In vitro generation and characterization of acute myeloid leukemia-reactive CD8 + cytotoxic T-lymphocyte clones from healthy donors

Donor-derived CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) eliminating host leukemic cells mediate curative graft-versus-leukemia (GVL) reactions after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). The leukemia-reactive CTLs recognize hematopoiesis-restricted or broadly expressed minor histocompatibility and leukemia-associated peptide antigens that are presented by human leukocyte antigen (HLA) class I molecules on recipient cells. The development of allogeneic CTL therapy in acute myeloid leukemia (AML) is hampered by the poor efficiency of current techniques for generating leukemia-reactive CTLs from unprimed healthy donors in vitro. In this work, a novel allogeneic mini-mixed lymphocyte/leukemia culture (mini-MLLC) approach was established by stimulating CD8+ T cells isolated from peripheral blood of healthy donors at comparably low numbers (i.e. 10e4/well) with HLA class I-matched primary AML blasts in 96-well microtiter plates. Before culture, CD8+ T cells were immunomagnetically separated into CD62L(high)+ and CD62L(low)+/neg subsets enriched for naive/central memory and effector memory cells, respectively. The application of 96-well microtiter plates aimed at creating multiple different responder-stimulator cell compositions in order to provide for the growth of leukemia-reactive CTLs optimized culture conditions by chance. The culture medium was supplemented with interleukin (IL)-7, IL-12, and IL-15. On day 14, IL-12 was replaced by IL-2. In eight different related and unrelated donor/AML pairs with complete HLA class I match, numerous CTL populations were isolated that specifically lysed myeloid leukemias in association with various HLA-A, -B, or -C alleles. These CTLs recognized neither lymphoblastoid B cell lines of donor and patient origin nor primary B cell leukemias expressing the corresponding HLA restriction element. CTLs expressed T cell receptors of single V-beta chain families, indicating their clonality. The vast majority of CTL clones were obtained from mini-MLLCs initiated with CD8+ CD62L(high)+ cells. Using antigen-specific stimulation, multiple CTL populations were amplified to 10e8-10e10 cells within six to eight weeks. The capability of mini-MLLC derived AML-reactive CTL clones to inhibit the engraftment of human primary AML blasts was investigated in the immunodeficient nonobese diabetic/severe combined immune deficient IL-2 receptor common γ-chain deficient (NOD/SCID IL2Rγnull) mouse model. The leukemic engraftment in NOD/SCID IL2Rγnull was specifically prevented if inoculated AML blasts had been pre-incubated in vitro with AML-reactive CTLs, but not with anti-melanoma control CTLs. These results demonstrate that myeloid leukemia-specific CTL clones capable of preventing AML engraftment in mice can be rapidly isolated from CD8+ CD62L(high)+ T cells of healthy donors in vitro. The efficient generation and expansion of these CTLs by the newly established mini-MLLC approach opens the door for several potential applications. First, CTLs can be used within T cell-driven antigen identification strategies to extend the panel of molecularly defined AML antigens that are recognizable by T cells of healthy donors. Second, because these CTLs can be isolated from the stem cell donor by mini-MLLC prior to transplantation, they could be infused into AML patients as a part of the stem cell allograft, or early after transplantation when the leukemia burden is low. The capability of these T cells to expand and function in vivo might require the simultaneous administration of AML-reactive CD4+ T cells generated by a similar in vitro strategy or, less complex, the co-transfer of CD8-depleted donor lymphocytes. To prepare clinical testing, the mini-MLLC approach should now be translated into a protocol that is compatible with good manufacturing practice guidelines.

Rolle der gemeinsamen Expression von AML1-ETO und weiteren Onkogenen für die Induktion von Leukämie

Akute Leukämien treten in allen Altersstufen auf. Akute lymphatische Leukämie (ALL) ist die häufigste Leukämie bei Kindern, während akute myeloischen Leukämien (AML) mit verschiedenen Untergruppen etwa 80% aller akuten Leukämien bei Erwachsenen ausmachen. Die Translokation t(8;21) resultiert in der Entstehung des Fusionsgens AML1-ETO und zählt zu den häufigen Translokationen bei der AML. Dabei fusioniert die DNA-bindende Domäne des AML1 mit dem fast kompletten ETO-Protein. AML1-ETO wirkt als dominanter Repressor der AML1-vermittelten transkriptionellen Regula-tion wichtiger hämatopoetischer Zielgene. Klinische Daten legen nahe, dass trotz der klarer Assoziation zwischen AML und der t(8;21) Translokation bei AML Patienten zusätzliche genetische Veränderungen – so genannte ‚second hits‘ – notwendig sind, um eine Leukämie effizient zu induzieren. Klinisch relevanten Komplimentationsonkogene sind unter anderen die aktivierte Rezeptortyrosinkinase FLT3, JAK2, NRAS, KRAS, c- KIT.rnZiel der vorliegenden Arbeit war es, ein Mausmodell zu etablieren, welches humane akute myeloische Leukämie rekapituliert und bei dem die Expression der entsprechen-den Onkogene reguliert werden kann. Als erstes wurde untersucht, ob eine gemeinsame Expression von AML1-ETO mit kRASG12D zur Induktion von Leukämie führen kann. Hierfür wurden Tiere generiert die gemeinsam AML1-ETO und kRASG12D unter der regulatorischen Sequenz des Tetrazyklin-Operators exprimierten. Der große Vorteil dieser Technologie ist die regulierbare Reversibilität der Genexpression. Um die Ex-pression der Zielgene auf blutbildende Zellen zu beschränken, wurden Knochenmark-chimären hergestellt. Im Beobachtungszeitraum von 12 Monaten führte die Expression von AML1-ETO und AML1-ETO/kRASG12D nicht zur Induktion einer akuten Leukä-mie. Die normale hämatopoetische Entwicklung war jedoch in diesen Tieren gestört. Der beobachtete Phänotyp entsprach einem myelodysplastischen Syndrome (MDS).rnIm zweiten Ansatz, wurden Tiere generiert die gemeinsam AML1-ETO und FLT3-ITD exprimierten. Hierfür wurden hämatopoetische Stammzellen aus ROSA26-iM2/tetO-AML1-ETO isoliert und mit Hilfe des retroviralen Vektors mit FLT3-ITD transduziert. In diesem Modell war es möglich, in kurzer Zeit eine akute Leukämie mit zu induzieren. Einige wenige Tiere hatten zum Zeitpunkt des Todes Anzeichen einer biphänotypischen Leukämie mit lymphatischen und myeloischen Blastenpopulationen. In drei Tieren in-duzierte die alleinige Expression von FLT3-ITD eine Leukämie. Alle Leukämien wurden durch FACS, Zytologie und Histopathologie bestätigt. Knochenmark- bzw. Milzzellen aus den erkrankten Tieren waren in der Lage nach Transfer in sekundäre Rezipienten eine Leukämie auszulösen. Somit besaßen sie ein uneingeschränktes Selbsterneue-rungspotential.rnEin erster Versuch, in dem AML1-ETO Expression in leukämischen Zellen abgeschaltet und FLT3-ITD mit Tyrosinkinase-Inhibitor inhibiert wurde, zeigte keine wesentliche Veränderung in der Leukämieprogression.rnDieses Leukämiemodell erlaubt die Rolle der beteiligten Onkogene während verschie-dener Stadien der Leukämie zu erforschen und damit möglicherweise neue Ansätze für Therapiestrategien zu entwickeln.

