Die Expression und Regulation der CYP3A in menschlicher Haut

In Leber und Dünndarm bauen CYP3A-Enzyme eine Vielzahl von Fremdstoffen ab, die in den Körper gelangt sind. Zudem aber sind diese Enzyme auch in anderen Organen, wie der Haut exprimiert. Doch weder die genaue Zusammensetzung der CYP3A-Isozyme noch deren physiologische Rolle in der Haut sind bisher bekannt. Basierend auf begrenzten in vitro-Daten ist eine Rolle der CYP3A in der kutanen Vitamin D-Synthese denkbar. Auf der anderen Seite könnten die kutanen CYP3A auch lokal oder systemisch verabreichte Medikamente in der Haut verstoffwechseln und so zur Entstehung immunologischer und nicht-immunologischer unerwünschter Arzneimittelwirkungen beitragen, von denen sich bis zu 45 % in der Haut manifestieren.rnDie Arbeitshypothese dieses Projekts war, dass die CYP3A die kutane Synthese von Vitamin D regulieren. In dieser Funktion wurden sie zur Vermeidung von Vitamin D-Mangel-Erkrankungen wie Rachitis oder Osteomalazie in Europäern negativ selektiert. rnDie Expression und Regulation der CYP3A wurde in Hautbiopsien, einer Zelllinie epidermalen Ursprungs und primären Hautzellen wie auch in transgenen Mäusen untersucht. Die metabolische Aktivität der CYP3A gegenüber den kutanen Vitamin D-Vorstufen wurde mit Hilfe rekombinant exprimierter Enzyme untersucht. CYP3A5-mRNA war die häufigste der CYP3A in humanen Hautproben und überstieg die von CYP3A4 um das Dreifache, die von CYP3A7 um das 130-Fache. Damit entsprach diese 1,3 %, 0,01 % bzw. 0,01 % der jeweiligen hepatischen Genexpression. Die Expression von CYP3A43 war zu vernachlässigen. CYP3A5 zeigte eine bimodale Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene. So zeigten Träger der Wildtyp-Allels *1 eine 3,3-fach höhere mRNA- und 1,8-fach höhere Proteinmenge als homozygote Träger des Nullallels *3. CYP3A4/7- und CYP3A5-Protein wurde v. a. in den Keratinozyten der Epidermis und den Talgdrüsen, also den Bereichen der kutanen Vitamin D-Synthese lokalisiert. Die CYP3A5-Expression wurde ferner in der Haut transgener Mäusen gezeigt, die das Reportergen Luziferase unter Kontrolle des humanen CYP3A5-Promoters exprimieren. Verglichen mit der Leber war die kutane Expression des Vitamin D-Rezeptors (VDR) 100-fach höher, die der Xenosensoren CAR und PXR vergleichbar bzw. zu vernachlässigen. Dementsprechend erhöhte die Behandlung mit 1,25-Dihydroxyvitamin D, dem aktiven Vitamin D-Hormon, und dessen Vorstufen außer 7-Dehydrocholesterol, jedoch nicht der PXR-Ligand Rifampicin, die Expression der CYP3A. Wie in Zwei-Hybrid-Experimenten gezeigt, wurden die Effekte des 1,25-Dihydroxyvitamin D und dessen Vorstufen alleinig durch VDR vermittelt. Die Effektstärke hingegen war abhängig von Zellspender, Zellpassage und Zelltypus. Alle drei CYP3A-Isozyme metabolisieren Vitamin D zu einem oder mehreren unbekannten Metaboliten, jedoch nicht zu 25-Hydroxyvitamin D, dem direkten Vorläufer des aktiven Vitamin D. rnZusammengefasst legen die Daten nahe, dass die kutanen CYP3A, allen voran CYP3A5, die Vitamin D-Homöostase durch VDR-vermittelte Induktion des Abbaus von Vitamin D-Vorstufen regulieren. Dies zusammen mit Sequenzdaten liefert starke Indizien für Vitamin D als treibende Kraft der Selektion des CYP3A-Lokus in Europäern. Der Einfluss der CYP3A-Expression auf selektiv wirksame, klinisch relevante Knochenveränderungen wie Rachitis oder Osteomalazie müssen folgen.rn

Tissue engineering strategies for biomaterial-based anticancer drug delivery and enhancement of angiogenesis in tumor-resected bone

