Structured antibody surfaces for bio-recognition and a label-free detection of bacteria

Antibody microarrays are of great research interest because of their potential application as biosensors for high-throughput protein and pathogen screening technologies. In this active area, there is still a need for novel structures and assemblies providing insight in binding interactions such as spherical and annulus-shaped protein structures, e.g. for the utilization of curved surfaces for the enhanced protein-protein interactions and detection of antigens. Therefore, the goal of the presented work was to establish a new technique for the label-free detection of bio-molecules and bacteria on topographically structured surfaces, suitable for antibody binding.rnIn the first part of the presented thesis, the fabrication of monolayers of inverse opals with 10 μm diameter and the immobilization of antibodies on their interior surface is described. For this purpose, several established methods for the linking of antibodies to glass, including Schiff bases, EDC/S-NHS chemistry and the biotin-streptavidin affinity system, were tested. The employed methods included immunofluorescence and image analysis by phase contrast microscopy. It could be shown that these methods were not successful in terms of antibody immobilization and adjacent bacteria binding. Hence, a method based on the application of an active-ester-silane was introduced. It showed promising results but also the need for further analysis. Especially the search for alternative antibodies addressing other antigens on the exterior of bacteria will be sought-after in the future.rnAs a consequence of the ability to control antibody-functionalized surfaces, a new technique employing colloidal templating to yield large scale (~cm2) 2D arrays of antibodies against E. coli K12, eGFP and human integrin αvβ3 on a versatile useful glass surface is presented. The antibodies were swept to reside around the templating microspheres during solution drying, and physisorbed on the glass. After removing the microspheres, the formation of annuli-shaped antibody structures was observed. The preserved antibody structure and functionality is shown by binding the specific antigens and secondary antibodies. The improved detection of specific bacteria from a crude solution compared to conventional “flat” antibody surfaces and the setting up of an integrin-binding platform for targeted recognition and surface interactions of eukaryotic cells is demonstrated. The structures were investigated by atomic force, confocal and fluorescence microscopy. Operational parameters like drying time, temperature, humidity and surfactants were optimized to obtain a stable antibody structure.

Identification of preferentially targeted tumor-associated antigens in melanoma patients via mRNA stimulation of CD8+ blood lymphocytes

Until now, therapeutic vaccination of cancer patients has mainly relied on rather few T cell epitopes processed from structurally normal shared tumor antigens and presented by frequent HLA alleles. So far the design of these studies has not addressed the individuality of tumor-host interactions, which are not only determined by the antigenic tumor phenotype or the natural HLA polymorphism, but also by the individual T cell repertoire. The procedure described herein was developed to identify the preferential targets of the individual repertoire from a panel of known shared tumor-associated antigens. Lymphocytes were isolated from the peripheral blood of cancer patients or healthy donors and stimulated twice with autologous mRNA-transfected FastDC (Dauer et al., J Immunol. 170:4069, 2003). FastDC were generated from blood monocytes and separately transfected via lipofection with in vitro transcribed mRNAs encoding the panel antigens. Responder lymphocytes were tested on day 12 in a 20-hour IFN-g ELISPOT assay for recognition of 293T cells co-transfected pairwise with plasmids encoding the stimulation antigens and the respective individual’s HLA class I alleles. In a first step, stimulation parameters were optimized for the detection of anti-HCMV pp65 responses. A maximum amplification of pp65-specific CD8+ T cell responses was obtained at a rather low IL-2 concentration (25 IU/ml) and at a minimum APC-to-effector ratio of 1:10. Addition of IL-4, IL-7 or IL-15 did not substantially improve the stimulatory potential. The test was applied to the human melanoma models D05 and MZ2, in both of which multiple T cell-defined antigens had previously been identified by expression screening. Blood lymphocytes were stimulated in parallel with autologous tumor cells and with mRNA-transfected FastDC. In D05, T cell reactivities against three out of eleven epitopes induced by stimulation with tumor cells were also found after stimulation with mRNA-transfected FastDC. Two further T cell target epitopes were identified with mRNA but not with tumor cell stimulation. In MZ2, T cell responses against five distinct epitopes were detected on day 12 after stimulation with mRNA transfectants. The same responses were detectable after stimulation with tumor cells only on day 32. mRNA stimulations against 21 tumor-associated antigens in addition to HCMV pp65 were performed in four healthy individuals. In all cases, CD8+ T cells against HCMV pp65 could be expanded. Among tumor-associated antigens, only reactivity against Melan-A/MART-1 in association with HLA-A*0201 was detectable in one of the donors. The vaccination of patients with targets a priori known to be recognized by their T cell repertoire may help to improve the outcome of therapeutic vaccination.

Entwicklung eines pharmakologischen Modells zur Prüfung immuntherapeutischer Antikörper mit dreidimensionalen Tumorzellkulturen in vitro

