Einfluss von Stickstoffmonoxid, Hydroxylradikalen und Peroxynitrit auf DNA-Schäden, DNA-Reparatur und Mutationen

Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht über welche Mechanismen und unter welchen Bedingungen Stickstoffmonoxid (NO) und verwandte reaktive Spezies wie Peroxynitrit und Hydroxylradikale zur Krebsentstehung beitragen können. NO führte an zellfreier DNA kaum zu oxidativen DNA-Schäden. Peroxynitrit, generiert aus 3-Morpholinosydnonimin (SIN-1), induzierte neben Einzel-strangbrüchen und AP-Läsionen vor allem oxidierte Purinmodifikationen (50 % 8-Hydroxyguanin (8-oxoG)). Hydroxylradikale, freigesetzt aus 4-Hydroxypyridinthion, induzierten neben Einzelstrangbrüchen und AP-Läsionen oxidierte Pyrimidinmodifikationen in der DNA. Nach Transformation und Replikation der geschädigten DNA in E. coli DT-2 wurden überwiegend GC nach AT Transitionen (Hydroxylradikalschädigung), wahrscheinlich verursacht durch das in der DNA induzierte 5-Hydroxycytidin, bzw. GC nach TA Transversionen (Peroxynitrit), verursacht durch das induzierte 8-oxoG, detektiert. In Zellkulturexperimenten führte endogenes NO, freigesetzt von B6-INOS-Zellen (8µM) nicht zu einem Anstieg der Gleichgewichtsspiegel oxidativer DNA-Schäden, hatte keinen Einfluss auf deren Induzierbarkeit und Reparatur, die Zellpro-liferation und den Glutathionspiegel, schützte jedoch vor der Induktion von Einzelstrangbrüchen und Mikrokernen durch Wasserstoffperoxid. Exogenes NO, freigesetzt durch den Zerfall von Dipropylentriamin-NONOat, hemmte in Konzentrationen ab 0,5 mM spezifisch die Reparatur oxidativer DNA-Schäden, nicht jedoch die von Pyrimidindimeren, AP-Läsionen und Einzelstrangbrüchen,und führte in Konzentrationen > 1 mM zu einer Induktion von DNA-Schäden in den B6-Mausfibroblasten. Dabei ähnelte das induzierte Schadensprofil sehr dem von SIN-1.

Neuropeptide und die Regulation des Kohlenhydratstoffwechsels im Fettkörper der Argentinischen Schabe (Blaptica dubia)