Patienten, die an Osteosarkom leiden werden derzeit mit intravenös applizierten krebstherapeutischen Mitteln nach Tumorresektion behandelt, was oftmals mit schweren Nebenwirkungen und einem verzögerten Knochenheilungsprozess einhergeht. Darüber hinaus treten vermehrt Rezidive aufgrund von verbleibenden neoplastischen Zellen an der Tumorresektionsstelle auf. Erfolgreiche Knochenregeneration und die Kontrolle von den im Gewebe verbleibenden Krebszellen stellt eine Herausforderung für das Tissue Engineering nach Knochenverlust durch Tumorentfernung dar. In dieser Hinsicht scheint der Einsatz von Hydroxyapatit als Knochenersatzmaterial in Kombination mit Cyclodextrin als Medikamententräger, vielversprechend. Chemotherapeutika können an Biomaterial gebunden und direkt am Tumorbett über einen längeren Zeitraum freigesetzt werden, um verbliebene neoplastische Zellen zu eliminieren. Lokal applizierte Chemotherapie hat diverse Vorteile, einschließlich der direkten zytotoxischen Auswirkung auf lokale Zellen, sowie die Reduzierung schwerer Nebenwirkungen. Diese Studie wurde durchgeführt, um die Funktionsfähigkeit eines solchen Arzneimittelabgabesystems zu bewerten und um Strategien im Bereich des Tissue Engineerings zu entwickeln, die den Knochenheilungsprozess und im speziellen die Vaskularisierung fördern sollen. Die Ergebnisse zeigen, dass nicht nur Krebszellen von der chemotherapeutischen Behandlung betroffen sind. Primäre Endothelzellen wie zum Beispiel HUVEC zeigten eine hohe Sensibilität Cisplatin und Doxorubicin gegenüber. Beide Medikamente lösten in HUVEC ein tumor-unterdrückendes Signal durch die Hochregulation von p53 und p21 aus. Zudem scheint Hypoxie einen krebstherapeutischen Einfluss zu haben, da die Behandlung sensitiver HUVEC mit Hypoxie die Zellen vor Zytotoxizität schützte. Der chemo-protektive Effekt schien deutlich weniger auf Krebszelllinien zu wirken. Diese Resultate könnten eine mögliche chemotherapeutische Strategie darstellen, um den Effekt eines zielgerichteten Medikamenteneinsatzes auf Krebszellen zu verbessern unter gleichzeitiger Schonung gesunder Zellen. Eine erfolgreiche Integration eines Systems, das Arzneimittel abgibt, kombiniert mit einem Biomaterial zur Stabilisierung und Regeneration, könnte gesunden Endothelzellen die Möglichkeit bieten zu proliferieren und Blutgefäße zu bilden, während verbleibende Krebszellen eliminiert werden. Da der Prozess der Knochengeweberemodellierung mit einer starken Beeinträchtigung der Lebensqualität des Patienten einhergeht, ist die Beschleunigung des postoperativen Heilungsprozesses eines der Ziele des Tissue Engineerings. Die Bildung von Blutgefäßen ist unabdingbar für eine erfolgreiche Integration eines Knochentransplantats in das Gewebe. Daher ist ein umfangreich ausgebildetes Blutgefäßsystem für einen verbesserten Heilungsprozess während der klinischen Anwendung wünschenswert. Frühere Experimente zeigen, dass sich die Anwendung von Ko-Kulturen aus humanen primären Osteoblasten (pOB) und humanen outgrowth endothelial cells (OEC) im Hinblick auf die Bildung stabiler gefäßähnlicher Strukturen in vitro, die auch effizient in das mikrovaskuläre System in vivo integriert werden konnten, als erfolgreich erweisen. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um prä-vaskularisierte Konstrukte herzustellen, die den Knochenheilungsprozess nach der Implantation fördern. Zusätzlich repräsentiert das Ko-Kultursystem ein exzellentes in vitro Model, um Faktoren, welche stark in den Prozess der Knochenheilung und Angiogenese eingebunden sind, zu identifizieren und zu analysieren. Es ist bekannt, dass Makrophagen eine maßgebliche Rolle in der inflammatorisch-induzierten Angiogenese spielen. In diesem Zusammenhang hebt diese Studie den positiven Einfluss THP-1 abgeleiteter Makrophagen in Ko-Kultur mit pOB und OEC hervor. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anwendung von Makrophagen als inflammatorischer Stimulus im bereits etablierten Ko-Kultursystem zu einer pro-angiogenen Aktivierung der OEC führte, was in einer signifikant erhöhten Bildung blutgefäßähnlicher Strukturen in vitro resultierte. Außerdem zeigte die Analyse von Faktoren, die in der durch Entzündung hervorgerufenen Angiogenese eine wichtige Rolle spielen, eine deutliche Hochregulation von VEGF, inflammatorischer Zytokine und Adhäsionsmoleküle, die letztlich zu einer verstärkten Vaskularisierung beitragen. Diese Resultate werden dem Einfluss von Makrophagen zugeschrieben und könnten zukünftig im Tissue Engineering eingesetzt werden, um den Heilungsprozess zu beschleunigen und damit die klinische Situation von Patienten zu verbessern. Darüber hinaus könnte die Kombination der auf Ko-Kulturen basierenden Ansätze für das Knochen Tissue Engineering mit einem biomaterial-basierenden Arzneimittelabgabesystem zum klinischen Einsatz kommen, der die Eliminierung verbliebener Krebszellen mit der Förderung der Knochenregeneration verbindet.

Neuartige kryogene Penning-Falle für den Nachweis von Spin-Übergängen eines Protons und Bestimmung seines g-Faktors

In dieser Arbeit wird der Entwurf, der Aufbau, die Inbetriebnahme und die Charakterisierung einer neuartigen Penning-Falle im Rahmen des Experiments zur Bestimmung des g-Faktors des Protons präsentiert. Diese Falle zeichnet sich dadurch aus, dass die Magnetfeldlinien eines äußeren homogenen Magnetfeldes durch eine ferromagnetische Ringelektrode im Zentrum der Falle verzerrt werden. Der inhomogene Anteil des resultierenden Magnetfeldes, die sogenannte magnetische Flasche, lässt sich durch den Koeffizient B2 = 297(10) mT/mm2 des Terms zweiter Ordnung der Ortsabhängigkeit des Feldes quantifizieren. Eine solche ungewöhnlich starke Feldinhomogenität ist Grundvoraussetzung für den Nachweis der Spinausrichtung des Protons mittels des kontinuierlichen Stern-Gerlach-Effektes. Dieser Effekt basiert auf der im inhomogenen Magnetfeld entstehenden Kopplung des Spin-Freiheitsgrades des gefangenen Protons an eine seiner Eigenfrequenzen. Ein Spin-Übergang lässt sich so über einen Frequenzsprung detektieren. Dabei ist die nachzuweisende Änderung der Frequenz proportional zu B2 und zum im Fall des Protons extrem kleinen Verhältnis zwischen seinem magnetischen Moment nund seiner Masse. Die durch die benötigte hohe Inhomogenität des Magnetfeldes bedingten technischen Herausforderungen erfordern eine fundierte Kenntnis und Kontrolle der Eigenschaften der Penning-Falle sowie der experimentellen Bedingungen. Die in der vorliegenden Arbeit entwickelte Penning-Falle ermöglichte den erstmaligen zerstörungsfreien Nachweis von Spin-Quantensprüngen eines einzelnen gefangenen Protons, was einen Durchbruch für das Experiment zur direkten Bestimmung des g-Faktors mit der angestrebten relativen Genauigkeit von 10−9 darstellte. Mithilfe eines statistischen Verfahrens ließen sich die Larmor- und die Zyklotronfrequenz des Protons im inhomogenen Magnetfeld der Falle ermitteln. Daraus wurde der g-Faktor mit einer relativen Genauigkeit von 8,9 × 10−6 bestimmt. Die hier vorgestellten Messverfahren und der experimentelle Aufbau können auf ein äquivalentes Experiment zur Bestimmung des g-Faktors des Antiprotons zum Erreichen der gleichen Messgenauigkeit übertragen werden, womit der erste Schritt auf dem Weg zu einem neuen zwingenden Test der CPT-Symmetrie im baryonischen Sektor gemacht wäre.