In vitro characterization of human AML-reactive CTL clones generated from the naive subset of healthy donors and adoptive transfer into leukemia-engrafted NSG mice

Acute myeloid leukemia (AML) is a very aggressive cancer of the hematopoietic system. Chemotherapy and immunotherapeutical approaches including hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and donor lymphocyte infusion (DLI) are the only curative options available. The beneficial graft-versus-leukemia (GVL) effect of cellular immunotherapy is mostly mediated by donor-derived CD8+ T lymphocytes that recognize minor histocompatibility antigens (mHags) and leukemia-associated antigens (LAAs) presented on the surface of AML blasts (Falkenburg et al. 2008; Kolb 2008). A main complication is graft-versus-host disease (GVHD) that can be induced when cytotoxic T lymphocytes (CTLs) recognize broadly expressed antigens. To reduce the risk of GVHD, specific allogeneic T-cell therapy inducing selective GVL responses could be an option (Barrett & Le Blanc 2010; Parmar et al. 2011; Smits et al. 2011). This requires efficient in vitro strategies to generate AML-reactive T cells with an early differentiation phenotype as well as vigorous effector functions and humanized mouse models to analyze the anti-leukemic potential of adoptively transferred T cells in vivo. In this study, AML-reactive CTL clones and oligoclonal T-cell lines could be reliably generated from the naive subset of healthy HLA-class I-identical donors by stimulation with primary AML blasts in mini-mixed-lymphocyte / leukemia cultures (MLLCs) in eight different patient / donor pairs. These CTLs were promising candidates for cellular immunotherapy because of their relatively early differentiation phenotype and strong proliferative and lytic capabilities. The addition of the common γ-chain cytokine IL-21 to the stimulation protocol enabled more precursors to develop into potent leukemia-reactive CTLs, presumably by its beneficial effects on cell survival and antigen-specific proliferation during the first weeks of cultures. It also strengthened the early-stage phenotype. Three long-term cultured CTLs exemplarily transferred into leukemia-engrafted immunodeficient NSG mice mediated a significant reduction of the leukemic burden after a single transfusion. These results demonstrate that CTL clones with reactivity to patient-derived AML blasts can be isolated from the naive compartment of healthy donors and show potent anti-leukemic effects in vivo. The herein described allo-MLLC approach with in vitro “programmed” naive CTL precursors independent of a HSCT setting is a valuable alternative to the conventional method of isolating in vivo primed donor CTLs out of patients after transplantation (Kloosterboer et al. 2004; Warren et al. 2010). This would make leukemia-reactive CTLs already available at the time point of HSCT, when residual leukemia disease is minimal and the chances for complete leukemia eradication are high. Furthermore, leukemia-reactive CTLs effectively expanded by this in vitro protocol can be used as screening populations to identify novel candidate LAAs and mHags for antigen-specific immunotherapy.

Evaluation der Leukämie-Reaktivität von PRAME- und p53-spezifischen T-Zellen bei lymphohämatopoetischen Neoplasien im Rahmen einer adoptiven Immuntherapie