Trehalose ist der Hauptblutzucker in der Hämolymphe der meisten Insekten. Trehalose wird im Fettkörper synthetisiert, dem wichtigsten Organ des Intermediärstoffwechsels bei Insekten. Wie die Homöostase des Blutzuckers reguliert wird, ist nicht vollständig geklärt. Die Produktion von Trehalose erfordert eine grundlegende Umschaltung im Stoffwechsel des Fettkörpers, die mehrere wichtige Stoffwechselwege betrifft, so dass die Fettkörperzellen (Trophocyten) von der Speicherung und Katabolisierung von Zucker zur Mobilisierung von Reservestoffen (Glykogen, Fett, Protein) und Trehalosesynthese umschalten. Am Fettkörper und isolierten Trophocyten der Argentinischen Schabe (Blaptica dubia) wurden Stoffwechseleffekte und Elemente der Signalkette des hypertrehalosämischen Hormons Bld HrTH untersucht. Inkubation isolierter Fettkörperloben mit Bld HrTH verringerte innerhalb von 60 min den Glykogengehalt (um 13,4 %) und steigerte die Konzentration der Hexosephosphate Glucose-6-phosphat und Fructose-6-phosphat, die Substrat sowohl für die Trehalosesynthese als auch für die Glykolyse sind. Pyruvat, Glycerin-3-phosphat, Citrat und insbesondere Fructose-1,6-bisphosphat (+750 %) waren ebenfalls erhöht. Der Glykolyseaktivator/Gluconeogeneseinhibitor Fructose-2,6-bisphosphat wird durch Bld HrTH vermindert. Da Trehalosesynthese und Glykolyse um dieselben Substrate (Glucosephosphate) konkurrieren, fördert der hormoninduzierte Abfall des Glykolyseaktivators Fructose-2,6-bisphosphat die Trehalogenese.Es ist gelungen, Trophocyten zu isolieren und die Signaltransduktion von Bld HrTH an einheitlichen Zellen und auch an Einzelzellen zu studieren. Hauptziel dieser Arbeit war es, die Funktion von Ca2+ im Signalweg des Bld HrTH genauer zu untersuchen. Die isolierten Zellen reagierten auf das Neuropeptid mit einer deutlichen Steigerung der Trehalosesynthese (+133,7 %) und einer Senkung des Fructose-2,6-bisphosphat-Gehaltes (-30,2 %). Sie bieten somit ein geeignetes System zur Untersuchung der Wirkungsmechanismen von Bld HrTH auf zellulärem Niveau. Ca2+ aus dem Extrazellulärraum und aus intrazellulären Speichern spielen bei der Signaltransduktion eine Rolle. Während extrazelluläres Ca2+ insbesondere für die Senkung des Fructose-2,6-bisphosphat-Gehaltes wichtig war, wurde Ca2+ aus zellulären Speichern insbesondere für die Trehalosesynthese benötigt, wobei sich jedoch beide Wege wechselseitig beeinflussen. Erstmals konnten an isolierten Trophocyten Änderungen von Ca2+ mikrofluorometrisch an Einzelzellen studiert werden. Das hypertrehalosämische Hormon ruft einen schnellen und starken Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i) hervor. Die Untersuchungen deuten auf einen Signalweg über IP3 und Diacylglycerin hin, entsprechend der Phosphoinositidkaskade. Eine Beteiligung des biogenen Amins Octopamin, von cAMP oder von Stickstoffmonoxid (NO) an der Signaltransduktion scheint hingegen unwahrscheinlich. Der Zuckergehalt im Medium scheint ebenfalls auf die Trehalogenese zu wirken. Bei hohen Konzentrationen von Glucose oder Trehalose wurde eine Hemmung der Trehalosesynthese beobachtet, die als Rückkopplungshemmung gedeutet werden kann. Bei Hunger wird das im Fettkörper gespeicherte Glykogen stark reduziert. Außerdem scheint die Zahl der symbiontischen Mikroorganismen in den Mycetocyten verringert.

Bcl-2-homologe Proteine aus dem Schwamm Geodia cydonium

'Bcl-2-homologe Proteine aus dem Schwamm Geodia cydonium: Klonierung, Charakterisierung und Funktionsanalyse von Apoptose-Regulatoren der Porifera'. Auf der Suche nach der molekularbiologischen Grundlage der Apoptose in den Porifera, dem phylogenetisch ältesten Metazoen-Tierstamm, wurden Mitglieder der apoptoseregulatorischen Bcl?2 Familie unter Anwendung diverser Techniken im Schwamm G. cydonium identifiziert: GCBHP1 und GCBHP2. Detaillierte Analysen offenbarten Bcl-2-charakteristische Signaturen sowie eine durch apoptotische Stimuli induzierbare Expression. Die parallele HSP70-Induktion zeugte von der GCBHP2-Expression als Teil einer antiapoptotischen Streßantwort zum Schutz des Organismus'. Die kontinuierliche Transkription des im Rahmen dieser Arbeit gleichfalls klonierten Proliferationsmarkers SEP1 veranschaulichte zudem die Effektivität dieser Streßreaktion. Mit der Herstellung eines rekombinanten Proteins und der Gewinnung eines Antiserums konnte auch die streßinduzierte Proteinexpression des GCBHP2 verfolgt werden. Zum Zweck der Funktionsstudie wurden Säugetierzellen (HEK-293, NIH/3T3) mit einem GCBHP2-Konstrukt stabil transfiziert und auf die Expression des Schwammproteins untersucht. Diese Zellen unterschieden sich bereits phänotypisch von mock-transfizierten Zellen. Immunzytochemische Untersuchungen enthüllten eine für antiapoptotische Bcl-2 Proteine charakteristische Assoziation mit Mitochondrien. Unter dem Einfluß zweier apoptotischer Stimuli wurde für GCBHP2-transfizierte Zellen eine vierzehn-/sechsmal höhere Vitalität und eine reduzierte Aktivierung der Caspase-Kaskade registriert (im Vergleich zu mock-transfizierten Kontrollen). Somit wurde der antiapoptotische Charakter des GCBHP2 und die Existenz apoptotischer Mechanismen in den Porifera bestätigt.

