In vitro generation and characterization of acute myeloid leukemia-reactive CD8 + cytotoxic T-lymphocyte clones from healthy donors

Donor-derived CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) eliminating host leukemic cells mediate curative graft-versus-leukemia (GVL) reactions after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). The leukemia-reactive CTLs recognize hematopoiesis-restricted or broadly expressed minor histocompatibility and leukemia-associated peptide antigens that are presented by human leukocyte antigen (HLA) class I molecules on recipient cells. The development of allogeneic CTL therapy in acute myeloid leukemia (AML) is hampered by the poor efficiency of current techniques for generating leukemia-reactive CTLs from unprimed healthy donors in vitro. In this work, a novel allogeneic mini-mixed lymphocyte/leukemia culture (mini-MLLC) approach was established by stimulating CD8+ T cells isolated from peripheral blood of healthy donors at comparably low numbers (i.e. 10e4/well) with HLA class I-matched primary AML blasts in 96-well microtiter plates. Before culture, CD8+ T cells were immunomagnetically separated into CD62L(high)+ and CD62L(low)+/neg subsets enriched for naive/central memory and effector memory cells, respectively. The application of 96-well microtiter plates aimed at creating multiple different responder-stimulator cell compositions in order to provide for the growth of leukemia-reactive CTLs optimized culture conditions by chance. The culture medium was supplemented with interleukin (IL)-7, IL-12, and IL-15. On day 14, IL-12 was replaced by IL-2. In eight different related and unrelated donor/AML pairs with complete HLA class I match, numerous CTL populations were isolated that specifically lysed myeloid leukemias in association with various HLA-A, -B, or -C alleles. These CTLs recognized neither lymphoblastoid B cell lines of donor and patient origin nor primary B cell leukemias expressing the corresponding HLA restriction element. CTLs expressed T cell receptors of single V-beta chain families, indicating their clonality. The vast majority of CTL clones were obtained from mini-MLLCs initiated with CD8+ CD62L(high)+ cells. Using antigen-specific stimulation, multiple CTL populations were amplified to 10e8-10e10 cells within six to eight weeks. The capability of mini-MLLC derived AML-reactive CTL clones to inhibit the engraftment of human primary AML blasts was investigated in the immunodeficient nonobese diabetic/severe combined immune deficient IL-2 receptor common ��-chain deficient (NOD/SCID IL2R��null) mouse model. The leukemic engraftment in NOD/SCID IL2R��null was specifically prevented if inoculated AML blasts had been pre-incubated in vitro with AML-reactive CTLs, but not with anti-melanoma control CTLs. These results demonstrate that myeloid leukemia-specific CTL clones capable of preventing AML engraftment in mice can be rapidly isolated from CD8+ CD62L(high)+ T cells of healthy donors in vitro. The efficient generation and expansion of these CTLs by the newly established mini-MLLC approach opens the door for several potential applications. First, CTLs can be used within T cell-driven antigen identification strategies to extend the panel of molecularly defined AML antigens that are recognizable by T cells of healthy donors. Second, because these CTLs can be isolated from the stem cell donor by mini-MLLC prior to transplantation, they could be infused into AML patients as a part of the stem cell allograft, or early after transplantation when the leukemia burden is low. The capability of these T cells to expand and function in vivo might require the simultaneous administration of AML-reactive CD4+ T cells generated by a similar in vitro strategy or, less complex, the co-transfer of CD8-depleted donor lymphocytes. To prepare clinical testing, the mini-MLLC approach should now be translated into a protocol that is compatible with good manufacturing practice guidelines.

Identification of preferentially targeted tumor-associated antigens in melanoma patients via mRNA stimulation of CD8+ blood lymphocytes

Until now, therapeutic vaccination of cancer patients has mainly relied on rather few T cell epitopes processed from structurally normal shared tumor antigens and presented by frequent HLA alleles. So far the design of these studies has not addressed the individuality of tumor-host interactions, which are not only determined by the antigenic tumor phenotype or the natural HLA polymorphism, but also by the individual T cell repertoire. The procedure described herein was developed to identify the preferential targets of the individual repertoire from a panel of known shared tumor-associated antigens. Lymphocytes were isolated from the peripheral blood of cancer patients or healthy donors and stimulated twice with autologous mRNA-transfected FastDC (Dauer et al., J Immunol. 170:4069, 2003). FastDC were generated from blood monocytes and separately transfected via lipofection with in vitro transcribed mRNAs encoding the panel antigens. Responder lymphocytes were tested on day 12 in a 20-hour IFN-g ELISPOT assay for recognition of 293T cells co-transfected pairwise with plasmids encoding the stimulation antigens and the respective individual���s HLA class I alleles. In a first step, stimulation parameters were optimized for the detection of anti-HCMV pp65 responses. A maximum amplification of pp65-specific CD8+ T cell responses was obtained at a rather low IL-2 concentration (25 IU/ml) and at a minimum APC-to-effector ratio of 1:10. Addition of IL-4, IL-7 or IL-15 did not substantially improve the stimulatory potential. The test was applied to the human melanoma models D05 and MZ2, in both of which multiple T cell-defined antigens had previously been identified by expression screening. Blood lymphocytes were stimulated in parallel with autologous tumor cells and with mRNA-transfected FastDC. In D05, T cell reactivities against three out of eleven epitopes induced by stimulation with tumor cells were also found after stimulation with mRNA-transfected FastDC. Two further T cell target epitopes were identified with mRNA but not with tumor cell stimulation. In MZ2, T cell responses against five distinct epitopes were detected on day 12 after stimulation with mRNA transfectants. The same responses were detectable after stimulation with tumor cells only on day 32. mRNA stimulations against 21 tumor-associated antigens in addition to HCMV pp65 were performed in four healthy individuals. In all cases, CD8+ T cells against HCMV pp65 could be expanded. Among tumor-associated antigens, only reactivity against Melan-A/MART-1 in association with HLA-A*0201 was detectable in one of the donors. The vaccination of patients with targets a priori known to be recognized by their T cell repertoire may help to improve the outcome of therapeutic vaccination.