Die Regulation der Ubiquitinligase CHIP durch das Cochaperon BAG2 im zellulären System und im Kontext der replikativen Seneszenz

Eine funktionierende Proteinqualitätskontrolle ist essenziell für die Vitalität einer Zelle. Das dynamische Gleichgewicht zwischen Proteinfaltung und -degradation wird von molekularen Chaperonen aufrechterhalten, deren Aktivität wiederum durch die Interaktion mit zahlreichen Cochaperonen moduliert wird. Das Cochaperon CHIP ist ein zentraler Faktor in Proteintriage-Entscheidungsprozessen, da es als Ubiquitinligase Chaperonsubstrate dem Abbau zuführt und somit die Chaperonmaschinerie direkt mit den Systemen der Proteindegradation verbindet. Um Polypeptide vor einem vorzeitigen Abbau zu schützen, wird die destruktive Aktivität von CHIP durch weitere Cochaperone reguliert. rnIn dieser Arbeit konnte die Hemmung der Ligaseaktivität von CHIP durch das Cochaperon BAG2 mechanistisch erstmals in einem zellulären System nachgewiesen werden. Dazu wurde die humane IMR-90 Fibroblasten Zelllinie verwendet. Die Ubiquitinierungsaktivität von CHIP wurde anhand von HSP72 als Modell-CHIP-Substrat untersucht. Durch die verringerte Ubiquitinierung, und damit dem reduzierten Abbau von HSP72, regulierte BAG2 dessen intrazelluläre Proteinspiegel, ohne dabei selbst eine Hitzeschockantwort zu induzieren. Überexprimiertes BAG2 wirkte sich trotz stabilisierter HSP72-Spiegel bei einem appliziertem Hitzestresses negativ auf die Zellvitalität aus, vermutlich da BAG2 durch die Inhibition von CHIP-vermittelter Ubiquitinierung massiv in das Gleichgewicht zwischen Substratfaltung und -degradation eingreift.rnDa sich die Mechanismen der Proteinqualitätskontrolle in der Alterung stark verändern und sich den wandelnden Bedingungen in der Zelle anpassen, wurde in einem zweiten Teil dieser Arbeit mit Hilfe des IMR-90 Zellsystems als etabliertes Modell zellulärer Seneszenz analysiert, inwieweit sich die Aktivität und die Regulation von CHIP durch BAG2 in der zellulären Alterung ändern. In seneszenten Zellen war HSP72 erheblich weniger ubiquitiniert als in jungen Fibroblasten, was auf eine reduzierte CHIP-Aktivität hinweist. Diese blieb jedoch durch BAG2 weiterhin modulierbar. Die Funktion von BAG2 als Inhibitor der Ubiquitinligase CHIP blieb demnach in seneszenten Zellen bestehen. In gealterten Fibroblasten regulierte BAG2 außerdem die Proteinspiegel des CHIP-Substrates und Seneszenzinitiators p53, was BAG2 eine mögliche Rolle in der Etablierung des Seneszenz-Phänotyps zuspricht. Weiterhin unterlagen die Proteinspiegel der beiden funktionell redundanten CHIP-Modulatoren BAG2 und HSPBP1 in der zellulären Alterung einer reziproken Regulation. In gealterten Mäusen trat die gegenläufige Veränderung der beiden Cochaperone gewebsspezifisch in der Lunge auf. Außerdem waren die BAG2-Proteinspiegel im Hippocampus gealterter Tiere signifikant erhöht.rnZusammenfassend konnte anhand der erzielten Ergebnisse die Funktion von BAG2 als Inhibitor von CHIP im zellulären System bestätigt werden. Außerdem durchlaufen die Aktivität und die Regulation von CHIP einen seneszenzspezifischen Adaptationsprozess, welcher für die Erhaltung der Proteostase in der Alterung relevant sein könnte und in welchem die Funktion von BAG2 als CHIP-Modulator möglicherweise eine wichtige Rolle spielt.rnZukünftige Studien könnten die komplexen Mechanismen weiterführend aufklären, mit denen CHIP-Aktivität reguliert wird. Dies kann helfen, der altersbedingten Abnahme an proteostatischer Kontrolle entgegenzuwirken und aberrante Proteinaggregation in altersassoziierten Erkrankungen vorzubeugen.rn

Funktionelle Charakterisierung der Protein-Kinase CK2 in der Suppression Th2-vermittelter Immunantworten durch regulatorische T-Zellen

Regulatorische T-Zellen (Tregs) leisten durch ihre suppressiven Eigenschaften einen essenziellen Beitrag zur Aufrechterhaltung der immunologischen Toleranz. Sie verhindern schädliche Immunreaktionen gegen Autoantigene, kommensale Bakterien, sowie harmlose Nahrungsmittel-bestandteile. Gleichzeitig gewährleisten sie die Entwicklung effektiver Immunantworten gegen eindringende Pathogene, wie z.B. Parasiten, Bakterien und Viren. Damit haben Tregs direkten Einfluss auf das Gleichgewicht zwischen Immunität und Toleranz. Fehler in der suppressiven Funktionsweise von Tregs begünstigen daher auf der einen Seite die Entstehung zahlreicher autoimmuner Erkrankungen und Allergien. Auf der anderen Seite können Tregs Immunreaktionen bei chronischen Infektionen reduzieren, sowie die Entstehung effektiver Immunantworten gegen Tumore hemmen. Ihre Beteiligung an der Ätiologie all dieser Krankheiten macht Tregs zu einem bedeutenden potenziellen Zielobjekt, um diese Krankheiten effektiv zu therapieren. Die Erweiterung des Grundwissens um die molekularen Mechanismen der Treg-vermittelten Suppression ist daher ein notwendiger Schritt bei der Entwicklung Treg-basierter Theraphieansätze. 2003 konnte mit Foxp3 ein Transkriptionsfaktor identifiziert werden, der maßgeblich die suppressiven Funktionen von Tregs steuert. Um weiteren Einblick in die der Suppression zugrundeliegenden Signalwege zu erhalten, wurde im Institut für Immunologie ein komparativer Kinomarray durchgeführt, anhand dessen die Casein Kinase 2 (CK2) als eine der aktivsten Kinasen in Tregs identifiziert wurde (Daten freundlicherweise von Prof. Dr. Tobias Bopp bereitgestellt). rnBasierend auf den Ergebnissen des Kinomarrays wurde in dieser Arbeit die Funktion der CK2 in Tregs untersucht. Dabei konnte in in vitro Experimenten die Treg-vermittelte Suppression durch den pharmakologische CK2 Inhibitor DMAT aufgehoben werden. Weil derartige Inhibitoren jedoch nicht absolut spezifisch die Aktivität nur einer Kinase supprimieren, wurden außerdem Mäuse mit konditionalem „knockout“ der CK2β Untereinheit spezifisch in Tregs gekreuzt (CK2βTreg-/- Mäuse). Die Analyse dieser Tiere offenbarte eine essenzielle Beteiligung der CK2 an den suppressiven Funktionen von Tregs. So entwickeln CK2βTreg-/- Mäuse mit zunehmendem Alter Splenomegalien und Lymphadenopathien, von denen in besonderem Maße die Mukosa-assoziierten Lymphknoten betroffen sind. Eine Analyse des Aktivierungsstatus der T-Zellen in den Tieren konnte zudem einen erhöhten Anteil sogenannter Effektor-Gedächtnis T-Zellen aufdecken, die charakteristische Merkmale eines Th2 Phänotyps zeigten. Erhöhte Titer des Antikörperisotyps IgE in den Seren von CK2βTreg-/- Mäusen suggerieren zusätzlich eine fehlerhafte Suppression speziell Th2-vermittelter Immunantworten durch CK2β-defiziente Tregs. In Th2-vermittelten Asthma Experimenten in vivo konnte der Verdacht der fehlerhaften Kontrolle von Th2-Antwort bestätigt werden, wobei zusätzlich aufgedeckt wurde, dass bereits unbehandelte CK2βTreg-/- Mäuse Zeichen einer Entzündungsreaktion in der Lunge aufweisen. Bei der Suche nach den molekularen Ursachen der fehlerhaften Suppression Th2-vermittelter Immunantworten durch CK2β-defiziente Tregs konnten zwei mögliche Erklärungsansätze gefunden werden. Zum einen zeigen CK2β-defiziente Tregs eine verringerte Expression von Foxp3, was, in Analogie zu Ergebnissen der Gruppe von R. Flavell (Wang Y.Y. Nature. 445, 766-770 (2007)), zu einer Konversion von Tregs zu Th2 Zellen und damit zur Entstehung eines Th2-basierten, autoimmunen Phänotyps führt. Des Weiteren weisen CK2β-defiziente Tregs eine reduzierte Expression des Transkriptionsfaktors IRF4 auf, der in Tregs entscheidend für die Kontrolle Th2-basierter Immunreaktionen ist (Zheng Y. Nature. 19; 351-356 (2009)). Die dargelegten Ergebnisse identifizieren die CK2 damit als Kinase, die entscheidend an der Treg-vermittelten Suppression speziell Th2-basierter Immunantworten beteiligt ist. Demnach könnten pharmakologische CK2 Inhibitoren beispielsweise dazu eingesetzt werden, um die Treg-vermittelte Suppression im Rahmen chronischer Parasiten-Infektionen aufzuheben. Die in CK2βTreg-/- Mäusen beobachtete Prävalenz der Funktion der CK2 für Mukosa-assoziierte Organe stellt dabei einen zusätzlichen Vorteil dar, weil systemische Nebenwirkungen, die durch die Blockade der Treg-vermittelte Suppression entstehen, zumindest in nicht-Mukosa-assoziierten Geweben nicht zu erwarten sind.rn