Transgene Mausmodelle zur Untersuchung von Nervenzellwanderungen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden transgene Mausmodelle hergestellt, die eine weitere Aufklärung der Rolle des Transkriptionsfaktors Pax6 bei der Wanderung von Nervenzellen ermöglichen, sowie ein Kultursystem zur Darstellung embryonaler Wanderungen außerhalb des Mutterleibs entwickelt.Bei der YAC-transgenen Mäuselinie PhPax6-taulacZ wird das Reportergen taulacZ unter der Kontrolle des Pax6-Promotors exprimiert. Dadurch ist dort, wo Pax6 im Zellkern vorliegt, der Rest der Zelle über seine gesamte Ausdehnung mit der vom taulacZ-Transgen kodierten tau-b-Galactosidase markiert. Das räumlich-zeitliche Expressionsmuster von Pax6 und dem Transgen taulacZ wurde detailliert untersucht. Dabei wurde eine hohe Übereinstimmung festgestellt. Basierend auf der Darstellung der Zellen in ihrer gesamten Ausdehnung, die durch das taulacZ-Transgen erstmals möglich ist, wurde eine Klassifizierung Pax6-positiver Zelltypen vorgenommen. Zunächst wird Pax6 in Neuroepithelzellen, später in radialen Gliazellen exprimiert.Mit der zweiten transgenen Mäuselinie, PhPax6-tTA, wurde ein Werkzeug hergestellt, das die gezielte und hoch spezifische Expression von beliebigen Transgenen in Pax6-exprimierenden Zellen ermöglicht. In Pax6-positive Zellen der Medulla wurde das Grün Fluoreszierende Protein (GFP) eingeführt und das Wanderungsverhalten in vitro über mehrere Tage dargestellt. Erstmals können mit dieser Linie beliebige Expressionskonstrukte gezielt, hocheffizient und schnell in wandernde Neurone eingebracht werden, ohne störende Hinter-grundexpression in anderen Zellen.

Strukturelle und molekulare Charakterisierung des Asialoglykoprotein-Rezeptors aus humaner Leber

Der Asialoglykoprotein-Rezeptor (ASGPR) vermittelt als integraler Bestandteil der Leberzellmembran die Endozytose von zirkulierenden Asialoglykoproteinen. Ziele dieser Arbeit waren proteinchemische Untersuchungen von funktionellem ASGPR aus humaner Leber aufgrund einer verbesserten Präparationsmethode und die rekombinante Darstellung der beiden Untereinheiten H1 und H2. In der denaturierenden SDS-PAGE erschienen H1 und H2 überwiegend als Monomere bei 46 und 50kD; nach Deglykosylierung ergaben sich Banden bei 34 und 32kD, wonach der Glykosidanteil etwa 28% beträgt. In der nicht-denaturierenden Größenausschluß-Chromatographie wurden im nativen ASGPR ausschließlich Trimere und Dimere gefunden. In Gegenwart von 2-Mercaptoethanol konnten funktionell eine aktive von einer nicht-aktiven Fraktion getrennt werden, wobei H2 in der nicht-aktiven Fraktion angereichert war, während sich H1 zu etwa gleichen Teilen in beiden Fraktionen befand. Durch zweidimensionale Auftrennung des deglykosylierten Rezeptors wurden auf Proteinebene vier Isoformen von H1 und zwei von H2 mit unterschiedlichen pI-Werten identifiziert. Der Vergleich von funktionellem ASGPR aus normaler Leber und den hepatischen Tumorzellinien HepG2 und Huh7 in der SDS-PAGE brachte Größenunterschiede von etwa sechs und vier Kilodalton hervor. Bei H1 konnte dies auf einen höheren Glykosylierungsgrad zurückgeführt werden, während H2 auch nach Behandlung mit N-GlykosidaseF ein größeres Molekulargewicht aufwies. Ein Antikörper gegen das Insertionspeptid im cytoplasmatischen Bereich einer Splice-Variante von H2 zeigte eine deutlich erhöhte Expression von H2 mit Insertion in Huh7-Zellen gegenüber natürlichem ASGPR. Da bisherige Kenntnisse über den humanen ASGPR vorwiegend aus kultivierten Hepatomzelllinien stammen, scheinen sie nicht ohne weiteres auf die Situation in normaler Leber übertragbar. Die Präparation von funktionellem H1 aus transfizierten cos7- und 293-Zellen führte zum gleichen Bandenmuster wie beim natürlichen ASGPR. Mit einem Enzymimmunoassay wurde die Eignung von rekombinantem H1 zur Detektion von Antikörpern gegen ASGPR in 177 von 178 Patientenseren gezeigt. Da durch Präinkubation mit rekombinantem Antigen die Reaktivität mit natürlichem Rezeptor inhibiert werden konnte, trägt H1 hauptsächlich die antigenen Stellen des ASGPR.