In den letzten Jahren hat die Tumorbehandlung mit immunologischen Präparaten an Bedeutung gewonnen. Der allgemeine Ablauf der Testung eines Arzneimittelkandidaten sieht vor, zunächst in Zellkulturversuchen und Tierversuchen Wirkweise und Sicherheit, sowie voraussichtliche Abbauwege und mögliche Gefahren so beurteilen zu können, dass sie für einen Einsatz im Menschen in Frage kommen. Zur präklinischen in vitro-Testung werden dabei in der Regel Monolayer-Zellkulturen oder Einzelzellsuspensionen eingesetzt. Der Einsatz von 3D-Zellkulturmodellen, welche den Aufbau von Mikrometastasen oder intervaskuläre Areale in Tumoren exakter widerspiegeln, führt zu wesentlich besseren Voraussagen bezüglich der klinischen Wirksamkeit neuer Präparate. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung und Anwendung eines neuen 3D-Zellkulturbasierten Systems zur Testung trifunktionaler bispezifischer Antikörper für die Tumorbehandlung, welches sich auch auf andere vergleichbare Präparate übertragen lässt.rnIn meiner Arbeit konnte ich mehrere humane Tumorzelllinien definieren, mit denen es gelang, stabile Co-Kulturen von Multi Cellular Tumour Spheroids (MCTS) mit Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) in miniaturisierten Spinner-Flaschen zu etablieren. Spinner-Flaschen, in denen die im Kulturmedium befindlichen Immunzellen, MCTS und Therapeutika ständig frei zirkulieren, sind besonders für eine wirklichkeitsnahe Nachbildung der in vivo-Simulation mit disseminierten Tumorzellen oder mit malignem Aszites geeignet. Diese Art der Kultivierung erlaubte Beobachtungszeiten von ≥20 Tagen für eine große Bandbreite Analysemethoden. Zu den mit dem erstellten Protokoll standardmäßig durchführbaren Analysemethoden zählen unter anderem immunhistochemische Färbungen an Sphäroid-Gefrierschnitten, Vitalitätstest, Untersuchung der Plattierungs-Effizienz, Bestimmung der Sphäroidvolumina, Zytokinbestimmungen aus dem Medienüberstand mit Cytokine Bead Arrays, PCR-Analysen immunzellspezifischer Antigene, sowie durchflusszytometrische Analysen. Diese Methodenkombination erlaubt einen sehr detaillierten Einblick in die Wirkweise und Effizienz neuer Immuntherapeutika aus verschiedensten Blickwinkeln und stellt ein reproduzierbares Testsystem zur präklinischen Testung von Immuntherapeutika dar, das zukünftig als Bindeglied zwischen Monolayer-Zellkulturen und klinischen Prüfungen einen festen Platz einnehmen könnte.rnMit dem beschriebenen 3D-Zellkultur-System wurden in der vorliegenden Arbeit die trifunktionalen bispezifischen Antikörper catumaxomab (unter dem Handelsnamen Removab® für die Behandlung maligner Ascites zugelassen) und ertumaxomab (derzeit in klinischen Prüfungen) hinsichtlich ihrer Wirkweise untersucht. Die Antikörper besitzen im Gegensatz zu herkömmlichen monoklonalen Antikörpern zwei verschiedene Bindungsarme, einer gegen CD3 auf T-Zellen, der zweite gegen EpCAM respektive Her2/neu - beides weit verbreitete Tumorantigene - gerichtet. An ihrem Fc-Teil besitzen sie eine dritte Bindungskapazität, über welche sie an Fcγ RI, -IIa und -III positive akzessorische Zellen binden. Diese Kombination ermöglicht theoretisch die Ausbildung eines Tri-Zell-Komplexes aus T-Zelle, Tumorzelle und akzessorischer Zelle. Dies stellt eine wirkungsvolle Therapieoption unter Ausnutzung der körpereigenen, immunologischen Abwehr dar. rnIm Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass beide Antikörper eine Größenreduktion der Sphäroide mit den entsprechenden Tumorantigenen in gleichem Maße bewirkten und die Plattierungseffizienz durch ertumaxomab dosisabhängig reduziert wurde. Mit dem erstellten Testsystem konnte der Wirkmechanismus von catumaxomab auf Sphäroide der Zelllinie FaDu (Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom) detaillierter gezeigt werden: catumaxomab wirkte dosisabhängig auf die Reduktion der Sphäroidvolumina und die zunehmende Infiltration von CD45+ Zellen, die als T-, NK- und/oder dendritische Zellen identifiziert wurden. Des Weiteren rief die catumaxomab-Gabe eine verstärkte Ausschüttung der Zytokine IL-2, IFN-γ und TNF-α hervor. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass catumaxomab die zelluläre Immunantwort aktiviert.rnDie Standard-Tumorbehandlung beinhaltet die Gabe von Chemotherapeutika. Oft werden dafür Zytostatika mit dem unerwünschten Nebeneffekt auch gesunde proliferierende Zellen anzugreifen verwendet. Dies kann prinzipiell auch die Wirksamkeit der Antikörper-Therapie beeinflussen. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit zusätzlich vergleichende Kombinations-Versuche mit catumaxomab und einem gängigen Zytostatikum - Cisplatin - durchgeführt. Mit Untersuchungen der Sphäroidvolumina, Vitalitätstests und Plattierungseffizienz konnte gezeigt werden, dass die Wirkung von catumaxomab bei gleichzeitiger Anwendung beider Therapeutika aufrecht erhalten bleibt und diese sogar additiv verstärkt wird. Eine Kombinationstherapie im Menschen ist daher denkbar.rnrn

Synthese von tumor-assoziierten MUC1-Mucin-Glycopeptid-Vakzinen und deren immunologische Evaluierung