Signaltransduktion in der membranständigen Sensor-Histidinkinase DcuS von Escherichia coli

Escherichia coli kann unter aeroben und anaeroben Bedingungen mit C4-Dicarboxylaten wachsen, die Regulation des Stoffwechsels erfolgt durch das Zwei-Komponenten-System DcuSR. Die C4-Dicarboxylattransporter DctA (aerob) bzw. DcuB (anaerob) agieren als Co-Regulatoren und bilden gemeinsam mit der Sensor-Histidinkinase DcuS einen Sensorkomplex, in dem DcuS den Sensor darstellt und DctA bzw. DcuB diesen in seine rezeptive Form überführen. DcuS ist membranständig und verknüpft die Bindung von C4-Dicarboxylaten im Periplasma mit der Autophosphorylierung seiner Kinasedomäne im Cytoplasma. Dies stellt den Beginn einer Signalkaskade vom extrazellulären Reiz zum cytoplasmatischen Responseregulator DcuR dar.rnIn dieser Arbeit wurde die intramolekulare Signaltransduktion in DcuS und über die Membran untersucht. Der Fokus lag auf der Funktion der beiden Transmembranhelices TM1 und TM2 und der cytoplasmatischen PAS-Domäne, die die sensorische PASp- mit der effektorischen Kinasedomäne verbinden. Konformationsänderungen dieser Signalweiterleitung wurden durch Cysteinzugänglichkeitsstudien, oxidatives Cystein-Crosslinking und Mutageneseexperimente analysiert. rnTM2 wurde als der Überträger eines transmembranen Signals identifiziert, während TM1 als Membrananker fungiert. Der aktive Signalzustand von TM2 wird unabhängig von der Art der DcuS-Aktivierung (Effektorbindung, Deletion des Co-Regulators DctA oder PASc-ON-Mutationen) eingenommen. Der Signaltransduktion liegt eine Verschiebung von TM2 entlang ihrer Längsachse (Kolbenhub) in Richtung Periplasma zu Grunde. Cystein-Crosslinking offenbarte eine durchgehende Helix aus PASp-α6 und TM2, die im Dimer parallel mit ihrem Pendant verschoben wird. Die Amplitude des Kolbenhubs wurde anhand von Zugänglichkeitsveränderungen, der Lage verankernder Tryptophanreste, Strukturvergleichen und energetischen Berechnungen auf max. 4 - 6 Å festgelegt. Sie ist von der Effektorstärke abhängig und koppelt so die metabolische Bevorzugung einzelner Substrate an das Ausmaß des Kolbenhubs und der Genexpression. Für die cytoplasmatische PAS-Domäne wurde ein Zusammenhang zwischen lokaler Dimerisierung und Kontrolle der Sensorfunktion nachgewiesen. Schwächung der Dimerisierung führt zu einer Aktivierung der Sensorkinase. Es wurde eine hydrophobe Region identifiziert, deren strukturelle Integrität für diese Dimerisierung essentiell ist. Mit N248 wurde ein funktionell bedeutender Rest beschrieben, der auf Grund seiner Lage und seiner Eigenschaft mehrere Sekundärstrukturelemente zu verknüpfen, als Scharnier innerhalb der Domäne an der Umsetzung des Kolbenhubs in eine veränderte Quartärstruktur von PASc beteiligt sein könnte.