Der Transplantat-gegen-Leukämie (GVL) Effekt als immuntherapeutisches Mittel bei der allogenen hämatopoetischen Stammzell Transplantation (HSZT) ist hauptsächlich durch Spender Lymphozyten vermittelt, welche hämatopoetische Minor-Histokompatibilitäts Antigene bzw. Leukämie-assoziierte Antigene (z. B.: PRAME, p53) erkennen. Der adoptive Transfer von Leukämie-spezifischen T-Zellen kann den GVL-Effekt, ohne ein Auftreten einer Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung (GVHD), steigern. Unter Verwendung von HLA-A2 und human CD8 transgenen Mäusen (CD8yCyA2Kb) konnten in dieser Arbeit PRAME spezifische CD8+ zytotoxischen T-Zellen generiert werden. Diese zytotoxischen CD8+ T-Zellen zeigten in Chromfreisetzungsuntersuchungen lytische Aktivität gegen eine Vielzahl von Zelllinien, die PRAME endogen prozessieren sowie gegen das spezifische PRAME-Peptid. Des Weiteren wurden die hier generierten T-Zellen auf ihre zytotoxische Aktivität gegen akute myeloische Leukämie Blasten hin untersucht, und diese Untersuchungen zeigten AML-Reaktivität der PRAME-spezifischen sowie der als Vergleich genutzten p53- und HLA-A2-spezifischen T-Zellen. Das Potenzial der PRAME-spezifischen ZTL die GVL-Immunität in vivo zu erhöhen ohne das Vorkommen einer GVHD wurde in einem Tumor-Protektions-Model unter der Nutzung von NOD/SCIDgcnull Mäusen untersucht. Die PRA100- bzw. p53-ZTL wurden adoptiv in NOD/SCIDgcnull Rezipienten transferiert und gleichzeitig wurden die Tiere mit PRAME-, oder p53-exprimierende Tumorzelllinien inokuliert. Die Reduktion des Tumorwachstums bestätigte die Spezifität der T-Zellen auch in vivo. In weiteren in vivo Experimenten wurden NOD/SCIDgcnull Mäuse mit AML-Blasten rekonstituiert. Durch die Applikation von nur CD34 positiven Zellen aus einer AML-Probe, oder einer CD56 depletierten Probe, konnten Rekonstitutionen in 95 % aller Versuche erfolgreich beendet werden. Wurde eine Rekonstitution mittels PCR- und FACS-Analysen diagnostiziert, so folgten mehrere Applikationen der PRAME- oder p53-spezifischen ZTL. In diesen Untersuchungen konnten wir in einem therapeutischen AML-in vivo-Modell zeigen, dass die in diesen Untersuchungen generierten/verwandten ZTL in der Lage sind AML-Blasten in vivo zu bekämpfen und so die leukämische Last der Tiere im Blut sowie in der Milz auf unter 1 % zu regulieren. Der prozentuale Anteil humaner AML Zellen im Knochenmark konnte deutlich gesenkt werden (< 10 %). Zusammenfassend sind die von uns generierten PRAME-spezifischen T-Zellen in der Lage, in vitro und auch in vivo, endogen prozessiertes Protein auf Zelllinien und AML-Blasten zu erkennen und zu lysieren. Auch die p53-ZTL, welche als eine weitere Antigen-spezifische ZTL-Population in vivo getestet wurden, zeigten GVL-Effekte. Die Kenntnis von Tumor- bzw. Leukämie assoziierten Antigenen und die daraus erwachsene Möglichkeit der Generierung krankheitsspezifischer ZTL bietet die Grundlage für eine spezifische Immuntherapie maligner Erkrankungen.

In vivo consequences of AML1-ETO fusion protein expression for hematopoiesis

The t(8;21) (q22;q22) translocation fusing the ETO (also known as MTG8) gene on human chromosome 8 with the AML1 (also called Runx1 or CBFα) gene on chromosome 21 is one of the most common genetic aberrations found in acute myeloid leukemia (AML). This chromosomal translocation occurs in 12 % of de novo AML cases and in up to 40 % of the AML-M2 subtype of the French-American-British classification. To date, the in vivo function of aberrant AML1-ETO fusion protein expression has been investigated by several groups. However, in these studies, controversial results were reported and some key issues remain unknown. Importantly, the consequences of aberrant AML1-ETO expression for self-renewing hematopoietic stem cells (HSCs), multipotent hematopoietic progenitors (MPPs) and lineage-restricted precursors are not known. rn The aim of this thesis was to develop a novel experimental AML1-ETO in vivo model that (i) overcomes the current lack of insight into the pre-leukemic condition of t(8;21)-associated AML, (ii) clarifies the in vivo consequences of AML1-ETO for HSCs, MPPs, progenitors and more mature blood cells and (iii) generates an improved mouse model suitable for mirroring the human condition. For this purpose, a conditional tet on/off mouse model expressing the AML1-ETO fusion protein from the ROSA26 (R26) locus was generated. rn Aberrant AML1-ETO activation in compound ROSA26/tetOAML1-ETO (R26/AE) mice caused high rates of mortality, an overall disruption of hematopoietic organs and a profound alteration of hematopoiesis. However, since the generalized activity of the R26 locus did not recapitulate the leukemic condition found in human patients, it was important to restrict AML1-ETO expression to blood cell lineages. Therefore, bone marrow cells from non-induced R26/AE mice were adoptively transplanted into sublethal irradiated RAG2-/- recipient mice. First signs of phenotypical differences between AML1-ETO-expressing and control mice were observed after eight to nine months of transgene induction. AML1-ETO-expressing mice showed profound changes in hematopoietic organs accompanied by manifest extramedullary hematopoiesis. In addition, a block in early erythropoiesis, B- and T-cell maturation was observed and granulopoiesis was significantly enhanced. Most interestingly, conditional activation of AML1-ETO in chimeric mice did not increase HSCs, MPPs, common lymphoid precursors (CLPs), common myeloid progenitors (CMPs) and megakaryocyte-erythrocyte progenitors (MEPs) but promoted the selective amplification of granulocyte-macrophage progenitors (GMPs). rn The results of this thesis provide clear experimental evidence how aberrant AML1-ETO modulates the developmental properties of normal hematopoiesis and establishes for the first time that AML1-ETO does not increase HSCs, MPPs and common lineage-restricted progenitor pools but specifically amplifies GMPs. The here presented mouse model not only clarifies the role of aberrant AML1-ETO for shaping hematopoietic development but in addition has strong implications for future therapeutic strategies and will be an excellent pre-clinical tool for developing and testing new approaches to treat and eventually cure AML.rn