Eine alternative Methode zur Therapie von Tumorerkrankungen bestünde in einer Immuntherapie ausgelöst durch synthetische Antitumor-Vakzine. Ein vielversprechendes Zielmolekül für eine solche Aktivimmunisierung ist das Glycoprotein MUC1, das auf nahezu allen Epithelgeweben exprimiert und auf Tumorgeweben stark überexprimiert wird. Seine extrazelluläre Domäne enthält eine Vielzahl von Tandem-Repeat-Sequenzen der Art: HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA mit fünf potentiellen O-Glycosylierungs-Positionen. Da die Form der Glycosylierung des MUC1 in Tumorzellen stark von der auf normalen Zellen abweicht, liegen auf Tumorzellen eine Reihe tumor-assoziierter Saccharidantigene und Peptidepitope vor.rnIn dieser Arbeit wurden tumor-assoziierte Glycopeptidantigene aus der MUC1-Tandem-Repeat-Region hergestellt. Die synthetisierten MUC1-Glycopeptide tragen in verschiedenen Positionen eine Glycosylierung mit den tumor-assoziierten Tn- und STn-Saccharid-Antigenen. Zur Gewinnung von Vakzinen wurden diese Glycopeptid-Antigene über einen Spacer mit immunstimulierenden Komponenten verknüpft. Als Immunstimulanzien wurden ein T-Zell-Epitop aus dem Ovalbumin (OVA323-339) sowie die Carrier-Proteine Rinderserumalbumin (BSA) und Tetanus-Toxoid (TTox) verwendet. rnDie synthetischen MUC1-Glycopeptide wurden durch Immunisierung von Mäusen einer immunologischen Evaluierung unterzogen. Insbesondere die synthetischen MUC1-Glycopeptid-TTox-Vakzine lösen sehr starke Immunantworten aus. Es konnte gezeigt werden, dass die induzierten Antikörper stark an Tumorzellen und auch an Mammakarzinom-Gewebe binden, was für die Entwicklung von Antitumor-Vakzinen als vielversprechend einzustufen ist.

Nanoparticles for efficient uptake by human dendritic cells and T lymphocytes to be used in adoptive immunotherapy

Dendritic cells (DCs) are the most potent cell type for capture, processing, and presentation of antigens. They are able to activate naïve T cells as well as to initiate memory T-cell immune responses. T lymphocytes are key elements in eliciting cellular immunity against bacteria and viruses as well as in the generation of anti-tumor and anti-leukemia immune responses. Because of their central position in the immunological network, specific manipulations of these cell types provide promising possibilities for novel immunotherapies. Nanoparticles (NP) that have just recently been investigated for use as carriers of drugs or imaging agents, are well suited for therapeutic applications in vitro and also in vivo since they can be addressed to cells with a high target specificity upon surface functionalization. As a first prerequisite, an efficient in vitro labeling of cells with NP has to be established. In this work we developed protocols allowing an effective loading of human monocyte-derived DCs and primary antigen-specific T cells with newly designed NP without affecting biological cell functions. Polystyrene NP that have been synthesized by the miniemulsion technique contained perylenmonoimide (PMI) as a fluorochrome, allowing the rapid determination of intracellular uptake by flow cytometry. To confirm intracellular localization, NP-loaded cells were analyzed by confocal laser scanning microscopy (cLSM) and transmission electron microscopy (TEM). Functional analyses of NP-loaded cells were performed by IFN-γ ELISPOT, 51Chromium-release, and 3H-thymidine proliferation assays. In the first part of this study, we observed strong labeling of DCs with amino-functionalized NP. Even after 8 days 95% of DCs had retained nanoparticles with a median fluorescence intensity of 67% compared to day 1. NP loading did not influence expression of cell surface molecules that are specific for mature DCs (mDCs) nor did it influence the immunostimulatory capacity of mDCs. This procedure did also not impair the capability of DCs for uptake, processing and presentation of viral antigens that has not been shown before for NP in DCs. In the second part of this work, the protocol was adapted to the very different conditions with T lymphocytes. We used leukemia-, tumor-, and allo-human leukocyte antigen (HLA) reactive CD8+ or CD4+ T cells as model systems. Our data showed that amino-functionalized NP were taken up very efficiently also by T lymphocytes, which usually had a lower capacity for NP incorporation compared to other cell types. In contrast to DCs, T cells released 70-90% of incorporated NP during the first 24 h, which points to the need to escape from intracellular uptake pathways before export to the outside can occur. Preliminary data with biodegradable nanocapsules (NC) revealed that encapsulated cargo molecules could, in principle, escape from the endolysosomal compartment after loading into T lymphocytes. T cell function was not influenced by NP load at low to intermediate concentrations of 25 to 150 μg/mL. Overall, our data suggest that NP and NC are promising tools for the delivery of drugs, antigens, and other molecules into DCs and T lymphocytes.

Synthese fluorierter Glycopeptidkonjugate zur Entwicklung von tumorselektiven Vakzinen