Studying MHC I-dependent CD8 + T cell responses in the model of murine cutaneous leishmaniasis

Der Ausheilung von Infektionen mit Leishmania major liegt die Sekretion von IFN-��� von sowohl CD4+ als auch CD8+ T Zellen zugrunde.rnAktuell konnte in der Literatur nur ein Epitop aus dem parasit��ren LACK Protein f��r eine effektive CD4+ T Zell-vermittelte Immunantwort beschrieben werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand daher darin, m��gliche MHC I abh��ngige CD8+ T Zell Antworten zu untersuchen. rnF��r diesen Ansatz wurde als erstes der Effekt einer Vakzinierung mit LACK Protein fusioniert an die Protein-Transduktionsdom��ne des HIV-1 (TAT) analysiert. Die Effektivit��t von TAT-LACK gegen��ber CD8+ T Zellen wurde mittels in vivo Protein-Vakzinierung von resistenten C57BL/6 M��usen in Depletions-Experimenten gezeigt.rnDie Prozessierung von Proteinen vor der Pr��sentation immunogener Peptide gegen��ber T Zellen ist unbedingt erforderlich. Daher wurde in dieser Arbeit die Rolle des IFN-���-induzierbaren Immunoproteasoms bei der Prozessierung von parasit��ren Proteinen und Pr��sentation von Peptiden gebunden an MHC I Molek��le durch in vivo und in vitro Experimente untersucht. Es konnte in dieser Arbeit eine Immunoproteasom-unabh��ngige Prozessierung aufgezeigt werden.rnWeiterhin wurde Parasitenlysat (SLA) von sowohl Promastigoten als auch Amastigoten fraktioniert. In weiterf��hrenden Experimenten k��nnen diese Fraktionen auf immunodominante Proteine/Peptide hin untersucht werden. rnLetztlich wurden Epitop-Vorhersagen f��r CD8+ T Zellen mittels computergest��tzer Software von beiden parasit��ren Lebensformen durchgef��hrt. 300 dieser Epitope wurden synthetisiert und werden in weiterf��hrenden Experimenten zur Charakterisierung immunogener Eigenschaften weiter verwendet. rnIn ihrer Gesamtheit tr��gt die vorliegende Arbeit wesentlich zum Verst��ndnis ��ber die komplexen Mechanismen der Prozessierung und letztendlich zur Identifikation von m��glichen CD8+ T Zell Epitopen bei. Ein detailiertes Verst��ndnis der Prozessierung von CD8+ T Zell Epitopen von Leishmania major ��ber den MHC Klasse I Weg ist von h��chster Bedeutung. Die Charakterisierung sowie die Identifikation dieser Peptide wird einen ma��geblichen Einfluss auf die weiteren Entwicklungen von Vakzinen gegen diesen bedeutenden human-pathogenen Parasiten mit sich bringen. rn

The role of B cells during acute and latent infections with murine cytomegalovirus and Leishmania major

This thesis focuses on the role of B cells in mCMV and Leishmania major infection. B cells are an essential component of the adaptive immune system and play a key role in the humoral immune response. In mCMV infection we analyzed the influence of B cells on the virus-specific CD8 T cell response, in detail the role of B cells as IL-10 secreting cells, as source of immunoglobulin (Ig) and as antigen presenting cells. In Leishmania major infection we investigated the role of Ig in Th1 and Th2 directed disease.rnWe found in mCMV infection that the B cell secreted IL-10 suppresses effectively the acute virus-specific CD8 T cell response, while the IL-10 secreted by dendritic cell has no obvious effect. Ig has no effect in the acute virus-specific CD8 T cell response, but in memory response Ig is essential. If Ig is missing the CD8 T cell population remains high in memory response 135 days post infection. The complete absence of B cells dramatically reduces the acute virus-specific CD8 T cell response, while B cell reconstitution just partially rescues this dramatic reduction. A comparison of this reduction in a B cell free organism to an organism with depleted dendritic cells gave a similar result. To exclude a malfunction of the CD8 T cells in the B cell deficient mice, the decreased virus-specific CD8 T cell population was confirmed in a B cell depletion model. Further, bone marrow chimeras with a B cell compartment deficient for CD40-/- showed a decrease of the virus-specific response and an involvement of CD40 on B cells. Taken together these results suggest a role for B cells in antigen presentation during mCMV infection.rnFurther we took advantage of the altered mCMV specific CD8 T cell memory response in mice without Ig to investigate the memory inflation of CD8 T cells specific for distinct mCMV specifc peptides. Using a SIINFEKL-presenting virus system, we were able to shorten the time until the memory inflation occurs and show that direct presentation stimulates the memory inflation. rnIn Leishmania major infection, Ig of Th2 balanced BALB/c mice has a central role in preventing a systemic infection, although the ear lesions are smaller in IgMi mice without specific Ig. Here the parasite loads of ears and spleen are elevated, and an IMS-reconstitution does not affect the parasite load. In contrast in Th1 balanced C57BL/6 mice, reconstitution of IgMi mice with serum of either untreated or immunized mice decreased the parasite load of spleen and ear, further IMS treatment reduces the size of the spleen and the cytokine-levels of IL-10, IL-4, IL-2 and IFN-�� to a level comparable to wt mice. rn

Towards antibody-mediated targeting of dendritic cells for cancer immunotherapy with multivalent polymer-antigen conjugates