Magnetische Multischalenpartikel für den Transport von siRNA

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung eines nichtviralen, effizienten Transfektionsmittels mit einer Kern-Schale-Struktur in der Größenordnung bis 100 nm. Dafür werden magnetische, negativ geladene Eisenoxid-Nanopartikel mittels Thermolyse mit einem Durchmesser von 17 nm synthetisiert und in Wasser überführt. Diese Nanopartikel bilden den Kern des Erbgut-Trägers und werden mittels Layer-by-Layer –Verfahren (LbL) mit geladenen Polymeren, den bioabbaubaren Makromolekülen Poly-L-Lysin und Heparin, beschichtet. Dafür wird zunächst eine geeignete Apparatur aufgebaut. Diese wird zur Herstellung von Kern-Schale-Strukturen mit fünf Polyelektrolytschichten verwendet und liefert Partikel mit einem hydrodynamischen Durchmesser von 58 nm, die bei Abwesenheit von niedermolekularem Salz aggregatfrei sind. Das System wird gegen Salz stabilisiert, indem die letzte Poly-L-Lysin-Schicht mit Polyethylenglycol modifiziert wird. Die so entstandenen Multischalenpartikel zeigen weder im PBS-Puffer noch in humanem Serum Aggregation. Mittels winkelabhängiger dynamischer Lichtstreuung wird die Aggregatbildung kontrolliert, während ζ-Potential-Messungen die Kontrolle der Oberflächenladung erlauben.rnDa siRNA auf Grund ihres negativ geladenen Phosphat-Rückgrats ebenfalls ein Polyelektrolyt ist, wird sie aggregatfrei auf die positiv geladenen PLL-Nanopartikel aufgetragen. Die eingesetzte siRNA ist farbstoffmarkiert, um eine Detektion in vitro zu ermöglichen. Jedoch sind die entstandenen Komplexe mittels Fluoreszenzkorrelations-spektroskopie (FCS) nicht nachweisbar. Auch die Fluoreszenzmarkierung der PEGylierten Außenschale mittels kupferfreier Click-Chemie ist in der FCS nicht sichtbar, sodass eine Fluoreszenzauslöschung der Farbstoffe in den Multischalenpartikeln vermutet wird.rn

Controllable assembly of graphene hybrid materials and their application in energy storage and conversion

Hybrid Elektrodenmaterialien (HEM) sind der Schlüssel zu grundlegenden Fortschritten in der Energiespeicherung und Systemen zur Energieumwandlung, einschließlich Lithium-Ionen-Batterien (LiBs), Superkondensatoren (SCs) und Brennstoffzellen (FCs). Die faszinierenden Eigenschaften von Graphen machen es zu einem guten Ausgangsmaterial für die Darstellung von HEM. Jedoch scheitern traditionelle Verfahren zur Herstellung von Graphen-HEM (GHEM) scheitern häufig an der fehlenden Kontrolle über die Morphologie und deren Einheitlichkeit, was zu unzureichenden Grenzflächenwechselwirkungen und einer mangelhaften Leistung des Materials führt. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Herstellung von GHEM über kontrollierte Darstellungsmethoden und befasst sich mit der Nutzung von definierten GHEM für die Energiespeicherung und -umwandlung. Die große Volumenausdehnung bildet den Hauptnachteil der künftigen Lithium-Speicher-Materialien. Als erstes wird ein dreidimensionaler Graphen Schaumhybrid zur Stärkung der Grundstruktur und zur Verbesserung der elektrochemischen Leistung des Fe3O4 Anodenmaterials dargestellt. Der Einsatz von Graphenschalen und Graphennetzen realisiert dabei einen doppelten Schutz gegen die Volumenschwankung des Fe3O4 bei dem elektrochemischen Prozess. Die Leistung der SCs und der FCs hängt von der Porenstruktur und der zugänglichen Oberfläche, beziehungsweise den katalytischen Stellen der Elektrodenmaterialien ab. Wir zeigen, dass die Steuerung der Porosität über Graphen-basierte Kohlenstoffnanoschichten (HPCN) die zugängliche Oberfläche und den Ionentransport/Ladungsspeicher für SCs-Anwendungen erhöht. Desweiteren wurden Stickstoff dotierte Kohlenstoffnanoschichten (NDCN) für die kathodische Sauerstoffreduktion (ORR) hergestellt. Eine maßgeschnittene Mesoporosität verbunden mit Heteroatom Doping (Stickstoff) fördert die Exposition der aktiven Zentren und die ORR-Leistung der metallfreien Katalysatoren. Hochwertiges elektrochemisch exfoliiertes Graphen (EEG) ist ein vielversprechender Kandidat für die Darstellung von GHEM. Allerdings ist die kontrollierte Darstellung von EEG-Hybriden weiterhin eine große Herausforderung. Zu guter Letzt wird eine Bottom-up-Strategie für die Darstellung von EEG Schichten mit einer Reihe von funktionellen Nanopartikeln (Si, Fe3O4 und Pt NPs) vorgestellt. Diese Arbeit zeigt einen vielversprechenden Weg für die wirtschaftliche Synthese von EEG und EEG-basierten Materialien.

Induktion tolerogener dendritischer Zellen zur Suppression von experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis und Kontaktallergie