Das Auftreten von antigenen, für Tumorzellen charakteristische Zelloberflächenstrukturen bildet die Voraussetzung für eine aktive Krebsimmuntherapie, mit deren Hilfe die gezielte Bekämpfung von (Mikro-)Metastasen durch das körpereigene Immunsystem erreicht werden soll. Eine gut untersuchte Zielstruktur für eine derartige Immuntherapie stellt das Mucin MUC1 dar, ein hochgradig O-glycosyliertes Peptid, welches bspw. von Epithelzellen der Leber exprimiert wird. rnDas Glycosylierungsmuster des tumorassoziierten MUC1 ist gegenüber dem von gesunden Zellen stark verändert. In Tumorzellen kommt es aufgrund einer fehlerhaften Glucosylamintransferase-Aktivität und einer Überexpression von Sialyltransferasen zur Bildung von kürzeren, hochgradig sialylierten O-Glycanketten. Allerdings wirkt sich neben der relativ schwachen Immunogenität besonders die geringe metabolische Stabilität des natürlichen Glycopeptidfragments nachteilig auf einen Einsatz in Krebsvakzinen aus.rnEine bislang kaum untersuchte Möglichkeit, die Stabilität und Immunogenität der Kohlenhydratantigene zu erhöhen, könnte durch den „bioisosteren“ Austausch von OH-Gruppen gegen Fluor erreicht werden.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnten in 3’- und 4’- Position monofluorierte T-Antigene bzw. in 6’-Position difluorierte T- und in 6-Position difluorierte TN-Antigene synthetisiert werden. In ersten metabilischen Tests erwiesen sich die fluorierten T-Antigene gegenüber einem Abbau durch eine alpha-Galactosidase aus Rinderhoden als stabiler als ihr natürliches, nicht-fluoriertes Analogon. Diese Strukturen wurden nicht zu den entsprechenden Monosacchariden hydrolysiert und stellen somit geeignete Bausteine zur Entwicklung potenter Tumorvakzine dar.rnDie in 3- und 4-Position fluorierten T-Antigene wurden in der weiteren Synthese in eine aus 20 Aminosäuren bestehende MUC1-Peptidsequenz eingebaut und durch einen nicht immunognene Spacer auf Basis von Triethylenglycol an BSA (Rinderserumalbumin) bzw. Tetanus-Toxoid angebunden. Auf diese Weise konnte die Synthese eines tumorselektiven Vakzins fertiggestellt werden.rnIn einer ersten immunologischen Evaluierung der fluorierten T-Antigen-Glycopeptide konnte gezeigt werden, dass bereits erhaltene Antikörper gegen strukturell sehr ähnliche Vakzine in der Lage sind, die neuartigen Glycopeptide zu erkennen und an ihnen zu binden. Dies stellt die Grundlage für weiterführende immunologische Tests dar, indem in einem nächsten Schritt das synthetisierte Tetanut-Toxoid-Konjugat als Vakzin in Experimenten an Mäusen zum Einsatz kommen soll.rn

The role of dendritic cells (DC) in Friend retrovirus-induced immunosuppression and immunotherapeutic applications of functionalized nanoparticles

Friend murine leukemia Virus (FV) infection of immunocompetent mice is a well- established model to acquire further knowledge about viral immune suppression mechanisms, with the aim to develop therapeutics against retrovirus-induced diseases. Interestingly, BALB/c mice are infected by low doses of FV and die from FV-induced erythroleukemia, while C57/BL6 mice are infected by FV only at high viral dose, and remain persistently infected for their whole life. Due to the central role of dendritic cells (DC) in the induction of anti-viral responses, we asked for their functional role in the genotype-dependent sensitivity towards FV infection. In my PhD study I showed that bone marrow (BM)-derived DC differentiated from FV-infected BM cells obtained from FV-inoculated BALB/c (FV susceptible) and C57BL/6 (FV resistant) mice showed an increased endocytotic activity and lowered expression of MHCII and of costimulatory receptors as compared with non-infected control BMDC. FV-infected BMDC from either mouse strain were partially resistant towards stimulation-induced upregulation of MHCII and costimulators, and accordingly were poor T cell stimulators in vitro and in vivo. In addition, FV-infected BMDC displayed an altered expression profile of proinflammator cytokines and favoured Th2 polarization. Ongoing work is focussed on elucidating the functional role of proteins identified as differentially expressed in FV-infected DC in a genotype-dependent manner, which therefore may contribute to the differential course of FV infection in vivo in BALB/c versus C57BL/6 mice. So far, more than 300 proteins have been identified which are differently regulated in FV-infected vs. uninfected DC from both mouse strains. One of these proteins, S100A9, was strongly upregulated specifically in BMDC derived from FV-infected C57BL/6 BM cells. S100A9-/- mice were more sensitive towards inoculation with FV than corresponding wild type (WT) mice (both C57BL/6 background), which suggests a decisive role of this factor for anti-viral defense. In addition, FV-infected S100A9-/- BMDC showed lower motility than WT DC. The future work is aimed to further elucidate the functional importance of S100A9 for DC functions. To exploit the potential of DC for immunotherapeutic applications, in another project of this PhD study the usability of different types of functionalized nanoparticles

Synthese und biologische Evaluierung von fluorierten und carbaanalogen Glycopeptiden für die Entwicklung von tumorselektiven Vakzinen