Untersuchungen zu Migration, Homing und Effektor-Funktionen humaner T-Lymphozyten in NOD.Cg-Prkdc scid Il2r gtm1Wjl, SzJ-Mäusen im Rahmen der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Die akute myeloische Leukämie (AML) zählt zu den aggressivsten neoplastischen Erkrankungenrnder Hämatopoese. Die Mehrheit der Patienten mit AML erreicht nach Induktions-rnChemotherapie den Zustand der kompletten Remission, jedoch erleiden mehr als die Hälfterndieser Patienten anschließend einen Rückfall und versterben an den Folgen der Erkrankungrn[1]. Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (engl.: hematopoietic stem cellrntransplantation, HSCT) stellt die einzig putativ kurative Behandlungsform für rezidierendernPatienten und solche mit schlechter Prognose dar. Jedoch birgt diese Form der Therapiernauch eine Vielzahl an Risiken. Insbesondere das Auftreten einer akuten Transplantat-gegen-rnWirt-Erkrankung (engl.: graft-versus-host disease, GvHD) stellt die Hauptursache für transplantationsassoziierternMortalität und Morbidität dar [2]. Die Depletion von alloreaktiven zytotoxischenrnT Lymphozyten (CTL) aus dem Transplantat ermöglicht zwar die Prävention derrnEntstehung einer GvH-Erkrankung, jedoch häufig unter gleichzeitigem Verlust des förderlichen,rnanti-leukämischen Transplantat-gegen-Leukämie-Effekts (engl.: graft-versus-leukemia,rnGvL) [3]. Um den GvL-Effekt unter Vermeidung einer GvH-Erkrankung zu erhalten, bietetrnsich der gezielte adoptive Transfer von Leukämie-spezifischen, nicht alloreaktiven CTL alsrnattraktive Strategie der Immuntherapie für AML-Patienten nach allogener HSCT an. In derrnvorliegenden Arbeit konnte erfolgreich ein prä-klinisches murines AML-Modell unter Einsatzrndes stark immundefizienten NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ- (NSG-) Mausstamms und primärenrnAML-Blasten durch die Optimierung bereits publizierter Protokolle etabliert werden.rnBei zehn von 17 transplantierten primären AML-Proben konnte ein erfolgreiches Engraftmentrnder humanen Zellen und eine Rekonstitution der humanen Neoplasie in den NSG-Mäusenrnerzielt werden. Die Engraftment-Rate betrug somit 58,82% und lag etwas unter dem aus derrnLiteratur bekannten Wert von 65-70% [4, 5]. Es ließen sich gut, intermediär und schlecht anwachsendernAML-Proben anhand der Engraftment-Stärke und -Reproduzierbarkeit voneinanderrnunterscheiden. Anhand der Analyse von für das Engraftment kritischer Parameter konnternein Zusammenhang zwischen Engraftment-Rate in der Maus und Flt3-Mutationsstatus sowiernFAB-Klassifikation des Patienten hergestellt und somit Angaben aus der Literatur bestätigtrnwerden. Für zwei Patienten-spezifische AML-Modelle, MZ580 und MZ308, konnten in vitrornerfolgreich AML-reaktive, über einzelne bzw. duale HLA-Diskrepanzen restringierte CTLPopulationenrngeneriert und über einen Zeitraum von bis zu 70 Tagen expandiert werden.rnDeren adoptiver Transfer in zuvor mit humanen AML-Blasten inokulierte NSG-Mäuse führternzu einer nahezu vollständigen Eradikation der AML-Blasten und Remission der Versuchstiere.rnAnhand unterschiedlich langer in vitro Kultur-Zeiträume konnte ein für die in vivo ausgeübtenrnEffektor-Funktionen optimaler Reifungszustand der CTL-Populationen von maximalrn28 Tagen bestimmt werden. Die kinetische Analyse der lytischen Aktivität in vivo deutete auf eine relativ schnelle Ausübung der Effektor-Funktionen durch die CTL-Populationen innerhalbrnvon zwei bis 24 Stunden nach adoptivem Transfer hin. Durch die Verwendung von inrnvitro generierten EBV-reaktiven CTL aus einem irrelevanten Spender konnte zudem die Spezifitätrnder in vivo ausgeübten Effektor-Funktionen nachgewiesen werden. Die ex vivo Re-rnIsolation adoptiv transferierter CTL und deren in vitro Analyse in einem IFNγ ELISpot wiesrneine konstante Reaktivität der Zellen ohne Induktion einer Xeno-Reaktivität nach. Die zurrnVerbesserung der Persistenz humaner CTL-Populationen eingesetzten autologen CD4+ TrnZellen zeigten nur im AML MZ308-System eine positive Wirkung. Generell konnte die Persistenzrnin vivo jedoch trotz initialer Substitution mit den Zytokinen IL-2 und IL-7 nicht über einenrnZeitraum von sieben Tagen hinaus aufrechterhalten werden.rnZur Untersuchung des Extravasations-Mechanismus humaner T Zellen über murines Endothelrnwurden sowohl Flusskammer- als auch Transwell-Studien durchgeführt, um die molekularenrnGrundlagen des Adhäsions- und Transmigrationsprozesses aufzuklären. Durch denrnparallelen Einsatz humaner und muriner T Zellen auf murinen Endothelzellen unter Zusatzrnfunktionsblockierender monoklonaler Antikörper konnte gezeigt werden, dass derrnExtravasations-Mechanismus beider Spezies auf Interaktionen homologer Adhäsionsmolekül-rnPaare, nämlich VLA-4–VCAM-1 und LFA-1–ICAM-1, beruht. Für einzelne Moleküle konntenrnin Abhängigkeit der eingesetzten Endothelzellen Unterschiede in der Funktionalität zwischenrnden Spezies identifiziert werden. Der Adhäsionsprozess war durch die Blockade derrnVLA-4–VCAM-1-Interaktion stärker inhibierbar als durch die Blockade von LFA-1–ICAM-1.rnDie Transmigration hingegen war durch die Blockade beider Adhäsionsmolekül-Paare vergleichbarrnstark inhibierbar.