Dendritische Zellen (DC) spielen als professionelle antigenpräsentierende Zellen (APC) eine zentrale Rolle in der Aktivierung und Regulierung antigenspezifischer Immunantworten. Aus diesem Grund wird der therapeutische Einsatz von DC zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Allergien sowie zur Tumorbekämpfung erforscht. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit untersuchten wir das Potenzial einer biolistischen DNA-Vakzinierung zur Induktion tolerogener DC in vivo. Im Tiermodell der Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein Peptid 35-55 (MOGp35-55) induzierten experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) sollte mittels präventiver biolistischer Kovakzinierung von Plasmid-DNA kodierend für MOG und die immunregulatorischen Zytokine TGFβ oder IL-10 eine protektive Immunität induziert werden. Die MOG-Expression stand dabei entweder unter der Kontrolle des ubiquitär aktiven CMV-Promotors oder des murinen Fascin-Promotors, um eine ektopische MOG-Expression spezifisch in dermalen DC und Langerhanszellen zu erreichen. Dass MOGp35-55-präsentierende DC nach biolistischer DNA-Vakzinierung von der Haut in die drainierenden Lymphknoten migrieren und dort T-Zellen aktivieren, konnte im Vorfeld anhand einer substanziellen Proliferation von MOGp35-55-reaktiven 2D2 T-Zellen nachgewiesen werden. Im präventiven Ansatz der MOGp35-55-induzierten EAE zeigten Mäuse, die mit MOG-kodierenden Plasmiden biolistisch transfiziert wurden, eine leicht reduzierte EAE-Symptomatik. Die Kotransfektion von MOG und TGFβ führte zu einer Verstärkung der EAE-Suppression – unabhängig davon, ob die MOG-Expression unter der Kontrolle des CMV- oder des Fascin-Promotors stand. Interessanterweise resultierte die Koapplikation von MOG- und IL-10-kodierender Plasmid-DNA nur bei DC-fokussierter MOG-Expression zu reduzierter EAE-Symptomatik. Für biolistische DNA-Vakzinierungen stellt somit der Fascin-Promotor eine potente Alternative zu viralen Promotoren dar. Entsprechend der milderen EAE-Symptome beobachteten wir bei behandelten EAE-Mäusen einen geringeren Grad an Demyelinisierung sowie eine reduzierte Infiltration des ZNS mit IFNγ-produzierenden CD4+ Th1- und IL-17-produzierenden CD4+ Th17-Zellen. Desweiteren zeigten Milzzellen ex vivo nach MOGp35-55-Restimulation eine inhibierte Proliferation und eine signifikant reduzierte IFNγ- und IL-17-Zytokinproduktion. Überraschenderweise ging die antigenspezifische Immunsuppression nicht mit der Expansion von Foxp3+ regulatorischen T-Zellen einher. Da die Milzen aber erhöhte Mengen an CD8+IFNγ+ T-Zellen aufweisen, könnte ein zytotoxisch-suppressiver Mechanismus für die Inhibition der Th1- und Th17-Immunantwort verantwortlich sein. Nachfolgende Untersuchungen sind notwendig, um die induzierten immunologischen Mechansimen mittels biolistischer DNA-Vakzinierung aufzuklären. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Generierung von tolerogenen DC in vitro. Dafür wurden murine Knochenmarkszellen unter DC-differenzierenden Bedingungen in Gegenwart des synthetischen Glucocorticoids Dexamethason (DEX) kultiviert. Die DEX-Zugabe führte zur Differenzierung von APC mit geringer CD11c-Expression. DEX-APC waren in vitro weitestgehend gegen LPS stimulierungsresistent und zeigten eine reduzierte Expression von MHC-II und den kostimulatorischen Molekülen CD80, CD86 und CD40. Ihrem tolerogenen Phänotyp entsprechend besaßen DEX-APC ein geringeres syngenes T-Zellstimulierungspotenzial als unbehandelte BM-DC. Anhand der erhöhten Oberflächenexpression von CD11b, GR1 und F4/80 besteht eine phänotypische Ähnlichkeit zu myeloiden Suppressorzellen. Die Fähigkeit von DEX-APC in vivo antigenspezifische Toleranz zu induzieren, wurde durch einen therapeutischen Ansatz im murinen Krankheitsmodell der Kontaktallergie überprüft. Die therapeutische Applikation von DEX-APC führte hierbei im Vergleich zur Applikation von PBS oder unbehandelten BM-DC zu einer signifikant reduzierten Ohrschwellungsreaktion. Zusammenfassend demonstrieren die Ergebnisse dieser Arbeit, dass potente tolerogene DC sowohl in vivo als auch in vitro induziert werden können. Dass diese Zellpopulation effektiv antigenspezifische Immunreaktionen supprimieren kann, macht sie zu einem vielversprechenden Werkzeug in der Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Allergien.rn

Chaperone BiP: Master regulator of the unfolded protein response (UPR) and its role in regulation of angiogenesis

Verschiedene Krankheiten gehen mit einer fehlerhaften Vaskularisierung einher. Allerdings ist der Erfolg der derzeitig vorhandenen Therapieansätze, die sich z.B. auf VEGF fokussieren, beschränkt. Aus diesem Grund ist es wichtig, neue Strategien zur Regulation der Angiogenese zu entwickeln. Hierbei stehen neue Signaltransduktions-wege im Fokus, die sich als vielversprechend erweisen, um Angiogenese zu fördern oder zu inhibieren. Die Blutgefäßneubildung ist ein hochregulierter Prozess, der mit einer hohen Proteinsyntheserate verknüpft ist. Die Angiogenese wurde bereits mit dem ER-Stress Signaltransduktionsweg, der Unfolded Protein Response (UPR), in Verbindung gebracht (Zeng et al., 2013; Bouvier et al., 2012). Eine im Rahmen der vorliegenden Studie durchgeführte histologische Untersuchung konnte eine Fehlregulierung der Expression von UPR beteiligten Proteinen in vivo unter pathologischen Bedingungen gezeigt werden. Bemerkenswerter Weise war BiP, der Hauptsensor der UPR, in Endothelzellen von Angiosarkomen sehr stark exprimiert. In in vitro Experimenten wurde gezeigt, dass das Herunterregulieren von BiP mittels RNAi Einfluss auf die inflammatorische Antwort und die Bildung angiogener Strukturen in Endothelzellen nimmt. Das Herunterregulieren des Proteins BiP verstärkte die inflammatorische Antwort von HUVEC, was sich in einer gesteigerten Bildung von IL-8 und ICAM-1 äußerte und wurde auf die Aktivierung der UPR durch die verringerte Menge an BiP zurückgeführt. Der Phänotyp BiP-herunterregulierter Zellen entsprach dem untransfizierter Zellen, welcher durch das Cytoskelett und die Expression des endothelspezifischen Markers CD31 charakterisiert wurde. Im Gegensatz dazu änderte sich der Grad der Glykosylierung in transfizierten Zellen. Im Hinblick auf die Blutgefäßbildung, zeigten sich eine gehemmte Migration und eine inhibierte Bildung Gefäß-ähnlicher Strukturen in BiP-herunterregulierten Zellen. In diesen Zellen war die Expression von KDR auffallend stark inhibiert, wohingegen die Flt-1 Expression sich als gleichbleibend herausstellte, was ebenfalls auf die Aktivierung der UPR zurückgeführt werden konnte. Alternativ wäre der reduzierte Level des Proteins BiP im Hinblick auf die Funktion als Helferenzym in der Proteinfaltung eine mögliche Erklärung für die gehemmte Expression von KDR. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass stabile Spiegel von BiP die Regulierung der Angiogenese durch die Kontrolle der UPR in physiologischen Prozessen unterstützen könnte. Eine Fehlregulierung von BiP durch Unterdrückung der UPR, wie z.B. in malignen Tumoren, könnte Tumorzellen und beteiligten Endothelzellen einen Vorteil verschaffen und zu einer gestörten Vaskularisierung führen. Somit stellt das Stresssensorprotein BiP und die UPR einen potentiellen Angriffspunkt für die Regulation der Angiogenese dar.