Tumorassoziierte Kohlenhydrat-Antigene werden von einer Vielzahl epithelialer Tumoren in erhöhtem Maße exprimiert und können sowohl als selektive Tumormarker, als auch als Zielstrukturen zur Entwicklung von synthetischen Krebsvakzinen dienen. Mucine, allen voran MUC1, sind hochgradig O-glycosylierte Zelloberflächenproteine, die im Fall maligner Zellen in deutlich überexprimierter Form mit charakteristisch veränderten Glycosylierungsmustern auftreten und somit vom Immunsystem erkannt werden können. Die relativ schwache Immunogenität und die geringe metabolische Stabilität dieser Glycopeptid-Epitope stehen jedoch der Entwicklung effizienter, auf Kohlenhydraten basierender Krebsvakzine entgegen.rnEin interessanter Ansatz, die Stabilität und Immunogenität der Vakzinbausteine zu erhöhen, ohne dabei deren Tumorspezifität nennenswert zu beeinträchtigen, stellt die Verwendung von modifizierten Glycopeptid-Konjugaten mit Kohlenhydratmimetika dar, z.B. basierend auf Fluor- und Carbazuckern. rnUm die Eignung solcher bislang unbekannter MUC1-Antigenanaloga als Vakzinbausteine zu untersuchen, konnten im Rahmen dieses Promotionsvorhabens Synthesen zu verschiedenen, modifizierten Antigen-Threonin-Konjugaten erarbeitet werden. Dabei konnte neben der erstmaligen Synthese eines in 6-Position fluorierten Carbazuckers auch ein 1→3 verknüpftes Carbadisaccharid synthetisiert werden. Zudem wurden mehrere Vertreter der in Position 6 bzw. 6‘ fluorierten TN, T und der beiden ST-Antigene dargestellt und über eine Festphasenpeptidsynthese in die aus 20 Aminosäuren bestehende tandem-repeat-Sequenz des MUC1 eingebaut. Eine anschließende Konjugation dieser Glycopeptide über einen nicht-immunogenen Spacer auf Triethylenglycol Basis an Carrierproteine wie BSA und das Tetanus Toxoid lieferte nicht nur potente Tumorvakzine, sondern auch die für die Durchführung von ELISA-Studien benötigten Glycopeptid-Konjugate. rnIn ersten ELISA und Neutralisationsexperimenten konnte gezeigt werden, dass bereits erhaltene Antikörper gegen strukturell sehr ähnliche Vakzine in der Lage sind, die neuartigen fluorierten Glycopeptide zu erkennen und an ihnen zu binden. Zusätzlich konnte erstmals in Impfstudien gezeigt werden, dass mit diesen neuen fluorierten Glycopeptid-TTox-Konjugaten nicht nur eine stakt toleranzbrechende humorale Immunantwort induziert werden kann, sondern auch dass diese MUC1 spezifischen Antikörper zudem in der Lage sind Brustkrebszellen der Linie MCF-7 zu erkennen und zu binden. rnrn

Wilmstumor- und Metanephrogenese: differenzielle Genexpressionsanalysen und weitere Charakterisierung identifizierter Kandidatengene

In der vorliegenden Dissertation wurden verschiedene Kandidatengene für den Wilmstumor (WT), eine Tumorerkrankung der Niere, identifiziert und charakterisiert. Da dieses frühkindliche Malignom aus einer inkorrekt ablaufenden Metanephrogenese resultiert, wurden die Genexpressionsmuster verschiedener humaner Wilmstumor- und Normalnierengewebe (adulte sowie fetale Niere) mit Hilfe der Technik des differential display verglichen und die als differenziell exprimiert identifizierten Gene kloniert und charakterisiert. Bei TM7SF1 handelt es sich um ein neues Gen, dessen Transkription im Zuge der Metanephrogenese angeschaltet wird. Das von ihm codierte putative Protein kann aufgrund von Strukturvorhersagen vermutlich zur Familie G Protein-gekoppelter Rezeptoren gezählt werden. Die ableitbare Funktion als Signalmolekül der Nierenentwicklung, sowie seine Lokalisation in einem WT-Lokus (1q42-q43) machen TM7SF1 zu einem aussichtsreichen Kandidatengen für den WT. Darüber hinaus konnten die Voraussetzungen für funktionelle Tests, die eine weitere Charakterisierung von TM7SF1 erlauben, geschaffen werden (Identifikation und Klonierung des murinen Homologen, stabil überexprimierende WT-Zelllinien, Antikörper gegen den Aminoterminus des putativen Proteins). Mit TCF2 wurde ein weiteres Gen identifiziert, dessen Produkt in Prozessen der Metanephrogenese eine Rolle spielt. Die signifikante Herunterregulation der TCF2-Expression in der großen Mehrzahl der untersuchten WTs, die innerhalb der vorliegenden Arbeit gezeigte Regulation durch das WT1-Genprodukt, sowie seine genomische Lokalisation in einem Intervall für die familiäre Form des WT (FWT1 in 17q12-q21) zeigen das Potenzial von TCF2, als Kandidatengen für den FWT zu gelten. Darüber hinaus wurde mit GLI3 ein in verschiedenen WTs stark exprimiertes Gen identifiziert. Sein Produkt ist eine Komponente des entwicklungsbiologisch relevanten und in verschiedene Tumorerkrankungen involvierten sonic hedgehog-Signaltransduktionsweges. Mit FE7A3 und CDT151 konnten zwei differenziell exprimierte cDNAs identifiziert werden, die Teile neuer Gene darstellen und die in WT-Loci kartiert werden konnten. Aufgrund von Homologievergleichen im Bereich der identifizierten offenen Leserahmen konnte eine mögliche Bedeutung der putativen Genprodukte für die WT-Pathogenese als Zelladhäsionsmolekül (FE7A3) bzw. als mit der Proliferation assoziiertem Transkriptionsfaktor (CDT151) herausgearbeitet werden. Neben den komparativen Genexpressionsuntersuchungen wurde in einem zweiten Ansatz die transkriptionelle Regulation des einzigen bisher klonierten Wilmstumorgens (WT1) analysiert. Mit Hilfe vergleichender Reportergenanalysen in WT1-exprimierenden und nicht-exprimierenden Zelllinien konnten neue für die transkriptionelle Regulation von WT1 relevante Bereiche identifiziert werden. Darüber hinaus wurde der für die Transkriptionsfaktoren SP1 und SP3 an anderen Promotoren beschriebene funktionelle Antagonismus für die WT1-Expression untersucht und in Gelretardationsanalysen mit dem WT1-Expressionsstatus oben genannter Zelllinien korreliert.