Untersuchungen zur TH1 assoziierten Immunpathogenese und adenoviralen Gentherapie bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Die Ätiopathogenese bei Chronisch Entzündlichen Darmerkrankungen (CED) ist noch weitgehend unklar. Zur Aufklärung molekularer Vorgänge, die zur Pathogenese beitragen, wurde ein Mausmodell etabliert, in dem der IL-12-assozierte Transkriptionsfaktor STAT-4 überexprimiert wurde. Die Analyse der STAT-4 überexprimierenden Mäuse zeigte, dass eine unphysiologische Aktivierung der IL-12/STAT-4-Signaltransduktionskaskade offenbar ausreicht, im Dickdarm eine TH1 mediierte Gewebedestruktion auszulösen.In weiteren Untersuchungen wurde die Rolle der intestinalen Mikroflora für pathogenetische Veränderungen bei der STAT-4 Kolitis untersucht. CD4+ T-Lymphozyten dieser Mäuse waren reaktiv gegen Antigene der autologen Flora und konnten in einem adoptiven Transfermodell in SCID Mäusen chronische Kolitiden induzieren. Damit konnte ein direkter Zusammenhang zwischen TH1 vermittelten Immunreaktionen gegen die autologe Mikroflora und der Entstehung chronischer Darmentzündungen demonstriert werden. Der Transfer genetischer Information könnte für die Therapie bei CED bedeutsam sein. Daher wurden Studien zu den Perspektiven rekombinanter Adenoviren für den intestinalen Gentransfer durchgeführt. Untersuchungen zu Transduktionskapazitäten verschiedener intestinaler Zell-/Gewebetypen ergaben hohe Infektionsraten für Zellen des Kolonepithels. Desweiteren wurde gezeigt, dass die adenovirale Überexpression der ‚antisense‘ RNA des proinflammatorischen Zytokins IL-18 eine etablierte Kolitis partiell therapiert kann. Dies unterstützt die Hypothese, dass deregulierte TH1 Antworten ursächlich an der Pathogenese bei CED beteiligt sein könnten und identifiziert IL-18 als potentielle Zielstruktur für die Therapie dieser Erkrankungen.