Der Fokus dieser Arbeit lag auf der definierten Synthese multifunktioneller Polymer-Konjugate zur Anwendung in der Krebs-Immunotherapie. Durch gezielte Variation der Kon-jugationsbedingungen wurde Zusammensetzung, Gr����e und Aggregationsverhalten in Zell-medium sowie in humanem Serum untersucht. Nach definierter physikalisch-chemischer Charakterisierung wurde dann die induzierte Antigen-Pr��sentation zur Aktivierung der T-Zellproliferation analysiert.rnDaf��r wurden zwei verschiedene polymere Carrier-Systeme gew��hlt, lineares Poly-L-lysin und eine Polylysinb��rste (PLL-B��rste). Es wird vermutet, dass die PLL-B��rste aufgrund der anisotropen Form eine bessere Verteilung im K��rper und eine verl��ngerte Zirkulationsdauer zeigen wird. Die zu konjugierenden biologisch aktiven Komponenten waren der antiDEC205-Antik��rper (aDEC205) f��r die gezielte Adressierung CD8-positiver dendritischer Zellen (DC), ein Ovalbumin (OVA)-spezifisches Antigen mit der Kernsequenz SIINFEKL f��r die Spezifit��t der Immunantwort gegen Krebszellen, die dieses Antigen tragen, und ein immunaktivieren-der TLR9-Ligand, CpG1826. Die Effizienz dieses Konjugates dendritische Zellen zu aktivieren, welche wiederum eine Immunantwort gegen OVA-exprimierende Krebszellen induzieren, wurde durch die Konjugation aller Komponenten am identischen Tr��germolek��l deutlich h��her erwartet.rnLineares Poly-L-lysin diente als Modellsystem um die Konjugationschemie zu etablieren und dann auf die zylindrische Polylysinb��rste zu ��bertragen. Anhand dieser polymeren Tr��ger wurde das Verhalten der verschiedenen Topologien des Kn��uels und der B��rste im Hinblick auf den Einfluss struktureller Unterschiede sowohl auf Konjugationsreaktionen als auch auf das in situ und in vitro Verhalten untersucht.rnFluoreszenzmarkiertes Antigen und der CpG Aktivator konnten jeweils aufgrund einer Thiol-Modifizierung an die Thiol-reaktive Maleimidgruppe des heterobifunktionellen Linkers Sulfo-SMCC an PLL-AlexaFluor48 konjugiert werden. Anschlie��end wurde aDEC205-AlexaFluor647 an PLL gekoppelt, entweder durch Schiff Base-Reaktion des oxidierten Antik��rpers mit PLL und anschlie��ender Reduzierung oder durch Click-Reaktion des PEG-Azids modifizierten An-tik��rpers mit Dicyclobenzylcyclooctin (DIBO)-funktionalisiertem PLL. Die Konjugation der biologisch aktiven Komponenten wurde mit Durchflusszytometrie (FACS) und konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) untersucht und die Zusammensetzung des Konjugatesrnmittels UV/Vis-Spektroskopie bestimmt. Die PLL-B��rste alleine zeigte eine hohe Zytotoxizit��t bei HeLa und JAWS II Zelllinien, wohingegen lineares PLL und PLL-Konjugate sowie die PLL B��rsten-Konjugate keine ausgepr��gte Zytotoxizit��t aufwiesen. Die Polymer-Konjugate wie-sen keine Aggregation in Zellmedium oder humanem Serum auf, was mittels winkelabh��ngi-ger dynamischer Lichtstreuung bestimmt wurde. CLSM Aufnahmen zeigten Kolokalisation der an die einzelnen Komponenten gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe in dendritischen Zel-len, was die erfolgreiche Konjugation und Internalisierung der Konjugate in die Zellen bele-gen konnte. FACS Messungen ergaben eine geringf��gig erh��hte Aufnahme des adressierten PLL-Antigen-Antik��rper-Konjugates verglichen mit dem PLL-Antigen-Konjugat. Experimente mit dem ���Specific Hybridization Internalization Sensor��� (SHIP) zeigten jedoch nur Aufnahme der PLL-Konjugate in CD8+ unreife DC, nicht in reife DC, die nicht mehr unspezifisch, sondern nur noch ��ber Rezeptoren internalisieren. Dies bewies die unspezifische Aufnahme des Kon-jugates, da Antik��rper-Konjugation keine Rezeptor-vermittelte Endozytose in reife DC indu-zieren konnte. T-Zell-Proliferationsassays ergaben eine Aktivierung von CD8+ T-Zellen indu-ziert durch Antigen-tragende Konjugate, wohingegen Konjugate ohne Antigen als Negativ-kontrollen dienten und keine T-Zell-Proliferation erzielten. Es konnte jedoch kein Unter-schied zwischen adressierten und nicht adressierten Konjugaten aufgrund der unspezifischen Aufnahme durch das Polymer beobachtet werden. L��sliches SIINFEKL alleine bewirkte schon bei geringeren Konzentrationen eine T-Zell-Proliferation.rnEs war somit m��glich, drei biologischen Komponenten an einen polymeren Tr��ger zu konju-gieren und diese Konjugate im Hinblick auf Zusammensetzung, Gr����e, Internalisierung in dendritische Zellen und Aktivierung der T-Zell-Proliferation zu untersuchen. Au��erdem wur-de die Konjugationschemie erfolgreich von dem Modellsystem des linearen PLL auf die PLL-B��rste ��bertragen. Die Polymer-Konjugate werde unspezifisch in DC aufgenommen und in-duzieren T-Zellproliferation, die mit Antigen-Pr��sentationsassays nachgewiesen wird. Es konnte jedoch durch Konjugation des Antik��rpers keine Rezeptor-vermittelte Aufnahme in CD8+ DC erzielt werden.rnDiese Studien stellen einen erfolgsversprechenden ersten Schritt zur Entwicklung neuer Na-nomaterialien f��r die Anwendung in Krebs-Immuntherapie dar.

CD137-selektierte leuk��miereaktive T-Zellen gesunder Spender zur adoptiven Immuntherapie stammzelltransplantierter Leuk��miepatienten = CD137-selected leukaemia-reactive T Cells from healthy donors for adoptive immunotherapy in stem-cell-transplanted leukaemia-patients