Untersuchungen zur selektiven Deletion alloreaktiver Spender-T- Lymphozyten durch CD178-modifizierte dendritische Zellen im Rahmen der allogenen Blutstammzelltransplantation

Eine der häufigsten Komplikationen bei der allogenen Blutstammzelltransplantation stellt die Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (Graft versus Host Disease, GvHD) dar. Sie wird durch allogene Spender-T-Lymphozyten verursacht, die Gewebe des Transplantatempfängers erkennen und inflammatorische Entzündungsprozesse auslösen. Neben dieser Alloreaktivität induzieren Spender-T-Lymphozyten jedoch auch immuntherapeutisch erwünschte Transplantat-gegen-Leukämie-Reaktionen (Graft versus Leukemia, GvL-Reaktion), bei denen residuelle Tumor- bzw. Leukämiezellen im Patienten durch Spender-T-Zellen spezifisch erkannt und eliminiert werden. Im Rahmen einer verbesserten Immmuntherapie wird daher versucht, GvHD-reaktive und GvL-reaktive Spender-T-Lymphozyten effizient voneinander zu separieren und so eine wirkungsvolle GvHD-Prophylaxe bzw. optimierte GvL-Induktion zu erreichen. In diesem Kontext war es Ziel dieser Arbeit, murine dendritische Zellen (DZ) so zu modifizieren, daß sie für die spezifische Deletion alloreaktiver T-Zellen in murinen GvHD/GvL-Tiermodellen eingesetzt werden können. Die Modifikation der DZ sollte dazu führen, daß über das CD95/CD178-System Aktivierungs-induzierter Zelltod (activation induced cell death, AICD) in alloreaktiven T-Zellen ausgelöst wird. Hierzu wurden für die Modifikation der DZ zwei verschiedene Mechanismen angewandt: a) die Transfektion der DZ mit CD178-mRNA sowie b) die zielgerichtete Immobilisierung von hCD178-X-Fusionsproteinen auf Oberflächenmolekülen von DZ bzw. T-Zellen. Als Positivkontrolle für die Induktion CD95-vermittelter Apoptose diente der agonistische anti-CD95-Antikörper Jo2. Bei der Transfektion muriner DZ mit mRNA zeigte sich anhand des Reportergens EGFP, daß aus dem Knochenmark generierte DZ mit hoher Effizienz mit EGFP-mRNA transfizierbar waren. Im Falle von hCD178-mRNA führte die Transfektion jedoch zu einer insuffizienten CD178-Expression, die mit den regulatorischen Eigenschaften der zytoplasmatischen CD178-Region in Verbindung gebracht werden konnte. So führte die Verwendung einer zytoplasmatisch trunkierten Form der CD178-mRNA (CD178Dzyt) zu einer durchflußzytometrisch nachweisbaren CD178-Expression in DZ. Mit diesen CD178Dzyt-exprimierenden DZ konnte in einem Proliferationstest die Proliferation alloreaktiver T-Zellen inhibiert werden. Die Beladung von DZ bzw. von T-Zellen mit hCD178-X-Fusionsproteinen führte in vitro ebenfalls zu einer deutlichen Reduktion von Alloreaktivität. Dabei konnte eine spezifische Deletion/Inhibition alloreaktiver T-Zellen nachgewiesen werden. Die Elimination alloreaktiver T-Zellen erfolgte in beiden Verfahren über AICD. Darüber hinaus wurde eine Bifunktionalität der Fusionsproteine festgestellt, da sie neben der Induktion CD95-vermittelter Apoptose auch in der Lage waren, die Kostimulation allogener T-Zellen effizient zu inhibieren. Mit Hilfe adoptiver T-Zell-Transferexperimente konnten abschließend die in vitro gewonnenen Ergebnisse in vivo in zwei verschiedenen GvHD-Mausmodellen bestätigt werden.

Evaluation der Leukämie-Reaktivität von PRAME- und p53-spezifischen T-Zellen bei lymphohämatopoetischen Neoplasien im Rahmen einer adoptiven Immuntherapie

Der Transplantat-gegen-Leukämie (GVL) Effekt als immuntherapeutisches Mittel bei der allogenen hämatopoetischen Stammzell Transplantation (HSZT) ist hauptsächlich durch Spender Lymphozyten vermittelt, welche hämatopoetische Minor-Histokompatibilitäts Antigene bzw. Leukämie-assoziierte Antigene (z. B.: PRAME, p53) erkennen. Der adoptive Transfer von Leukämie-spezifischen T-Zellen kann den GVL-Effekt, ohne ein Auftreten einer Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung (GVHD), steigern. Unter Verwendung von HLA-A2 und human CD8 transgenen Mäusen (CD8yCyA2Kb) konnten in dieser Arbeit PRAME spezifische CD8+ zytotoxischen T-Zellen generiert werden. Diese zytotoxischen CD8+ T-Zellen zeigten in Chromfreisetzungsuntersuchungen lytische Aktivität gegen eine Vielzahl von Zelllinien, die PRAME endogen prozessieren sowie gegen das spezifische PRAME-Peptid. Des Weiteren wurden die hier generierten T-Zellen auf ihre zytotoxische Aktivität gegen akute myeloische Leukämie Blasten hin untersucht, und diese Untersuchungen zeigten AML-Reaktivität der PRAME-spezifischen sowie der als Vergleich genutzten p53- und HLA-A2-spezifischen T-Zellen. Das Potenzial der PRAME-spezifischen ZTL die GVL-Immunität in vivo zu erhöhen ohne das Vorkommen einer GVHD wurde in einem Tumor-Protektions-Model unter der Nutzung von NOD/SCIDgcnull Mäusen untersucht. Die PRA100- bzw. p53-ZTL wurden adoptiv in NOD/SCIDgcnull Rezipienten transferiert und gleichzeitig wurden die Tiere mit PRAME-, oder p53-exprimierende Tumorzelllinien inokuliert. Die Reduktion des Tumorwachstums bestätigte die Spezifität der T-Zellen auch in vivo. In weiteren in vivo Experimenten wurden NOD/SCIDgcnull Mäuse mit AML-Blasten rekonstituiert. Durch die Applikation von nur CD34 positiven Zellen aus einer AML-Probe, oder einer CD56 depletierten Probe, konnten Rekonstitutionen in 95 % aller Versuche erfolgreich beendet werden. Wurde eine Rekonstitution mittels PCR- und FACS-Analysen diagnostiziert, so folgten mehrere Applikationen der PRAME- oder p53-spezifischen ZTL. In diesen Untersuchungen konnten wir in einem therapeutischen AML-in vivo-Modell zeigen, dass die in diesen Untersuchungen generierten/verwandten ZTL in der Lage sind AML-Blasten in vivo zu bekämpfen und so die leukämische Last der Tiere im Blut sowie in der Milz auf unter 1 % zu regulieren. Der prozentuale Anteil humaner AML Zellen im Knochenmark konnte deutlich gesenkt werden (< 10 %). Zusammenfassend sind die von uns generierten PRAME-spezifischen T-Zellen in der Lage, in vitro und auch in vivo, endogen prozessiertes Protein auf Zelllinien und AML-Blasten zu erkennen und zu lysieren. Auch die p53-ZTL, welche als eine weitere Antigen-spezifische ZTL-Population in vivo getestet wurden, zeigten GVL-Effekte. Die Kenntnis von Tumor- bzw. Leukämie assoziierten Antigenen und die daraus erwachsene Möglichkeit der Generierung krankheitsspezifischer ZTL bietet die Grundlage für eine spezifische Immuntherapie maligner Erkrankungen.