Untersuchungen zum Engraftment primärer humaner akuter myeloischer Leukämieblasten in einem immundefizienten Mausmodel

Die akute myeloische Leukämie (AML) stellt ein äußerst heterogenes hämatologisches Krankheitsbild dar, welches durch die unkontrollierte Proliferation unausdifferenzierter und gleichzeitig nicht-funktioneller hämatopoetischer Zellen gekennzeichnet ist. Sowohl die unterschiedliche Zellherkunft, als auch zytogenetische Aberrationen und molekulargenetische Mutationen sorgen für eine große Diversität der Erkrankung. In der Therapie kommen Chemotherapeutika zum Einsatz, welche die Leukämie in eine komplette Remission bringen sollen. Der einzige kurative Ansatz besteht aus der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation. Abgesehen von den gewünschten kurativen Effekten, induzieren die im Transplantat befindlichen Spender-T-Lymphozyten ebenfalls die Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung – eine Hauptursache von Mortalität und Morbidität nach erfolgter allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Da bei vielen Patienten aufgrund ihres Alters und ihrer Begleiterkrankungen eine Transplantation nicht tolerieren und da viele akuten myeloischen Leukämien trotz Chemotherapie progredient sind, schlägt die Therapie fehl und es gibt keine Chance auf Heilung. rnZur Erforschung der pathologischen Prozesse der akuten myeloischen Leukämie sowie für die Entwicklung neuer Therapiekonzepte bedarf es stabiler Tiermodelle, die die maligne Erkrankung des Menschen darstellen können. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Engraftments humaner primärer akuter myeloischer Leukämien in immuninkompetenten NSG-Mäusen. Die Untersuchungen zeigten, dass lediglich 61,5% der getesteten Leukämien in den Versuchstieren nach der Xenotransplantation nachgewiesen werden konnten. Die Gründe hierfür sind noch nicht ausreichend geklärt, beinhalten jedoch vermutlich Elemente des Homings, des Überlebens der Zelle in der fremden murinen Knochenmarknische, der Abwesenheit spezifischer humaner Wachstumsfaktoren, sowie intrinsische Unterschiede unter den verschiedenen Leukämieproben. Leukämien, die mit einer schlechten Prognose beim Patienten verbunden sind, wachsen in den Tieren stärker an. In den Versuchen konnte gezeigt werden, dass Leukämien mit einer Längenmutation des FLT3-Rezeptors eher häufiger in den NSG-Mäusen anwachsen, als wenn diese Mutation fehlt. Die Analyse der erstellten Wachstumskinetiken zweier Leukämien ergab, dass die Höhe des Engraftments in den einzelnen Organen sowohl von der transplantierten Zellmenge, als auch von der Höhe der angesetzten Versuchszeit abhängt. Zudem wurde ein Wachstum humaner T-Lymphozyten in den xenotransplantierten Mäusen beobachtet, welches sowohl mit einem höheren Engraftment der Leukämie in der Maus verbunden war, als auch mit einer höheren Tiersterblichkeit vergesellschaftet war.rnZum Verhindern dieses Wachstums wurden zwei unterschiedliche Methoden angewendet und miteinander verglichen. Dabei erzielten sowohl die medikamentöse Behandlung der Tiere mit dem Calcineurininhibitor Cyclosporin A, als auch die CD3-Depletion der Leukämie vor der Transplantation ein T-Zell-freies Wachstum in den Mäusen, letzteres erwies sich jedoch als das schonendere Verfahren. In den T-Zell-freien Tieren konnte bei dem Großteil der Tiere kein Engraftment im Knochenmark festgestellt werden, was auf einen positiven Einfluss der humanen T-Lymphozyten beim Vorgang des Engraftments schließen lässt.rn

HLA class II mismatch alleles as targets of the alloreactive CD4 T-cell response

In allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT), alloreactive T lymphocytes of donor origin mediate the beneficial graft-versus-leukemia effect but also induce graft-versus-host disease (GvHD). Since human leukocyte antigens (HLA) mismatch alleles represent major targets of alloreactive T lymphocytes, patient and donor are usually matched for the class I molecules A, B, C, and for the class II molecules DRB1 and DQB1, in order do reduce the risk of GvHD. The HLA-DPB1 locus, however, is still ignored in donor selection. Interestingly, clinical studies have demonstrated that disparities at HLA-DQB1 alleles as well as distinct HLA DPB1 mismatch constellations do not adversely affect the outcome of allo-HSCT. It has also been shown that HLA class II is predominantly expressed on hematopoietic cells under non-inflammatory conditions. Therefore, this PhD thesis focused on the application of CD4 T cells in adoptive immunotherapy of leukemias.rnIn the first part of this thesis we developed a rapid screening approach to detect T-cell reactivity of donors to single HLA class II mismatch alleles. Allo-HLA reactivity was measured in naive, memory, and entire CD4 T cells isolated from PBMC of healthy donors by flow cytometric cell sorting according to expression of the differentiation markers CD45RA, CD45RO, CD62L, and CCR7. T-cell populations were defined by a single marker to facilitate translation into a clinical-grade allo-depletion procedure. Alloreactivity to single HLA-DR/-DQ mismatch alleles was analyzed in short-term mixed lymphocyte reactions (MLR) in vitro. As standard antigen-presenting cells, we used the HLA-deficient cell line K562 upon electroporation with single HLA-DR/-DQ allele mRNA. We observed in IFN-γ ELISpot assays that allo-HLA-reactivity preferentially derived from subsets enriched for naive compared to memory T cells in healthy donors, irrespective of the HLA mismatch allele. This separation was most efficient if CD62L (P=0.008) or CD45RA (P=0.011) were used as marker. Median numbers of allo-HLA-reactive effector cells were 3.5-fold and 16.6-fold lower in CD62Lneg and CD45RAneg memory CD4 T cells than in entire CD4 T cells, respectively. In allele-specific analysis, alloreactivity to single HLA-DR alleles clearly exceeded that to HLA-DQ alleles. In terms of alloproliferation no significant difference could be observed between individual CD4 T-cell subsets. rnThe second part of this thesis dealed with the generation of allo-HLA-DQ/-DP specific CD4 T cells. Naive CD45RApos CD4 T cells isolated from healthy donor PBMC by flow cytometric cell sorting were stimulated in MLR against single allo-HLA-DQ/-DP alleles transfected into autologous mature monocyte-derived dendritic cells by mRNA electroporation. Rapidly expanding HLA-DQ/-DP mismatch reactive T cells significantly recognized and cytolysed primary acute myeloid leukemia (AML) blasts, fibroblasts (FB) and keratinocytes (KC) in IFN-γ ELISpot and 51chromium release assays if the targets carried the HLA DQ/ DP allele used for T cell priming. While AML blasts were recognized independent of pre-incubating them with IFN-γ, recognition of FB and KC required IFN-γ pre treatment. We further investigated HLA class II expression on hematopoietic and non-hematopoietic cells by flow cytometry. HLA class II was not detected on primary FB, KC, and non-malignant kidney cells, but was expressed at significant levels on primary AML blasts and B-LCL. Up-regulation of HLA class II expression was observed on all cell types after pre-incubation with IFN-γ.rnIn summary, the novel K562-HLA based MLR approach revealed that naive-depleted CD4 T-cell subsets of healthy individuals contain decreased allo-HLA reactivity in vitro. We propose the application of CD45RAneg naive-depleted CD4 T cells as memory T cell therapy, which might be beneficial for HLA-mismatched patients at high-risk of GvHD and low-risk of leukemia relapse. Memory T cells might also provide important post-transplant immune functions against infectious agents. Additionally, the screening approach could be employed as test system to detect donors which have low risks for the emergence of GvHD after allo-HSCT. In the second part of this thesis we developed a protocol for the generation of allo-HLA-DQ/-DP specific CD4 T cell lines, which could be applied in situations in which patient and donor are matched in all HLA alleles but one HLA-DQ/-DP allele with low GvHD potential. These T cells showed lytic activity to leukemia cells while presumably sparing non-hematopoietic tissues under non-inflammatory conditions. Therefore, they might be advantageous for allo-HSCT patients with advanced stage AML after reduced-intensity conditioning and T-cell depletion for the replenishment of anti-leukemic reactivity if the risk for disease relapse is high. rn