Analyse und Modulation kontaktallergischer Reaktionen

Analyse und Modulation kontaktallergischer Reaktionen In der vorliegenden Arbeit wurde in einem ersten Teil die Bedeutung des Tumor-Necrosis-Faktors auf eine Kontaktallergie anhand von TNFR1- und TNFR2-defizienten Mäusen untersucht. Mit Hilfe des Ohrschwellungsverlaufs einer von DNFB ausgelösten kontaktallergischen Reaktion konnte bei TNFR1-defizienten Mäusen eine leichte Überreaktivität und bei TNFR2-defizienten Mäusen eine statistisch abgesicherte Überreaktivität festgestellt werden. Eine ebenfalls überreaktive Schwellungsreaktion konnte bei TNFR2-defizienten Mäusen, die vorher mit Oxazolon behandelt worden waren, beobachtet werden. In den anschließend durchgeführten histologischen Untersuchungen der Langerhans-Zellen aus den TNFR-defizienten Mäusen zeigten sich keine sichtbaren Differenzen in bezug auf MHC II-Expression und Verteilung der Zellen. Eine unterschiedliche Stimulationskapazität konnte bei Langerhans-Zellen, die aus TNFR1- bzw. TNFR2-defizienten Mäusen isoliert worden waren, nicht beobachtet werden.In Migrationsstudien, bei denen FITC als Kontaktallergen von Langerhans-Zellen aufgenommen, prozessiert und nach der Wanderung in die Lymphknoten präsentiert wurde, konnte keine verringerte Anzahl der migrierenden Zellen bei TNFR1-defizienten Mäusen festgestellt werden. Jedoch wurde eine reduzierte Anzahl FITC- und MHC II-doppelt-positiver Zellen aus TNFR2-defizienten Mäusen beobachtet.Um Aufschlüsse über die Expression von TNF-Rezeptoren auf murinen Langerhans-Zellen gewinnen zu können, wurde mit Hilfe von Epidermal Sheets, zytofluorometrischen Analysen und RT-PCR-Analysen von Langerhans-Zellen die Expression der TNF-Rezeptoren untersucht. In Vorversuchen konnte die Expression von TNF-Rezeptoren auf Fibroblasten und T-Zellen gefunden werden. Weiterhin konnten beide TNF-Rezeptoren auf der Keratinozyten-Zellinie PAM 212 nachgewiesen werden. Auf frisch isolierten Langerhans-Zellen, die mittels MicroBeads aus epidermalen Zellsuspensionen gewonnen wurden, konnten keine TNF-Rezeptoren beobachtet werden. Bei kultivierten Langerhans-Zellen konnte dagegen die Expression des TNFR2 festgestellt werden. Mit Hilfe von RT-PCR-Analysen konnte die mRNA des TNFR1 sowohl bei frisch isolierten als auch bei kultivierten Langerhans-Zellen nachgewiesen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Wirkung des Immunmodulators Leflunomid (LF) auf eine Kontaktallergie untersucht. Es konnte eine signifikant geringere Schwellungsreaktion im Zuge einer DNFB-induzierten Kontaktallergie bei LF-behandelten Mäusen festgestellt werden. Bei Experimenten zur Untersuchung des Wirkungszeitraums der inhibitorischen Wirkung von LF bei einer kontaktallergischen Reaktion konnte ein langanhaltender Effekt beobachtet werden. Weiterhin konnte die inhibitorische Wirkung von LF auf eine von Oxazolon induzierte kontaktallergische Schwellungsreaktion und auf eine irritative Schwellungsreaktion beobachtet werden. Wie in einem weiteren Experiment festgestellt werden konnte, wirkte LF größenteils antigenspezifisch.Der Wirkungszeitpunkt von LF konnte in verschiedenen Experimenten, bei dem LF vor, während oder nach der Sensibilisierungsreaktion verabreicht worden war, festgestellt werden. Eine suppressive Wirkung von LF war nur dann zu beobachten, wenn LF während der Sensibilisierungsphase gegeben worden war. Weiterhin konnte in Transfer-Experimenten festgestellt werden, daß die Inhibition der kontaktallergischen Schwellungsreaktion auf naive Tiere übertragbar ist. Außerdem wurden Hinweise gefunden, daß CD8+-T-Zellen als Effektorzellen bei der Suppression eine Rolle spielen. Desweiteren konnten anhand von Untersuchungen von Epidermal Sheets von LF-behandelten Mäusen, die mit DNFB konfrontiert worden waren, keine morphologischen Unterschiede gefunden werden. Nach Erstellung von Migrationsanalysen für die zum Einsatz gekommenen Versuchsgruppen, d.h. sowohl für die LF-behandelten als auch für die Kontroll-Mäuse, konnte kein Einfluß von LF auf die Wanderungsfähigkeit von LC konstatiert werden. Anhand von FACS-Analysen konnte bei einer mit LF kultivierten T-Zellinie eine reduzierte Expression des IL-2-, und Transferrin-Rezeptors, sowie von CD44 beobachtet werden. Schließlich wurde bei Untersuchungen einer topischen Applikationsform von LF festgestellt, daß LF nur oral appliziert wirksam war.