Field-free control of magnetism in nanostructured materials probed with high resolution X-ray microscopy

Magnetic memories are a backbone of today's digital data storage technology, where the digital information is stored as the magnetic configuration of nanostructured ferromagnetic bits. Currently, the writing of the digital information on the magnetic memory is carried out with the help of magnetic fields. This approach, while viable, is not optimal due to its intrinsically high energy consumption and relatively poor scalability. For this reason, the research for different mechanisms that can be used to manipulate the magnetic configuration of a material is of interest. In this thesis, the control of the magnetization of different nanostructured materials with field-free mechanisms is investigated. The magnetic configuration of these nanostructured materials was imaged directly with high resolution x-ray magnetic microscopy. rnFirst of all, the control of the magnetic configuration of nanostructured ferromagnetic Heusler compounds by fabricating nanostructures with different geometries was analyzed. Here, it was observed that the magnetic configuration of the nanostructured elements is given by the competition of magneto-crystalline and shape anisotropy. By fabricating elements with different geometries, we could alter the point where these two effects equilibrate, allowing for the possibility to tailor the magnetic configuration of these nanostructured elements to the required necessities.rnThen, the control of the magnetic configuration of Ni nanostructures fabricated on top of a piezoelectric material with the magneto-elastic effect (i.e. by applying a piezoelectric strain to the Ni nanostructures) was investigated. Here, the magneto-elastic coupling effect gives rise to an additional anisotropy contribution, proportional to the strain applied to the magnetic material. For this system, a reproducible and reversible control of the magnetic configuration of the nanostructured Ni elements with the application of an electric field across the piezoelectric material was achieved.rnFinally, the control of the magnetic configuration of La0.7Sr0.3MnO3 (LSMO) nanostructures with spin-polarized currents was studied. Here, the spin-transfer torque effect was employed to achieve the displacement of magnetic domain walls in the LSMO nanostructures. A high spin-transfer torque efficiency was observed for LSMO at low temperatures, and a Joule-heating induced hopping of the magnetic domain walls was observed at room temperatures, allowing for the analysis of the energetics of the domain walls in LSMO.rnThe results presented in this thesis give thus an overview on the different field-free approaches that can be used to manipulate and tailor the magnetization configuration of a nanostructured material to the various technological requirements, opening up novel interesting possibilities for these materials.

Phosphonate ligands in extended inorganic hybrids and as radical units in complexes

Phosphonatliganden in erweiterten anorganischen Hybridmaterialien undrnals Radikalträgern in KomplexenrnrnAnorganisch-organische Hybridmaterialien sind in der Regel extrem vielseitig. Die systematische Darstellung von niederdimensionalen Materialien (eindimensionale Kettenverbindungen oder zweidimensionalen Schichtverbindungen) mit einer Kontrolle über die Art der Verbindung,rnbietet neue Möglichkeiten im Bereich des molekularen Magnetismus. Hier im Fall von Metall-Phosphonat Verbindungen in erweiterten anorganischen Hybriden wurde der pH - Wert während der Reaktion eingestellt, wodurch der Grad der Protonierung des Phosphonatliganden kontrolliert wurde. Aufgrund der Tatsache, dass alle erhaltenen Metall Phosphonatverbindungen neutral waren, konnte das Ligand zu Metallverhältnis erstmals vorhergesagt werden. So wurden mehrere neue Metall–Phosphonat Verbindungen im Bereich von Null-dimensionalen (I0O0, Co-Kristallisation von M(H2O)6 mitrndeprotonierten Phosphonatligand), über eindimensionalen (I1O0, Kettenstrukturen) bis hin zu zweidimensionalen (I2O0, Schichtstrukturen) ausführlich diskutiert in Bezug auf ihr magnetisches Verhalten. Im Allgemeinen sind die erwarteten Austauschwechselwirkungen in einem erweiterten anorganischen Hybridmaterial stark, weil oft ein Superaustausch durch ein einzelnes Sauerstoffatom möglich ist. Hier waren oft mehrere konkurrierende Austauschwechselwirkungen vorhanden, so dass kompliziertere magnetische Verhalten beobachtet wurden.rnrnDarüber hinaus wurden drei neue Beispiele von Nitronyl-Nitroxidradikale dargestellt, in denen eine zusätzliche saure Funktionalität eingeführt war. Die Auswirkungen des sauren Charakters der zusätzlich eingeführten Sulfonsäure oder Phosphonsäure-Gruppe auf das Nitronyl-Nitroxidradikal wurden im Detail zum ersten Mal untersucht. Die mit der Phosphonsäure-Gruppe versehenen Nitronyl-Nitroxidradikale sind perfekte Proben für die Untersuchung einer Spin-Verschiebung in Nitronyl-Nitroxidradikale durch EPR-Spektroskopie, aufgrund des eingeführten Phosphors. Auch der Protonierungsgrad der zusätzlich eingeführten Phosphonsäure-Gruppe wurde berücksichtigt. In dieser Arbeit wurden die ersten Metallkomplexe der neuen substituierten sauren Nitronyl-Nitroxidradikale vorgestellt. Die Koordination von Nickel(II) Metallionen an die saure, zweite funktionelle Gruppe des Nitronyl–Nitroxid Radikal wurde beschrieben. Die magnetische Austauschwechselwirkung der Metallionen untereinander und die Metall-Radikal-Austauschwechselwirkungen wurden untersucht. rnrnIm Allgemeinen können interessante molekulare magnetische Materialien dadurch dargestellt werden, dass die Dimension der Metall-Phosphonat-Verbindungen als Beispiele für die erweiterten anorganischen Hybridmaterialien gesteuert werden kann. Mit Nitronyl-Nitroxidradikale als organische Liganden können in Zukunft noch mehr Spin-Träger in anorganisch-organischen Gerüstmaterialien integriert werden um die magnetischen Eigenschaften zu verbesseren.rn

Control over microstructure evolution and device performance in solution processable organic field-effect transistors

Die Arbeit beschäftigt sich mit der Kontrolle von Selbstorganisation und Mikrostruktur von organischen Halbleitern und deren Einsatz in OFETs. In Kapiteln 3, 4 und 5 eine neue Lösungsmittel-basierte Verabeitungsmethode, genannt als Lösungsmitteldampfdiffusion, ist konzipiert, um die Selbstorganisation von Halbleitermolekülen auf der Oberfläche zu steuern. Diese Methode als wirkungsvolles Werkzeug erlaubt eine genaue Kontrolle über die Mikrostruktur, wie in Kapitel 3 am Beispiel einer D-A Dyad bestehend aus Hexa-peri-hexabenzocoronene (HBC) als Donor und Perylene Diimide (PDI) als Akzeptor beweisen. Die Kombination aus Oberflächenmodifikation und Lösungsmitteldampf kann die Entnetzungseffekte ausgleichen, so dass die gewüschte Mikrostruktur und molekulare Organisation auf der Oberfläche erreicht werden kann. In Kapiteln 4 und 5 wurde diese Methode eingesetzt, um die Selbstorganisation von Dithieno[2, 3-d;2’, 3’-d’] benzo[1,2-b;4,5-b’]dithiophene (DTBDT) und Cyclopentadithiophene -benzothiadiazole copolymer (CDT-BTZ) Copolymer zu steuern. Die Ergebnisse könnten weitere Studien stimulieren und werfen Licht aus andere leistungsfaähige konjugierte Polymere. rnIn Kapiteln 6 und 7 Monolagen und deren anschlieβende Mikrostruktur von zwei konjugierten Polymeren, Poly (2,5-bis(3-alkylthiophen-2-yl)thieno[3,2-b]thiophene) PBTTT und Poly{[N,N ′-bis(2-octyldodecyl)-naphthalene-1,4,5,8-bis (dicarboximide)-2,6-diyl]-alt-5,5′- (2,2′-bithiophene)}, P(NDI2OD-T2)) wurden auf steife Oberflächen mittels Tauchbeschichtung aufgebracht. Da sist das erste Mal, dass es gelungen ist, Polymer Monolagen aus der Lösung aufzubringen. Dieser Ansatz kann weiter auf eine breite Reihe von anderen konjugierten Polymeren ausgeweitet werden.rnIn Kapitel 8 wurden PDI-CN2 Filme erfolgreich von Monolagen zu Bi- und Tri-Schichten auf Oberflächen aufgebracht, die unterschiedliche Rauigkeiten besitzen. Für das erste Mal, wurde der Einfluss der Rauigkeit auf Lösungsmittel-verarbeitete dünne Schichten klar beschrieben.rn