Bei stammzelltransplantierten Patienten, die ein Rezidiv ihrer Leuk��mie erleiden, kann eine Donor-Lymphozyten-Infusion (DLI) dauerhafte vollst��ndige Leuk��mieremissionen induzieren. T-Zellen in der DLI vermitteln sowohl den potentiell kurativen Graft-versus-Leukaemia (GVL) Effekt, als auch die potentiell lebensbedrohliche Graft-versus-Host Disease (GVHD). Hingegen k��nnte die Infusion von leuk��miereaktiven T-Zellen einen selektiven GVL Effekt und einen Langzeitschutz vor Rezidiven durch eine spezifisch gegen die Leuk��mie gerichtete Immunantwort und Immunit��t vermitteln. Unsere Arbeitsgruppe hat Protokolle zur in vitro Generierung leuk��miereaktiver T-Zellen entwickelt, die hohe zytotoxische Aktivit��t gegen akute myeloische Leuk��mie-Blasten (AML) bei minimaler Reaktion auf m��gliche GVHD Zielstrukturen zeigen. F��r die klinische Anwendung sind diese Protokolle jedoch zu aufw��ndig, wobei vor allem eine erhebliche Verk��rzung der Kulturzeit auf wenige Wochen erforderlich ist. Diese Verk��rzung der in vitro Kulturzeit k��nnte das Wachstum von T-Zellen vom central memory oder fr��hen effector memory Ph��notyp f��rdern, f��r die eine bessere in vivo Effektorfunktion und l��ngere Persistenz im Rezipienten verglichen mit T-Zellen aus Langzeitkultur gezeigt werden konnte. Der Aktivierungsmarker und Kostimulations-Rezeptor CD137 kann zur Erkennung und Isolation antigenspezifischer T-Zellen genutzt werden, ohne dass daf��r das von den T-Zellen erkannte Peptidepitop bekannt sein muss. Eine CD137-vermittelte Anreicherung mit Hilfe von clinical grade Materialien k��nnte verwendet werden, um DLI-Produkte mit leuk��miespezifischen T-Zellen herzustellen, die sich sowohl durch eine effizientere T-Zell Generierung durch in vitro Selektion und Kostimulation, als auch durch eine verbesserte Spezifit��t des T-Zell-Produkts auszeichnen. Lymphozyten-Leuk��mie Cokulturen (mixed lymphocyte leukaemia cultures) wurden mit CD8 T-Zellen gesunder Spender und HLA-identischen oder einzel-HLA-mismatch AML-Blasten angesetzt und w��chentlich restimuliert. Nach zwei Wochen wurden die T-Zellen 12 Stunden nach Restimulation ��ber den Marker CD137 positiv isoliert und anschlie��end separat weiterkultiviert. Die isolierten Fraktionen und unseparierten Kontrollen wurden im ELISPOT-Assay und im Chrom-Freisetzungstest an Tag 5 nach der Restimulation getestet. Es wurden keine konsistent nachweisbaren Vorteile im Hinblick auf Wachstum und Funktion der isolierten CD137-positiv Fraktion im Vergleich zur unseparierten Kontrolle gefunden. Verschiedene Isolationsmethoden, Patient-Spender-Systeme, Methoden zur Restimulation, Temperaturbedingungen, Zytokinkombinationen und Methoden der Zytokinzugabe sowie zus��tzliche Feeder-Zellen oder AML-Blasten konnten Wachstum, funktionelle Daten und die deutlichen Zellverluste w��hrend der Isolation nicht entscheidend beeinflussen. Vitalf��rbungen zeigten, dass aktivierungsinduzierter Zelltod CD137-positiver Zellen zu diesen Ergebnissen beitragen k��nnte. Im Gegensatz zur Stimulation mit AML-Blasten wurden erfolgreiche CD137-Anreicherungen f��r peptidstimulierte T-Zellen publiziert. Unterschiedliche CD137-Expressionskinetiken, aktivierungsinduzierter Zelltod und regulatorische T-Zellen sind m��gliche Faktoren aufgrund derer die CD137-Anreicherung in diesem spezifischen Kontext ungeeinet sein k��nnte. Der stimulatorische Effekt eines CD137-Signals auf AML-reaktive CD8 T-Zellen wurde mit Hilfe von CD3/CD28 und CD3/CD28/CD137 Antik��rper-beschichteten magnetischen beads untersucht. F��r Nierenzellkarzinom-reaktive T-Zellen war die Stimulation mit CD3/CD28/CD137 beads genauso effektiv wie mit Tumorzellen und effektiver als mit CD3/CD28 beads. Beide Arten von beads waren f��r eine Stimulation w��hrend der ersten Wochen der Zellkultur geeignet, sodass ein zus��tzliches CD137-Signal f��r die l��nger anhaltende Expansion tumorreaktiver T-Zellen zur klinischen Anwendung n��tzlich sein k��nnte. Die bead-Expansion ver��nderte die IFN-Sekretion im ELISPOT nicht, aber verursachte eine m����ige Verschlechterung der Zytotoxizit��t im Chrom-Freisetzungstest. Im Gegensatz dazu zeigten bei AML-reaktiven T-Zellen beide Arten von beads einen nicht apoptosevermittelten, dosisabh��ngigen zellsch��digenden Effekt, der zu einer raschen Abnahme der Zellzahl in Kulturen mit beads f��hrte. Unerw��nschte Effekte auf die T-Zell-Funktionalit��t durch bead-Stimulation sind in der Literatur beschrieben, dennoch gibt es aktuell keine Ver��ffentlichungen, die eine fundierte Erkl��rung f��r den Effekt auf AML-reaktive T-Zellen bieten k��nnten. Abgesehen von Literaturdaten, die darauf hindeuten, dass CD137 ein vielversprechendes Kandidatenmolek��l f��r die Anreicherung und Expansion von AML-reaktiven T-Zellen sein k��nnte, zeigen die eigenen Daten sowohl zur CD137-Isolation als auch zur bead-Stimulation, dass f��r diese spezielle Anwendung CD137 ein ungeeigneter Aktivierungsmarker und Kostimulations-Ligand ist.

The role of dendritic cells (DC) in Friend retrovirus-induced immunosuppression and immunotherapeutic applications of functionalized nanoparticles

Friend murine leukemia Virus (FV) infection of immunocompetent mice is a well- established model to acquire further knowledge about viral immune suppression mechanisms, with the aim to develop therapeutics against retrovirus-induced diseases. Interestingly, BALB/c mice are infected by low doses of FV and die from FV-induced erythroleukemia, while C57/BL6 mice are infected by FV only at high viral dose, and remain persistently infected for their whole life. Due to the central role of dendritic cells (DC) in the induction of anti-viral responses, we asked for their functional role in the genotype-dependent sensitivity towards FV infection. In my PhD study I showed that bone marrow (BM)-derived DC differentiated from FV-infected BM cells obtained from FV-inoculated BALB/c (FV susceptible) and C57BL/6 (FV resistant) mice showed an increased endocytotic activity and lowered expression of MHCII and of costimulatory receptors as compared with non-infected control BMDC. FV-infected BMDC from either mouse strain were partially resistant towards stimulation-induced upregulation of MHCII and costimulators, and accordingly were poor T cell stimulators in vitro and in vivo. In addition, FV-infected BMDC displayed an altered expression profile of proinflammator cytokines and favoured Th2 polarization. Ongoing work is focussed on elucidating the functional role of proteins identified as differentially expressed in FV-infected DC in a genotype-dependent manner, which therefore may contribute to the differential course of FV infection in vivo in BALB/c versus C57BL/6 mice. So far, more than 300 proteins have been identified which are differently regulated in FV-infected vs. uninfected DC from both mouse strains. One of these proteins, S100A9, was strongly upregulated specifically in BMDC derived from FV-infected C57BL/6 BM cells. S100A9-/- mice were more sensitive towards inoculation with FV than corresponding wild type (WT) mice (both C57BL/6 background), which suggests a decisive role of this factor for anti-viral defense. In addition, FV-infected S100A9-/- BMDC showed lower motility than WT DC. The future work is aimed to further elucidate the functional importance of S100A9 for DC functions. To exploit the potential of DC for immunotherapeutic applications, in another project of this PhD study the usability of different types of functionalized nanoparticles