LPS-induced modifications in spontaneous network activity causes neuronal apoptosis in neonatal cerebral cortex

During the perinatal period the developing brain is most vulnerable to inflammation. Prenatal infection or exposure to inflammatory factors can have a profound impact on fetal neurodevelopment with long-term neurological deficits, such as cognitive impairment, learning deficits, perinatal brain damage and cerebral palsy. Inflammation in the brain is characterized by activation of resident immune cells, especially microglia and astrocytes whose activation is associated with a variety of neurodegenerative disorders like Alzheimer´s disease and Multiple sclerosis. These cell types express, release and respond to pro-inflammatory mediators such as cytokines, which are critically involved in the immune response to infection. It has been demonstrated recently that cytokines also directly influence neuronal function. Glial cells are capable of releaseing the pro-inflammatory cytokines MIP-2, which is involved in cell death, and tumor necrosis factor alpha (TNFalpha), which enhances excitatory synaptic function by increasing the surface expression of AMPA receptors. Thus constitutively released TNFalpha homeostatically regulates the balance between neuronal excitation and inhibition in an activity-dependent manner. Since TNFalpha is also involved in neuronal cell death, the interplay between neuronal activity MIP-2 and TNFalpha may control the process of cell death and cell survival in developing neuronal networks. An increasing body of evidence suggests that neuronal activity is important in the regulation of neuronal survival during early development, e.g. programmed cell death (apoptosis) is augmented when neuronal activity is blocked. In our study we were interested on the impact of inflammation on neuronal activity and cell survival during early cortical development. To address this question, we investigated the impact of inflammation on neuronal activity and cell survival during early cortical development in vivo and in vitro. Inflammation was experimentally induced by application of the endotoxin lipopolysaccharide (LPS), which initiates a rapid and well-characterized immune response. I studied the consequences of inflammation on spontaneous neuronal network activity and cell death by combining electrophysiological recordings with multi-electrode arrays and quantitative analyses of apoptosis. In addition, I used a cytokine array and antibodies directed against specific cytokines allowing the identification of the pro-inflammatory factors, which are critically involved in these processes. In this study I demonstrated a direct link between inflammation-induced modifications in neuronal network activity and the control of cell survival in a developing neuronal network for the first time. Our in vivo and in vitro recordings showed a fast LPS-induced reduction in occurrence of spontaneous oscillatory activity. It is indicated that LPS-induced inflammation causes fast release of proinflammatory factors which modify neuronal network activity. My experiments with specific antibodies demonstrate that TNFalpha and to a lesser extent MIP-2 seem to be the key mediators causing activity-dependent neuronal cell death in developing brain. These data may be of important clinical relevance, since spontaneous synchronized activity is also a hallmark of the developing human brain and inflammation-induced alterations in this early network activity may have a critical impact on the survival of immature neurons.

Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Biomarkern beim Glaukom

Das Glaukom ist, nach dem Katarakt, die zweithäufigste Ursache für Erblindungen weltweit mit Milionen von Betroffenen, die von dieser zunächst weitgehend symptomfreien neurodegenerativen Erkrankung heimgesucht werden. Die Möglichkeiten auf dem Feld der Diagnose beschränken sich bislang weitestgehend auf die Messung des Augeninnendrucks und der Beurteilung des Augenhintergrundes durch einen erfahrenen Augenarzt. Eine labordiagnostische Prophylaxe ist bis heute nicht verfügbar, die Zahl unerkannter Erkrankungen dementsprechend hoch. Hierdurch geht wertvolle Zeit verloren, die man für eine effektive Therapie nutzen könnte.rnBezüglich der Pathogenese des Glaukoms geht man heute von mehreren, miteinander wechselwirkenden Pathomechanismen aus, zu denen neben mechanischen Einflüssen durch einen erhöhten IOD auch Hypoxie, verminderte Neutrophinversorgung, Exzitotoxizität, oxidativer Stress und eine Beteiligung autoimmuner Prozesse gezählt werden. Unabhängig vom Pathomechanismus folgt stets die Etablierung umfangreicher degenerativer Prozesse im Sehnervenkopf, den retinalen Ganglienzellen und den Axonen des Sehnerven, die letztlich im irreversiblen Untergang dieser Neuronen münden. Diese pathologischen Prozesse im ZNS hinterlassen auf Proteomebene Spuren, die mithilfe moderner massenspektrometrischer Methoden in Kombination mit multivariaten statistischen Methoden detektierbar und als sogenannte Biomarker-Kandidaten mit definiertem Molekulargewicht darstellbar sind. In dieser Arbeit wurde ein „Workflow“ entwickelt, der es ermöglicht, diese Biomarker-Kandidaten im Blutserum und in der Tränenflüssigkeit in einfachen, reproduzierbaren Schritten zu identifizieren und zu charakterisieren. Abweichend von der etablierten Methotik der Bottom-Up-Proteomics musste hierfür eine Methode entsprechend einer Top-Down-Philosophie entwickelt werden, die es erlaubt, die Spuren des Glaukoms im Proteom zu detektieren und zu charakterisieren.rnDies erfolgte in dieser Arbeit durch sowohl massenspektroskopischen Methoden wie SELDI-TOF® und MALDI-Tof-Tof als auch durch Bead-, Gel- und Flüssigkeits-chromatographisch-basierte Separations und Fraktionierungstechniken.rnDie erfolgreiche Kombination dieser Methoden führte zu Identifikationen einer ganzen Reihe von Biomarker-Kandidaten. Unter den identifizierten Proteinen, die bezüglich ihres korrespondierenden SELDI-Peaks im Massenbereich von Biomarker-Kandidaten liegen, finden sich Zytokine und Effektormoleküle der angeborernen Immunität, stressinduzierbare Kinasen, Faktoren, die zum Schutz der Telomeren dienen, Proliferationsmarker, neuronale Antigene und Transportproteine. Darüber hinaus wurden Komponenten identifiziert, die an der neuronalen Neutrophinversorgung beteiligt sind, neuronale Rezeptoren und Antigene, Komponenten des Komplementsystems und des MHC-I-Komplexes. All diese identifizierten Proteine sind bezüglich ihrer Funktion und möglichen Rolle innerhalb der Pathogenese des Glaukoms detailliert beschrieben und charakterisiert. Dies erlaubt einen umfassenden Einblick in alle Pathomechanismen, denen nach heutigem Kenntnisstand, eine Rolle an der Pathogenese des Glaukoms unterstellt wird.rn

Analyse humaner regulatorischer T-Zellen im humanisierten Mausmodell

Regulatorische T-Zellen sind essentiell für die Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz. Hierbei sorgen diese hocheffektiven Suppressorzellen für ein immunologisches Gleichgewicht, indem sie Immunantworten gegen Autoantigene sowie harmlose Nahrungs- und Umweltantigene verhindern. Andererseits können diese bei chronischen Infekten Immunantworten reduzieren sowie effektive Antitumor-Immunantworten hemmen. Aufgrund ethischer Erwägungen ist die Erforschung regulatorischer T-Zellen und deren Rolle bei der Tumorentwicklung weitestgehend auf Mausmodelle oder humane in vitro oder ex vivo Analysen beschränkt. Um diese Limitationen zu überwinden und translationale immunologische Experimente zu ermöglichen, wurde hier ein humanisiertes Mausmodell verwendet. T- und B-Zell-defiziente NOD-scid IL2Rgammanull (NSG) Mäuse wurden mit humanen CD34+ hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut rekonstituiert. Aus diesen Stammzellen entstanden in den Tieren vielfältige humane Immunzellen. Im murinen Thymus der NSG Tiere entwickelten sich CD4+ und CD8+ einzelpositive T-Zellen, welche als funktionelle Effektorpopulationen in die Peripherie auswanderten. Humane regulatorische T-Zellen (CD4+ CD25+ Foxp3+ CD127-) entwickelten sich ebenfalls im murinen Thymus der Tiere und machten ca. 10% der humanen peripheren CD4+ T-Zellen in den Mäusen aus. Diese humanen regulatorischen T-Zellen zeigten vorwiegend einen HLA-DR+ Phänotyp, welcher mit höchster Suppressivität assoziiert ist. Weiter verhielten sich die regualtorischen T-Zellen anergisch und bewiesen ihre Funktionalität unter anderem durch die Inhibition der Proliferation von Effektor-T-Zellen in vitro. rnSubkutan injizierte Tumorzellen eines humanen undifferenzierten pleomorphen Sarkoms wurden in den humanisierten Mäusen nicht abgestoßen und der Tumor konnte, trotz Infiltration humaner Immunzellen, ungehindert wachsen. Als mögliche Ursache hierfür zeigte sich die selektive Akkumulation regulatorischer T-Zellen im Tumor. Zusammen mit dem erhöhten Anteil humaner regulatorischer T-Zellen in der Peripherie, weisen diese Beobachtungen deutliche Parallelen mit Befunden aus humanen Patienten auf. Dies bietet somit erstmalig die Option in vivo die Rolle humaner regulatorischer T-Zellen im undifferenzierten pleomorphen Sarkom zu analysieren. Die hier gezeigten Daten machen deutlich, dass es das humanisierte Mausmodell ermöglicht, die Entstehung und Funktion humaner regulatorischer T-Zellen in vivo zu analysieren, deren Bedeutung in klinisch relevanten Modellen zu charakterisieren und somit innovative Therapien zu etablieren.