Etablierung transgener BY-2-Zelllinien zur In-vivo-Lokalisierung pflanzlicher Cytoskelettproteine

Bei den Pflanzen sind viele Fragen bezüglich der Organisation und Regulation des bei der Zellteilung und differenzierung wichtigen Auf-, Ab- und Umbaus des Mikrotubuli-Netzwerkes noch immer offen, insbesondere was die Rolle des γ-Tubulins betrifft. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung von BY-2 Modell-Zelllinien (Nicotiana), die verschiedene mit fluoreszierenden Proteinen (FP) markierte Elemente des Cytoskeletts exprimieren, um eine fluoreszenzmikroskopische Detektion in vivo zu ermöglichen.rnAls Grundlage für alle weiteren Versuche wurde eine zuverlässige Methode zur A. tumefaciens vermittelten stabilen Transfektion von BY-2 Zellen erarbeitet. Für die Expression von FP-markierten Cytoskelettproteinen, wurden entsprechende Fusionskonstrukte kloniert und via A. tumefaciens in BY-2 Zellen transferiert. So gelang zunächst die Herstellung transgener Zelllinien, die GFP-markiertes α- bzw. γ-Tubulin exprimierten. Diese sollten später als Basis für die Untersuchung des dynamischen Mikrotubuli-Netzwerkes bzw. dessen Regulation dienen. In beiden Zelllinien standen die Konstrukte zunächst unter Kontrolle eines doppelten 35S-Promotors, was zu einer starken, konstitutiven Expression der Transgene führte. Fluoreszenzmikroskopisch konnten Strukturen, an deren Aufbau Mikrotubuli beteiligt sind, detektiert werden. Aufgrund einer starken Hintergrundfluoreszenz, vermutlich bedingt durch die konstitutive Überexpression, war die Darstellung feinerer Bereiche, wie sie im Cytoskelett häufig auftreten, jedoch äußerst schwierig. Deshalb wurde eine schwächere bzw. adäquate Expressionsrate angestrebt. rnPhysiologische Expressionsraten sollten vor allem durch den endogenen γ-Tubulin-Promotor ermöglicht werden. Da die entsprechende Sequenz noch unbekannt war, wurde sie zunächst bestimmt und in ein passendes Konstrukt integriert. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der resultierenden Zelllinie ließen auf eine stark reduzierte Expressionsrate schließen. Tatsächlich war die Detektion von Cytoskelettstrukturen, wenn überhaupt, erst bei deutlich längeren Belichtungszeiten möglich. Bedingt durch die langen Belichtungszeiten wurde die Dokumentation durch eine latente pflanzentypische Autofluoreszenz der Zellen erschwert. Auch wenn hier keine detailreicheren Aufnahmen der Cytoskelettstrukturen möglich waren, ist die Zellkultur für weiterführende Untersuchungen, z.B. in Studien bezüglich des zeitlichen Expressionsmusters des γ-Tubulins, potentiell geeignet. Der Einsatz eines sensibleren Mikroskopsystems ist allerdings erforderlich. rnUm klären zu können, inwieweit γ-Tubulin mit den Mikrotubuli co-lokalisiert, wurden Zelllinien benötigt, bei denen die entsprechenden Elemente unterschiedlich markiert waren. Zu diesem Zweck wurde der Einsatz von RFP-markiertem Tubulin getestet. Eine deutliche Überexpression von RFP alleine war möglich. Trotz mehrfacher Wiederholung der Versuche war aber keine Expression von RFP-markiertem α-Tubulin in BY-2 Zellen zur Visualisierung der Mikrotubuli detektierbar. Die DNA-Sequenzen waren im Genom nachweisbar, eine Transkription jedoch nicht. Möglicherweise spielten hier gene silencing Effekte eine Rolle. Das verwendete RFP (TagRFP) und GFP stammten aus unterschiedlichen Organismen, aus einer Seeanemone bzw. einer Qualle. Eine Lösung könnte der Austausch des TagRFP durch ein Quallen-Derivat, das in einer von grün unterscheidbaren Farbe fluoresziert, bringen. Da bereits BY-2 Zelllinien vorliegen, die GFP-markiertes α- bzw. γ-Tubulin exprimieren, sollte es, nach Klonieren eines entsprechenden Konstruktes, zeitnah möglich sein, eine doppelt transfizierte Zelllinie herzustellen.

Strukturbildung in Polyurethandispersionen und -filmen

Mechanische Eigenschaften nach Verfilmen sind häufig die wichtigsten Anforderungen für Polyurethandispersionen, so werden beispielsweise in den Hauptanwendungen im Beschichtungs- und Klebstoffsektor oftmals hohe Festigkeiten benötigt. Diese Anforderungen werden in der Dissertation durch eine gezielte Strukurbildung in den Polymeren adressiert. Mit einer hohen Kontrolle über den Polymeraufbau, durch die Ausbildung von kristallinen Bereichen, sowie mit phasenseparierten Morphologien werden drei Konzepte für die Modifikation der mechanischen Eigenschaften vorgestellt: Eine chemische bzw. kovalente Vernetzung wird mit funktionalisierten Polyurethanen erreicht, die physikalische Vernetzung kann reversibel die mechanische Festigkeit von Filmen erhöhen und Hybride mit kontrollierter Morphologie zeigen eine Kombination von Vorteilen ihrer Einzelbestandteile. Ferner zeichnen sich die synthetisierten Polyurethane gegenüber anderen Polymerklassen durch ihre relativ einfache Synthese und die Möglichkeit zur Herstellung multifunktionaler Materialien aus.