Zelluläre und molekulare Mechanismen der angeborenen Immunität

Die myeloide Zelllinie MUTZ-3 konnte als geeignetes Modellsystem zur Charakterisierung der TREM-1-Signaltransduktion etabliert werden, da diese TREM-1 und dessen essentielles Adaptermoleküle DAP12 funktional exprimiert. Übereinstimmend mit bisherigen Daten wurden die Kinasen PI3K und p38-MAPK als wichtige Regulatoren in der Signalweiterleitung nach TREM-1-Aktivierung identifiziert, wobei sich einige Unterschiede in der exakten Signalhierarchie zwischen monozytären und granulozytären Zellen ergaben. So erfolgt die Aktivierung von PI3K und p38-MAPK in PMN unabhängig voneinander und in monozytären Zellen findet die Aktivierung von p38-MAPK vor der Akt-Phosphorylierung statt und ist für Letztere notwendig. Zudem ist die Ca2+-Mobilisierung in PMN nur von PI3K abhängig und in monozytären Zellen von PI3K und p38-MAPK. Bei der durch TLR- oder NLR-Koligation gesteigerten TREM-1-Aktivierung sind PI3K und p38-MAPK ebenfalls zentrale Regulatoren. Es ergaben sich ebenfalls Unterschiede in der exakten TREM-1-Signaltransduktion.rnrnEin Mausmodell für invasive Aspergillose (IA) wurde erfolgreich etabliert, wobei die wichtige Rolle der PMN bei der Abwehr von Pilzinfektionen durch deren Depletion mit unterschiedlichen Antikörpern belegt wurde. Für das Abtöten von A. fumigatus-Konidien sind oxidative und nicht-oxidative PMN-Effektormechanismen notwendig. Dabei konnte die essentielle Rolle der oxidativen PMN-Effektorfunktionen anhand NADPH-Oxidase-defizienter p47phox-/- und gp91phox-/- Mäuse für das Überleben von Pilzinfektionen gezeigt werden. Dagegen war die Infektion von Neutrophiler Elastase defizienter ELANE Mäuse nicht letal. Dies deutet darauf hin, dass diese als prototypische Serinprotease und wichtiger Bestandteil der NET-Formation nicht essentiell für das Überleben von IA ist oder durch andere, nicht-oxidative Effektormechanismen kompensiert werden kann. Keinen Einfluss auf die IA hatte die Depletion von Arginin mittels ADI-PEG, da weder das Überleben der Mäuse noch das Abtöten der Pilzkonidien beeinflusst wurde. Außerdem wurden keine Veränderung in der Einwanderung und Aktivierung von PMN nach Infektion quantifiziert. Dagegen induzierte die Defizienz in ADAMTS13 (ADAMTS13-/- Mäuse) eine verminderte Rekrutierung von PMN, einhergehend mit erhöhter Mortalität, vermindertem Abtöten von A. fumigatus-Konidien und erhöhter Schädigung der Lunge bei IA. Da in vitro keine generellen oder pilzspezifischen Defekte der PMN quantifiziert wurden, muss ADAMTS13 die Einwanderung der PMN beeinflussen. Normalerweise spaltet die Protease ADAMTS13 den von-Willebrand-Faktor (vWF), der die Quervernetzung und das Anhaften von Blutplättchen an beschädigte Gefäßwände steuert. Ob und wie ADAMTS13 oder der vWF die verminderte PMN-Einwanderung bei Pilzinfektionen verursacht, muss weiter untersucht werden.rnrnZusammenfassend verbessern die erhaltenen Daten für eine zellspezifische TREM-1-Signaltransduktion, ein von oxidativen und nicht-oxidativen PMN-Effektorfunktionen abhängiges sowie Arginin-unabhängiges Abtöten vom Pilz A. fumigatus als auch der Einfluss von ADAMTS13 und vWF bei der Rekrutierung von PMN nach A. fumigatus-Infektion unser Verständnis der angeborenen Immunität. Diese Erkenntnisse dienen der zukünftigen Entwicklung von Therapien zur Behandlung von schweren Entzündungsreaktionen wie Aspergillose und Sepsis.