Einfluss Zelltod-inhibierender Proteine des murinen Cytomegalovirus auf die Initiation der antiviralen CD8 T-Zellantwort

Die Inhibition des programmierten Zelltods ist ein essentieller Faktor der viralen Replikationsf��higkeit. Das murine Cytomegalovirus kodiert deshalb f��r verschiedene Zelltod-inhibierende Gene, um dem programmierten Zelltod zu entgehen bis die Virusproduktion abgeschlossen ist. Da die Expression des viralen anti-apoptotischen Gens M36 infizierte Makrophagen vor der Apoptose sch��tzt (Menard et al., 2003), wurde in der vorliegenden Arbeit unter Verwendung der Deletionsmutante mCMV-��M36 (��M36) der Einfluss von Apoptose auf das Priming Epitop-spezifischer CD8 T-Zellen untersucht.rnInteressanterweise waren die Frequenzen mCMV-spezifischer CD8 T-Zellen nach Infektion mit ��M36 f��r alle getesteten Epitope sowohl im Haplotyp H-2d als auch im Haplotyp H-2b deutlich erh��ht. Zus��tzlich konnte mit Hilfe der mCMV-ORF-Library eine Verbreiterung des CD8 T-Zellepitop-Repertoire nach Infektion mit ��M36 nachgewiesen werden, was neben der quantitativen auch eine qualitative Steigerung des CD8 T-Zell-Primings aufzeigt.rnIn der funktionellen Revertante ��M36-FADDDN wird die anti-apoptotische Funktion durch eine dominant-negative Form des zellul��ren Adapterproteins FADD (FADDDN) substituiert (Cicin-Sain et al., 2008), die das Apoptose-Signaling verhindert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Expression von FADDDN nicht nur den Apoptose-Ph��notyp wieder revertiert, sondern auch die Verbesserung des CD8 T-Zell-Primings aufhebt. Diese Beobachtung belegt eindeutig, dass das verbesserte CD8 T-Zell-Priming auf einer verst��rkten Apoptose-Induktion beruht.Bemerkenswerterweise konnte das verbesserte Priming auch nach Deletion des anti-nekroptotischen Gens M45 nachgewiesen werden. So konnte nach Infektion mit mCMV-M45-BamX (M45-BamX) (Brune et al., 2001) gezeigt werden, dass auch die Induktion der Nekroptose zu einem verbesserten CD8 T-Zell-Priming sowie zu einer Verbreiterung des CD8 T-Zellepitop-Repertoires f��hrt.Nach Infektion von Cross-Priming-defizienten 3d-M��usen (Tabeta et al., 2006) konnte eine Steigerung mCMV-spezifischer CD8 T-Zell-Frequenzen in Abwesenheit von M36 oder M45 nicht beobachtet werden. Dieser Befund l��sst auf ein erh��htes Cross-Priming von CD8 T-Zellen durch ��M36 oder M45-BamX infolge einer verst��rkten Induktion des programmierten Zelltods schlie��en.rnIn der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass die Inhibition des programmierten Zelltods durch die mCMV-Gene M36 und M45 das CD8 T-Zell-Priming limitiert. Somit f��rdern virale Zelltod-inhibierende Gene die virale Replikationsf��higkeit, indem sie die Virusproduktion per se in der individuellen Zelle steigern und zus��tzlich die Immunkontrolle reduzieren, was wiederum eine verbesserte Dissemination in vivo erm��glicht.

Mechanismen der Antigenpr��sentation bei der Induktion der CD8-T-Zellantwort gegen das murine Cytomegalovirus

Die Kontrolle der Cytomegalovirus(CMV)-Infektion durch CD8 T-Zellen ist abh��ngig von der effizienten MHC-Klasse-I-Pr��sentation viraler Peptide auf der Zelloberfl��che. Um die Erkennung infizierter Zellen zu unterdr��cken, interferieren w��hrend der Early (E)-Phase der murinen CMV (mCMV)-Infektion virale Immunevasine mit dem intrazellul��ren Transport von Peptid-MHC-I (pMHC-I) Komplexen. Den Immunevasinen gelingt es allerdings nicht, ein Priming mCMV-spezifischer CD8 T-Zellen zu verhindern. Daher wurde angenommen, dass die Initiation der antiviralen CD8 T-Zellantwort prim��r auf der Cross-Pr��sentation viraler Peptide auf nicht-infizierten, professionellen Antigen-pr��sentierenden Zellen (profAPC) beruht und damit unabh��ngig von viralen Immunevasionsmechanismen ist.rnIm Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mittels BAC-Mutagenese eine mCMV-Rekombinante generiert, um die direkte Pr��sentation viraler Peptide durch die zus��tzliche Expression des zentralen Immunevasins m152 bereits in der Immediate Early (IE)-Phase verst��rkt zu unterdr��cken. Wie erwartet reduzierte die verst��rkte m152-Expression sowohl in der IE- als auch in der E-Phase die pMHC-I-Pr��sentation in vitro. Dies f��hrte ��berraschenderweise nach Infektion immunkompetenter BALB/c-M��use (Haplotyp H-2d) zu einer verminderten CD8 T-Zellantwort und damit zur Verschlechterung der Kontrolle der Infektion im drainierenden Lymphknoten. Diese Beobachtungen weisen erstmals auf einen wichtigen Beitrag der direkten Antigenpr��sentation bei der Initiation der mCMV-spezifischen CD8 T-Zellantwort im immunkompetenten Wirt hin. Zus��tzlich konnte auch nach mCMV-Infektion von Cross-Pr��sentations-defizienten M��usen (Haplotyp H-2b) eine antivirale CD8 T-Zellantwort initiiert werden. Diese Beobachtung best��tigt, dass durch direkte Antigenpr��sentation auf infizierten profAPC trotz viraler Immunevasionsmechanismen eine CD8 T-Zellantwort induziert werden kann. Allerdings wurde weder die antivirale CD8 T-Zellantwort noch die Kontrolle der Infektion im Haplotyp H-2b durch die verst��rkte m152-Expression moduliert.rnIn einem weiteren Teil der Arbeit konnte im klinisch relevanten Modellsystem der mCMV-Infektion von Knochenmarktransplantations (KMT)-Rezipienten (Haplotyp H-2d) gezeigt werden, dass die verst��rkte m152-Expression die Rekrutierung IE1-spezifischer CD8 T-Zellen in die infizierte Lunge unterdr��ckt. Dies konnte sowohl fr��h nach Infektion, als auch w��hrend der viralen Latenz nachgewiesen werden. Zus��tzlich war die Rekrutierung IE1-spezifischer CD8 T-Zellen in die Lunge deutlich vermindert in Ld--Rezipienten von Ld+-h��matopoetischen Zellen, die das IE1-pr��sentierende MHC-I-Molek��l Ld nicht auf den nicht-h��matopoetischen Gewebszellen exprimieren. Diese Beobachtungen zeigen, dass die Rekrutierung antiviraler CD8 T-Zellen in ein peripheres Organ von der direkten Antigenpr��sentation auf nicht-h��matopoetischen, infizierten Gewebszellen bestimmt wird.rnIn der vorliegenden Arbeit konnte somit erstmals gezeigt werden, dass trotz viraler Immunevasionsmechanismen nach mCMV-Infektion des immunkompetenten Wirtes und des KMT-Rezipienten die antivirale CD8 T-Zellantwort von der direkten Antigenpr��sentation bestimmt wird.