Identifizierung und Charakterisierung cis regulatorischer Elemente des humanen Gens für Keratin 20 in vitro und im transgenen Mausmodell

ZusammenfassungKeratin 20 (K20) ist ein Intermediärfilament, das als Strukturelement in den Epithelien des Intestinaltrakts und den Merkelzellen der Haut exprimiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene K20 Expressionsvektoren generiert, mit denen regulatorische Elemente des humanen Gens für K20 charakterisiert wurden. Analysiert wurde der Bereich von –4,8 kb bzw. –21,5 kb bis 12,9 kb vom Transkriptionsstart. Die Vektoren, welche die Sequenz von –21,5 kb bis 12,9 kb umfassten, konnten die Expression des EGFP Reportergens in HT-29 Zellen signifikant steigern. Zwei Enhancer-Elemente zwischen –21,5 und –18,4 kb bzw. –18,4 und –14,9 kb verstärkten die Expression der Reporterkonstrukte in vitro signifikant. Die Analyse der Vektoren in transgenen Mäusen zeigte, dass diese das Transgen gewebespezifisch exprimieren. Mit dem Bereich von –4,8 kb bis 12,9 kb ließ sich transgenspezifische mRNA Expression in intestinalen Geweben mittels RT-PCR nachweisen. Die Verwendung der Sequenz von –21,5 kb bis 21,8 kb steigerte die Expression in vivo nicht weiter.Für die gewebespezifische Expression des K20 Vektors reicht die 4,8 kb 5´upstream Sequenz aus, der Bereich bis –21,5 kb verstärkt die Expression in vitro, allerdings fehlen für die starke gewebespezifische Expression von Transgenen in vivo noch weitere Kontrollelemente.

Funktionale Bedeutung der Protein Kinase C - delta (PKC - delta) in der Reorganisation der zytoskelettären Architektur humaner Keratinozyten

Die Kontaktihibition, d.h. die Zell-Zell-Kontakt-vermittelte Proliferationskontrolle, stellt einen fundamentalen Mechanismus zur Aufrechterhaltung der Homöostase in vitro und in vivo dar. So stellen in der Zellkultur nicht-transformierte Zellen in der Regel ihr Wachstum ein, sobald sie einen einschichtigen Zellrasen gebildet haben. Umgekehrt zeichnen sich transformierte Zellen durch einen Verlust der Kontaktinhibition aus. Sie wachsen nach Erreichen eines konfluenten Zellrasens mehrschichtig weiter, und es kommt zur Ausbildung charakteristischer Foci. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Proteinkinase C - delta eine wichtige Funktion in der Regulation der Zytoarchitektur humaner Keratinozyten besitzt und zugleich über Modulation der Zell-Zelladhäsion, insbesondere über Cadherin und Catenin, Einfluss nimmt.

Identifizierung und Charakterisierung T-zellerkannter Tumorantigene im Melanommodell MZ7

