20) ist ein Intermediärfilament, das als Strukturelement in den Epithelien des Intestinaltrakts und den Merkelzellen der Haut exprimiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene K20 Expressionsvektoren generiert, mit denen regulatorische Elemente des humanen Gens für K20 charakterisiert wurden. Analysiert wurde der Bereich von –4,8 kb bzw. –21,5 kb bis 12,9 kb vom Transkriptionsstart. Die Vektoren, welche die Sequenz von –21,5 kb bis 12,9 kb umfassten, konnten die Expression des EGFP Reportergens in HT-29 Zellen signifikant steigern. Zwei Enhancer-Elemente zwischen –21,5 und –18,4 kb bzw. –18,4 und –14,9 kb verstärkten die Expression der Reporterkonstrukte in vitro signifikant. Die Analyse der Vektoren in transgenen Mäusen zeigte, dass diese das Transgen gewebespezifisch exprimieren. Mit dem Bereich von –4,8 kb bis 12,9 kb ließ sich transgenspezifische mRNA Expression in intestinalen Geweben mittels RT-PCR nachweisen. Die Verwendung der Sequenz von –21,5 kb bis 21,8 kb steigerte die Expression in vivo nicht weiter.Für die gewebespezifische Expression des K20 Vektors reicht die 4,8 kb 5´upstream Sequenz aus, der Bereich bis –21,5 kb verstärkt die Expression in vitro, allerdings fehlen für die starke gewebespezifische Expression von Transgenen in vivo noch weitere Kontrollelemente.

AbstractThe Keratin 20 gene (K20) is active in gastrointestinal mucosa in postmitotic enterocytes and in merkel cells of the skin. In order to characterize regulatory elements in the K20 gene fragments were analyzed spanning from –4.8 kb and –21.5 kb of the 5´-upstream region to 3.9 kb downstream of the polyadenylation signal (+12.8 kb), respectively. The latter fragment directed strong transgene expression of a reporter gene in a cell type specific manner in cultured cells. Two distinct enhancer elements were identified, located between –14.9 kb and –18.3 kb and between –18.4 kb and –21.5 kb, respectively, leading to a significant increase of reporter gene expression. When analysed in transgenic mice, the gene fragment spanning from –4.8 kb to +12.8 kb directed the expression of the transgene in a tissue specific manner. However, expression levels were low. Using the fragment spanning from –21.5 kb to 12.8 kb did not significantly enhance the level of transgene expression. Thus, the two enhancers per se are sufficient to direct strong transgene expression in cell culture but not in vivo. Additional elements must exist to enhance expression in vivo.