Generation and characterisation of acute myeloid leukaemia-reactive CD4 + T cells and their potential to eliminate human leukaemia blasts in NSG mice

Acute myeloid leukaemia (AML) is a cancer of the haematopoietic system, which can in many cases only be cured by haematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and donor lymphocyte infusion (DLI) (Burnett et al., 2011). This therapy is associated with the beneficial graft-versus-leukaemia (GvL) effect mediated by transplanted donor T and NK cells that either recognise mismatch HLA molecules or polymorphic peptides, so-called minor histocompatibility antigens, leukaemia-associated or leukaemia-specific antigens in the patient and thus eliminate remaining leukaemic blasts. Nevertheless, the mature donor-derived cells often trigger graft-versus-host disease (GvHD), leading to severe damages in patients��� epithelial tissue, mainly skin, liver and intestine (Bleakley & Riddell, 2004). Therefore, approaches for the selective mediation of strong GvL effects are needed, also in order to prevent relapse after transplantation. One promising opportunity is the in vitro generation of AML-reactive CD4+ T cells for adoptive transfer. CD4+ T cells are advantageous compared to CD8+ T cells, as HLA class II molecules are under non-inflammatory conditions only expressed on haematopoietic cells; a fact that would minimise GvHD (Klein & Sato, 2000). In this study, naive CD4+ T cells were isolated from healthy donors and were successfully stimulated against primary AML blasts in mini-mixed lymphocyte/leukaemia cell cultures (mini-MLLC) in eight patient/donor pairs. After three to seven weekly restimulations, T cells were shown to produce TH1 type cytokines and to be partially of monoclonal origin according to their TCR V�� chain usage. Furthermore, they exhibited lytic activity towards AML blasts, which was mediated by the release of granzymes A and B and perforin. The patient/donor pairs used in this study were fully HLA-class I matched, except for one pair, and also matched for HLA-DR and -DQ, whereas -DP was mismatched in one or both alleles, reflecting the actual donor selection procedure in the clinic (Begovich et al., 1992). Antibody blocking experiments suggested that the generated CD4+ T cells were directed against the HLA-DP mismatches, which could be confirmed by the recognition of donor-derived lymphoblastoid cell lines (LCLs) electroporated with the mismatched DP alleles. Under non-inflammatory conditions primary fibroblasts did not express HLA-DP and were thus not recognised, supporting the idea of a safer application of CD4+ T cells regarding induction of GvHD. For the assessment of the biological significance of these T cells, they were adoptively transferred into NSG mice engrafted with human AML blasts, where they migrated to the bone marrow and lymphoid tissue and succeeded in eliminating the leukaemic burden after only one week. Therefore, AML-reactive CD4+ T cells expanded from the naive compartment by in vitro stimulation with primary leukaemia blasts appear to be a potent tool for DLI in HSCT patients and promise to mediate specific GvL effects without causing GvHD.

Optimierte biologische Aktivit��t allo- und tumorreaktiver CD8-+-T-Lymphozyten im humanisierten Mausmodell durch IL-15-Superagonisten