Identifizierung und Charakterisierung von Zielantigenen alloreaktiver zytotoxischer T-Zellen mittels cDNA-Bank-Expressionsklonierung in akuten myeloischen Leukämien

Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantationen (HSZTs) werden insbesondere zur Behandlung von Patienten mit Hochrisiko-Leukämien durchgeführt. Dabei bewirken T-Zellreaktionen gegen Minorhistokompatibilitätsantigene (mHAgs) sowohl den therapeutisch erwünschten graft-versus-leukemia (GvL)-Effekt als auch die schädigende graft-versus-host (GvH)-Erkrankung. Für die Identifizierung neuer mHAgs mittels des T-Zell-basierten cDNA-Expressionsscreenings waren leukämiereaktive T-Zellpopulationen durch Stimulation naïver CD8+-T-Lymphozyten gesunder HLA-Klasse I-identischer Buffy Coat-Spender mit Leukämiezellen von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) generiert worden (Albrecht et al., Cancer Immunol. Immunother. 60:235, 2011). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mit diesen im AML-Modell des Patienten MZ529 das mHAg CYBA-72Y identifiziert. Es resultiert aus einem bekannten Einzelnukleotidpolymorphismus (rs4673: CYBA-242T/C) des Gens CYBA (kodierend für Cytochrom b-245 α-Polypeptid; syn.: p22phox), der zu einem Austausch von Tyrosin (Y) zu Histidin (H) an Aminosäureposition 72 führt. Das mHAg wurde von T-Lymphozyten sowohl in Assoziation mit HLA-B*15:01 als auch mit HLA-B*15:07 erkannt. Eine allogene T-Zellantwort gegen CYBA-72Y wurde in einem weiteren AML-Modell (MZ987) beobachtet, die ebenso wie in dem AML-Modell MZ529 polyklonal war. Insgesamt konnte bei drei von fünf getesteten HLA-B*15:01-positiven Buffy Coat-Spendern, die homozygot für CYBA-72H (H/H) waren, eine CYBA-72Y-spezifische T-Zellantwort generiert werden. Das von den T-Lymphozyten übereinstimmend in niedrigster Konzentration erkannte Peptid umfasste die Aminosäuren 69 - 77, wobei das homologe Peptid aus CYBA-72H auch in hohen Konzentrationen keine Reaktivität auslöste. Eine reziproke Immunogenität des mHAg ist bislang nicht belegt. T-Lymphozyten gegen CYBA-72Y erkannten Leukämiezellen bei acht von zwölf HLA-B*15:01-positiven Patienten (FAB-Subtypen: M1, M2, M4, M5). Da das Gen CYBA für eine Komponente des mikrobiziden Oxidasesystems von phagozytierenden Zellen kodiert, ist es überwiegend in Zellen des hämatopoetischen Systems exprimiert. Von Leukozytensubtypen, aufgereinigt aus HLA-B*15:01-positiven Buffy Coat-Spendern mit CYBA-242T-Allel, wurden Monozyten und daraus abgeleitete dendritische Zellen durch CYBA-72Y-reaktive T-Lymphozyten sehr stark, untransformierte B-Zellen in weit geringerem Maße und Granulozyten sowie T-Lymphozyten nicht erkannt. Das für CYBA-72Y kodierende Allel CYBA-242T wurde bei 56% aller getesteten gesunden Spender und Malignompatienten (n=481) nachgewiesen. Unter Berücksichtigung der Häufigkeit des präsentierenden HLA-Allels ist davon auszugehen, dass etwa 4,5% der Kaukasier das mHAg CYBA-72Y zusammen mit HLA-B*15:01 tragen. Nach bisherigen Beobachtungen führt ein immunogener CYBA-72Y-Mismatch bei allogenen HSZTs nicht notwendigerweise zu einer schweren GvH-Erkrankung. Das hier beschriebene mHAg CYBA-72Y erscheint potenziell geeignet, im Rahmen einer allogenen HSZT die präferenzielle Elimination der Empfänger-Hämatopoese unter Einschluss von myeloischen Leukämiezellen zu bewirken. Jedoch sind weiterführende Untersuchungen erforderlich, um die therapeutische Relevanz des Antigens zu belegen.

Die Rolle von Chemokinrezeptor CXCR4 und Connective Tissue Growth Factor innerhalb der Tumor-Stroma-Interaktion in der akuten myeloischen Leukämie