Interleukin 15 (IL-15) gilt als eines der vielversprechendsten zuk��nftigen Medikamente f��r die Krebstherapie. Es f��rdert die Proliferation, Persistenz und Funktion von CD8+ T-Zellen und vermittelt zahlreiche Effekte, die es als ��berlegene Alternative f��r das derzeit in der Klinik verwendete IL-2 erscheinen lassen. F��r den Einsatz von IL-15 in der vorliegenden Arbeit wurde zun��chst ein Protokoll zur Herstellung von rekombinantem IL-15 in E. coli etabliert. Das hergestellte Protein hatte eine zu kommerziellen Produkten vergleichbare Bioaktivit��t und beg��nstigte die Persistenz und Aktivit��t antigenspezifischer, humaner CD8+ T Zellen nach adoptivem Transfer in NSG-M��use, wobei unter anderem ein verst��rkter Effekt auf T Zellen mit TSCM-Ph��notyp beobachtet wurde. Um die Bioaktivit��t von IL-15 zu steigern, wurden super-agonistische IL-15-Fusions��proteine entworfen und im Expi293-System hergestellt. Dabei wurde IL 15 kovalent mit der Sushi-Dom��ne, der IL-15R��-Kette und einer IgG1-Fc-Dom��ne verbunden, was zu einer gesteigerten Affinit��t der IL 15-Superagonisten zum physiologischen, niederaffinen IL 15R���� und zu einer stark erh��hten Halbwertszeit in Mausserum f��hrte. Die gesteigerte Affinit��t der IL-15-Super��agonisten wurde durch die IL 15R��-Sushi-Dom��ne vermittelt. Eine um 13 Amino��s��uren verl��ngerte Sushi-Dom��ne zeigte im Vergleich zur normalen Form eine nochmals ge��steigerte Affinit��t. Die l��ngere Halbwertszeit wurde von der Sushi- und der IgG1-Fc-Dom��ne vermittelt. Die IgG1-Fc-Dom��ne verst��rkte die Wirkung der Fusionsproteine zus��tzlich ��ber einen Mechanismus, der wahrscheinlich mit der Transpr��sentation durch Fc Re��ze��ptoren zusammen���h��ngt. Die gesteigerte Bioaktivit��t der IL-15-Superagonisten wurde im Tiermodell mit humanen und murinen T-Zellen best��tigt und ILR13+-Fc wurde als das Fusionsprotein mit der h��chsten Bioaktivit��t identifiziert. Im Vergleich zu anderen IL-15-Superagonisten vereint es alle derzeit bekannten Eigenschaften zur Bioaktivit��tssteigerung in einem einzigen Protein. In therapeutischen Versuchen mit adoptivem Transfer tumorreaktiver T-Zellen konnte der Antitumoreffekt durch ILR13+-Fc ma��geblich verst��rkt werden. Als Modellsysteme wurden NSG-M��use, die mit humanen AML-Blasten oder einem soliden Ovarialkarzinom engraftet wurden, verwendet. Dabei wurden sowohl antigenspezifische als auch unspezifische Effekte beobachtet. Die unspezifischen Effekte wurden wahrscheinlich durch eine ILR13+-Fc-vermittelte ��berexpression von NKG2D, einem Rezeptor der angeborenen Immunantwort, auf den adoptiv transferierten T Zellen vermittelt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass IL-15 und die IL-15-Superagonisten die Proliferation und Reaktivit��t von CD8+ T-Zellen im Rahmen der Immuntherapie f��rdern k��nnen. Aufgrund der hohen Bioaktivit��t und potenzierten Wirksamkeit, k��nnten vor allem die IL 15-Superagonisten in Zukunft bei der Entwicklung effizienter Therapiemethoden eingesetzt werden und dadurch einen wichtigen Beitrag zu Behandlung von Krebs leisten. rnrn

Transkriptionelle Regulation des humanen Interferon-gamma-Promotors in T-Lymphocyten

Interferon-gamma is mainly produced by activated T helper cells and cytotoxic T lymphocytes and sustains the immune-defense against viral and bacterial infections. For a better understanding of IFN-gamma promoter regulation in T cells, different DNA-binding motivs were examined. Hereby, a new motiv (-196 to -183) was identified, that binds to the transcription factor AP-1 in T helper cells and Jurkat T cells. This factor acts as an essential activator protein. Further investigation demonstrated that IL-12 and IL-18 induce different regulatory pathways. Both AP-1 and STAT-4 bindings at their cognate DNA elements (-196 to -183 and -224 to -215) are required for the IL-12 dependent activation whereas IL-18 causes direct activation via AP-1.Moreover, the TH2 cytokine IL-4 represses significantly the IFN-gamma promoter activity in CD4+ T cells. IL-4 induces GATA-3, that interacts with two DNA-motivs (-111 to -87) at the IFN-gamma promoter.Furthermore, transgenic mice were generated, yielding a human IFN-gamma promoter construct (410 bp) under the control of a luciferase reporter gene. The data demonstrated a specific IFN-gamma promoter activation by antiCD3 plus antiCD28 in CD4+ and CD8+ T cells. The luciferase activty in CD4+ T cells was reinforced by addition of IL-12 and IL-18 and repressed by IL-4.

Beeinflussung der menschlichen allergischen Immunantwort durch Allergen-DNA-transfizierte dendritische Zellen

Immunreaktionen gegen Antigene k��nnen eine zellul��re Immunantwort, eingeleitet durch TH1-Zellen induzieren oder aber eine antik��rpervermittelte humorale Immunantwort induzieren, die von Zellen des TH2-Typs bestimmt sind. Diese unterschiedlichen Immunreaktionen regulieren sich gegenseitig, indem sie sich wechselseitig unterdr��cken. Dadurch stellt sich ein Gleichgewicht zwischen den TH1- und TH2-Immunantworten ein. Die Allergie vom Soforttyp ist TH2-dominiert und wird ausgel��st durch die Produktion spezifischer IgE-Antik��rper gegen eigentlich harmlose Antigene. Durch die fr��he Aussch��ttung des Zytokins IL-4 von T-Zellen differenzieren naive allergenspezifische T-Zellen zu TH2-Zellen aus. Diese sezernieren dann ebenfalls IL-4 und auch IL-13, was die B-Zellen zu einer vermehrten Produktion von IgE-Molek��len stimuliert. IgE bindet an den hochaffinen IgE-Rezeptor auf Mastzellen, Basophilen und Eosinophilen. Bei weiterem Allergenkontakt kommt es durch Kreuzvernetzung der Fc���-Rezeptoren zur Aussch��ttung vo

Generierung und Charakterisierung von rekombinanten Cytomegaloviren mit Punktmutationen in antigenen Peptiden

Die Kontrolle der produktiven Cytomegalovirus- (CMV) Infektion ist von der effizienten Rekonstitution antiviraler CD8 T-Zellen abh��ngig. Dies f��hrt jedoch nicht zur vollst��ndigen Eliminierung des viralen Genoms aus den Zielorganen, sondern das Virus verbleibt in einem nicht-replikativen Zustand: der Latenz. Es ist bekannt, dass w��hrend der Latenz nur ein geringer Anteil latenter mCMV-Genome in der Lunge die Major Immediate Early (MIE) Gene ie1 und ie2 exprimiert, die Latenz aber dennoch bestehen bleibt, weil das differentielle Splicing des prim��ren IE1/3-Transkripts zum Transaktivator-Transkript IE3 nicht erfolgt. Damit war neben der Initiation der IE-Genexpression am MIE-Promotor-Enhancer das IE1/3-Splicing als zweiter molekularer Latenz-Kontrollpunkt identifiziert. Parallel zur Latenz-assoziierten IE1-Genexpression sind in der Lunge aktivierte CD62L-low CD8 T-Zellen mit Spezifit��t f��r das immundominante IE1-Peptid 168-YPHFMPTNL-176 angereichert. Dies legte die Hypothese nahe, dass neben der molekularen Kontrolle der Latenz auch eine immunologische Kontrolle, beispielsweise durch IE1-Epitop-spezifische CD8 T-Zellen besteht. Zur Evaluierung dieser Hypothese wurde in der vorliegenden Arbeit mittels BAC-Mutagenese erstmals ein rekombinantes mCMV generiert, in dem das IE1-Peptid durch Punktmutation der C-terminalen MHC-Ankeraminos��ure L176A zerst��rt ist. Dazu musste zun��chst die Technik der BAC-Mutagenese herpesviraler Genome (in Anlehnung an die publizierten Arbeiten von Messerle et al., 1997; Borst et al., 1999, 2004; Wagner et al., 1999) in der Arbeitsgruppe etabliert werden. Neben der Funktionsverlust-Mutante (mCMV-IE1-L176A) wurden zur Kontrolle zwei Revertanten (mCMV-IE1-A176L und mCMV-IE1-A176L*) generiert. In letzterer, als Wobble-Revertante bezeichnet, wird wieder die authentische MHC-Ankeraminos��ure L eingesetzt, es verbleibt aber ein singul��rer Nukleotidaustausch A->T in der Wobble-Position des Codons als Marker zur Unterscheidung zum WT-mCMV zur��ck. Der immunologische Ph��notyp der Funktionsverlust-Mutante, also die funktionelle Ausl��schung des antigenen IE1-Peptids im Priming einer CD8 T-Zell-Antwort, entsprach der Erwartung. Entsprechend konnte nach Infektion mit der Funktionsverlust-Mutante keine Reaktivit��t gegen das IE1-Peptid nachgewiesen werden. In den Revertanten hingegen war die Erkennung des IE1-Peptids wieder hergestellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen weiter, dass die Funktionsverlust-Mutante sowie die Revertanten ohne signifikante Beeinflussung in vitro in permissiven Fibroblasten und in vivo in verschiedenen Geweben replizieren. Wie aktuelle Daten nach Knochenmarktransplantation und Infektion mit der Funktionsverlust-Mutante im Vergleich zu den Revertanten zeigen, ist die Frequenz Latenz-assoziierter IE1-Transkriptionsereignisse bei der Funktionsverlust-Mutante signifikant erh��ht. Damit konnte erstmalig der Beweis f��r eine Kontrolle der Latenz-assoziierten IE1-Genexpression durch IE1-Epitop-spezifische CD8 T-Zellen und damit f��r eine Pr��sentation des IE1-Peptids w��hrend der Latenz erbracht werden.

RNA-basierte Impfstoffe zur Induktion optimaler Immunantworten

Antigen-kodierende RNA wird als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptid-, Protein-, rekombinanten viralen oder DNA basierten Impfstoffen betrachtet. Der endg��ltige klinische Nutzen RNA-basierter Impfstoffe wird von der Optimierung verschiedener Parameter abh��ngig sein, die zur Induktion und effizienten Expansion der humoralen und zellvermittelten Immunantwort beitragen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit, die Etablierung pharmakologischer und immunologischer Parameter f��r die Generierung effektiver Immunantworten durch RNA-Impfstoffe sowie deren Wirksamkeit in vitro und im Mausmodell unter Nutzung von Modellantigenen zu testen. Zur Untersuchung und Optimierung der RNA-Pharmakokinetik, als einem Schl��sselaspekt der klinischen Medikamentenentwicklung, wurde der Einfluss von strukturellen Modifikationen auf die Transkriptstabilit��t und Translationseffizienz von Reporter-Proteinen in einer zeitabh��ngigen Kinetik evaluiert. Es wurde gezeigt, dass ein poly(A) Schwanz von 120 Adenosinen, verglichen mit einem k��rzeren, ein freies 3�� poly(A) Ende, verglichen mit einem verdeckten und eine doppelte ��-globin 3�� UTR, unabh��ngig voneinander zu einer Erh��hung der IVT-RNA Stabilit��t und zu einer Verbesserung der Translationseffizienz beitrugen und dadurch insgesamt zu einer erh��hten Proteinexpression f��hrten. Antigen-kodierende IVT-RNA mit diesen molekularen Merkmalen in Kombination f��hrte, im Vergleich zur Standard IVT-RNA, zu einer erh��hten Dichte und Stabilit��t von Peptid/MHC-Komplexen auf der Zelloberfl��che transfizierter DCs und dadurch zu einer verbesserten Stimulation von CD4+ und CD8+ T-Zellen im murinen und humanen System. Mit dem Ziel, die RNA kodierte Antigenform f��r die Induktion einer verst��rkten Antik��rperantwort zu modifizieren, wurde im zweiten Teil der Arbeit ein Antigen-IgM Fusionskonstrukt hergestellt und hinsichtlich seiner Eignung als neues Impfstoff-Format untersucht. Die Ausgangshypothese, dass die RNA kodierten Antigen-IgM Fusionsproteine polymerisieren, von transfizierten Zellen sezerniert werden und aufgrund der repetitiven Antigenstruktur im Vergleich mit dem monomeren Antigen zu einer Verst��rkung der Antik��rperantwort f��hren, wurde in vitro und in vivo im Mausmodell best��tigt. Die Entwicklung und Evaluierung von Zytokinfusionsproteinen zur selektiven Verst��rkung der antigenspezifischen Immunantworten bildeten den dritten Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Zur weiteren Verst��rkung der Antik��rperantwort wurde basierend auf den Resultaten aus dem zweiten Teil ein IL2-IgM Fusionskonstrukt hergestellt. Die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2-IgM kodierender IVT-RNA f��hrte zu einer signifikant st��rkeren Antik��rperantwort als die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2. F��r die Initiierung einer erfolgreichen anti-Tumor-Immunantwort ist das Priming antigenspezifischer T-Zellen essentiell. Um die Effizienz dieses Prozesses zu steigern, wurde ein bifunktionelles IL2-mCD40L Fusionskonstrukt hergestellt und sein Einfluss auf die Effektorfunktion von DCs in vitro und in vivo untersucht. Es wurde gezeigt, dass ein RNA kodiertes IL2-mCD40L Fusionsprotein als genetisches Adjuvanz zu einer Effizienzsteigerung des Priming zytotoxischer T-Zellen f��hrt. Somit wurden in dieser Arbeit durch die Optimierung der Pharmakokinetik, die Modifikation der Antigenform und die Herstellung und Evaluierung von Zytokinfusionskonstrukten als genetische Adjuvantien, RNA-basierte Impfstoffe f��r eine optimierte Induktion von antigenspezifischen Immunantworten weiter verbessert.