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine heterogene Erkrankung der hämatopoetischen Vorläuferzelle, die durch unkontrollierte Vermehrung und ein reduziertes Differenzierungsverhalten gekennzeichnet ist. Aufgrund von Therapieresistenzen und häufig vorkommenden Rückfällen ist die AML mit einer schlechten Langzeitprognose verbunden. Neue Studienergebnisse zeigen, dass leukämische Zellen einer hierarchischen Ordnung unterliegen, an deren Spitze die leukämische Stammzelle (LSC) steht, welche den Tumor speist und ähnliche Charakteristika besitzt wie die hämatopoetische Stammzelle. Die LSC nutzt den Kontakt zu Zellen der hämatopoetischen Nische des Knochenmarks, um die erste Therapie zu überdauern und Resistenzen zu erwerben. Neue Therapieansätze versuchen diese Interaktion zwischen leukämischen Zellen und supportiv wirkenden Stromazellen anzugreifen. rnrnIn dieser Arbeit sollte die Bedeutung des CXC-Motiv Chemokinrezeptors Typ 4 (CXCR4) und des Connective Tissue Growth Factors (CTGF) innerhalb der AML-Stroma-Interaktion untersucht werden. CXCR4, der in vivo dafür sorgt, dass AML-Zellen in der Nische gehalten und geschützt werden, wurde durch den neuwertigen humanen CXCR4-spezifischen Antikörper BMS-936564/MDX-1338 in AML-Zelllinien und Patientenzellen in Zellkulturversuchen blockiert. Dies induzierte Apoptose sowie Differenzierung und führte in Kokulturversuchen zu einer Aufhebung des Stroma-vermittelten Schutzes gegenüber der Chemotherapie. Für diese Effekte musste teilweise ein sekundärer Antikörper verwendet werden, der die CXCR4-Moleküle miteinander kreuzvernetzt.rnDie Auswertung eines quantitativen Real time PCR (qPCR)-Arrays ergab, dass CTGF in der AML-Zelllinie Molm-14 nach Kontakt zu Stromazellen hochreguliert wird. Diese Hochregulation konnte in insgesamt drei AML-Zelllinien sowie in drei Patientenproben in qPCR- und Western Blot-Versuchen bestätigt werden. Weitere Untersuchungen zeigten, dass diese Hochregulation (i) unabhängig von der Stromazelllinie ist, (ii) den direkten Kontakt zum Stroma benötigt und (iii) auch unter hypoxischen Bedingungen, wie sie innerhalb des Knochenmarks vorherrschen, stattfindet. Der durch Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Kontakt gesteuerte Hippo-Signalweg konnte aus folgenden Gründen als möglicher upstream-Regulationsmechanismus identifiziert werden: (i) Dessen zentraler Transkriptions-Kofaktor TAZ wurde in kokultivierten Molm-14-Zellen stabilisiert, (ii) der shRNA-gesteuerte Knockdown von TAZ führte zu einer reduzierten CTGF-Hochregulation, (iii) CTGF wurde in Abhängigkeit von der Zelldichte reguliert, (iv) Cysteine-rich angiogenic inducer 61 (Cyr61), ein weiteres Zielgen von TAZ, wurde in kokultivierten AML-Zellen ebenfalls verstärkt exprimiert. Der Knockdown von CTGF führte in vitro zu einer partiellen Aufhebung der Stroma-vermittelten Resistenz und die Blockierung von CTGF durch den Antikörper FG-3019 wirkte im AML-Mausmodell lebensverlängernd. rn rnDie Rolle von CTGF in der AML ist bisher nicht untersucht. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass CTGF ein interessantes Therapieziel in der AML darstellt. Es bedarf weiterer Untersuchungen, um die Bedeutung von CTGF in der Tumor-Stroma-Interaktion näher zu charakterisieren und nachgeschaltete Signalwege zu identifizieren.

Optimierte biologische Aktivität allo- und tumorreaktiver CD8-+-T-Lymphozyten im humanisierten Mausmodell durch IL-15-Superagonisten

Interleukin 15 (IL-15) gilt als eines der vielversprechendsten zukünftigen Medikamente für die Krebstherapie. Es fördert die Proliferation, Persistenz und Funktion von CD8+ T-Zellen und vermittelt zahlreiche Effekte, die es als überlegene Alternative für das derzeit in der Klinik verwendete IL-2 erscheinen lassen. Für den Einsatz von IL-15 in der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein Protokoll zur Herstellung von rekombinantem IL-15 in E. coli etabliert. Das hergestellte Protein hatte eine zu kommerziellen Produkten vergleichbare Bioaktivität und begünstigte die Persistenz und Aktivität antigenspezifischer, humaner CD8+ T Zellen nach adoptivem Transfer in NSG-Mäuse, wobei unter anderem ein verstärkter Effekt auf T Zellen mit TSCM-Phänotyp beobachtet wurde. Um die Bioaktivität von IL-15 zu steigern, wurden super-agonistische IL-15-Fusions¬proteine entworfen und im Expi293-System hergestellt. Dabei wurde IL 15 kovalent mit der Sushi-Domäne, der IL-15Rα-Kette und einer IgG1-Fc-Domäne verbunden, was zu einer gesteigerten Affinität der IL 15-Superagonisten zum physiologischen, niederaffinen IL 15Rβγ und zu einer stark erhöhten Halbwertszeit in Mausserum führte. Die gesteigerte Affinität der IL-15-Super¬agonisten wurde durch die IL 15Rα-Sushi-Domäne vermittelt. Eine um 13 Amino¬säuren verlängerte Sushi-Domäne zeigte im Vergleich zur normalen Form eine nochmals ge¬steigerte Affinität. Die längere Halbwertszeit wurde von der Sushi- und der IgG1-Fc-Domäne vermittelt. Die IgG1-Fc-Domäne verstärkte die Wirkung der Fusionsproteine zusätzlich über einen Mechanismus, der wahrscheinlich mit der Transpräsentation durch Fc Re¬ze¬ptoren zusammen–hängt. Die gesteigerte Bioaktivität der IL-15-Superagonisten wurde im Tiermodell mit humanen und murinen T-Zellen bestätigt und ILR13+-Fc wurde als das Fusionsprotein mit der höchsten Bioaktivität identifiziert. Im Vergleich zu anderen IL-15-Superagonisten vereint es alle derzeit bekannten Eigenschaften zur Bioaktivitätssteigerung in einem einzigen Protein. In therapeutischen Versuchen mit adoptivem Transfer tumorreaktiver T-Zellen konnte der Antitumoreffekt durch ILR13+-Fc maßgeblich verstärkt werden. Als Modellsysteme wurden NSG-Mäuse, die mit humanen AML-Blasten oder einem soliden Ovarialkarzinom engraftet wurden, verwendet. Dabei wurden sowohl antigenspezifische als auch unspezifische Effekte beobachtet. Die unspezifischen Effekte wurden wahrscheinlich durch eine ILR13+-Fc-vermittelte Überexpression von NKG2D, einem Rezeptor der angeborenen Immunantwort, auf den adoptiv transferierten T Zellen vermittelt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass IL-15 und die IL-15-Superagonisten die Proliferation und Reaktivität von CD8+ T-Zellen im Rahmen der Immuntherapie fördern können. Aufgrund der hohen Bioaktivität und potenzierten Wirksamkeit, könnten vor allem die IL 15-Superagonisten in Zukunft bei der Entwicklung effizienter Therapiemethoden eingesetzt werden und dadurch einen wichtigen Beitrag zu Behandlung von Krebs leisten. rnrn