Die Kenntnis immunogener Tumorantigene ist Grundlage für die rationale Entwicklung immunologisch orientierter Therapieverfahren. In der vorliegenden Arbeit wurden im autologen Melanommodell MZ7 drei neue T-zellerkannte Tumorantigene vorgestellt. Während nahezu alle bisher beschriebenen Tumorantigene mit Hilfe von T-Zellklonen (CTL) entdeckt wurden, die aus tumorreaktiven MLTCs (gemischte Lymphozyten/Tumor-Zellkulturen) generiert worden waren, wurde in dieser Arbeit versucht, wenige Wochen stimulierte MLTCs direkt zur Antigensuche zu verwenden. Als sensitives Nachweissystem wurde der IFNg-ELISPOT-Assay eingesetzt. Die Motivation dazu waren einerseits praktische Erwägungen, da CTL-Klonierungen material- und zeitaufwendig sind. Andererseits wurde vermutet, dass die Etablierung von CTL-Klonen in Langzeitkultur neben Zufallsprozessen auch Selektionsprozessen unterliegt, die CTL mit bestimmten Eigenschaften favorisieren. Eventuell eröffnete sich durch den Einsatz der MLTCs die Möglichkeit, Antigene zu entdecken, die mit Hilfe permanent kultivierter CTL aus den MLTCs nicht gefunden würden.Um beispielsweise Schwankungen im Proliferationsverhalten und in Effektorfunktionen permanent kultivierter T-Zellen zu umgehen, wurden für die Versuche in dieser Arbeit in Portionen eingefrorene T-Zellen verwendet, die zuvor zu ausreichender Menge expandiert worden waren. Es ließ sich zeigen, dass durch die Kryokonservierung der T-Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt nach einer Restimulation mit den Tumorzellen der Aktivierungszustand der T-Zellen konserviert wurde, und dass die T-Zellen nach dem Auftauen in ELISPOT-Assays ohne wesentliche Einbußen spezifisch auf einen erneuten Antigenkontakt reagierten. Bei der Testung von mehreren, unabhängig generierten MLTCs gegen bekannte Tumorantigene wurden T-Zellantworten gegen gp100/HLA-B7.2, Tyrosinase/HLA-A26.1, SIRT2P182L/HLA-A3.1 und, deutlich stärker, gegen die Melanomzelllinie festgestellt. Nachfolgend wurde mit Hilfe bereits etablierter CTL-Klone die peptidkodierende Region von gp100 über die Transfektion von gp100-Fragmenten in COS-7-Zellen eingegrenzt und anschließend ein synthetisches Peptid identifiziert, das von den CTL-Klonen erkannt wurde. Das zweite identifizierte Tumorantigen, Tyrosinase/HLA-A26.1, wurde nur in einer von sechs neu generierten, unabhängigen MLTCs entdeckt. Da keine Tyrosinase/HLA-A26.1-reaktiven CTL-Klone zur Verfügung standen, wurden die zur Eingrenzung der peptidkodierenden Region transfizierten COS-7-Zellen mit der MLTC selbst getestet. Anschließend wurde ein synthetisches Peptid identifiziert, das von der MLTC erkannt wurde.Die Reaktivität der MLTCs gegen die Melanomzelllinie war bei weitem nicht durch die bis dahin gefundenen T-Zellantworten erklärbar. Daher wurde mit einer der MLTCs versucht, durch cDNA-Expressionsklonierung ein neues Antigen in der cDNA-Bank aus dem MZ7-Melanom zu identifizieren. Die Reaktivität der MLTC gegen den Tumor war hauptsächlich durch einen Antikörper gegen HLA-A3 blockierbar. Daher wurde HLA-A*03011-cDNA für das „Screening“ kotransfiziert. Das Verfahren führte zur Identifizierung eines weiteren punktmutierten Tumorantigens: GPNMBG181D (GPNMBmutiert). Die Mutation führte dazu, dass ein Teil eines ungespleißten Introns Bestandteil der im Tumor entdeckten cDNA war. Ein aus der Exon/Intron-Region kodiertes synthetisches Peptid mit der ausgetauschten Aminosäure wurde von der MLTC deutlich erkannt. Durch RT-PCR-Analysen wurde im MZ7-Melanom, in fast allen getesteten weiteren Melanomen sowie in einem Teil der überprüften Nierenzellkarzinome eine Variante der GPNMB-cDNA entdeckt, in der ebenfalls das erwähnte Intron enthalten war, ohne dass die Mutation vorlag (GPNMB/INT4). Diese Spleißvariante wurde nicht in EBV-B-Zelllinien und anderen Tumorzelllinien gefunden. Zusätzlich zu dem bereits zuvor charakterisierten Tumorantigen SIRT2P182L wurden drei weitere T-zellerkannte Antigene im Melanommodell MZ7 identifiziert. T-Zellreaktivität gegen das Antigen GPNMBG181D entwickelte sich, im Gegensatz zu den anderen Antigenen, in allen getesteten MLTCs. Dies spricht für eine immunologische Dominanz des Antigens im Melanommodell MZ7. Die Tatsache, dass das „stärkste“ Antigen mit Hilfe einer MLTC identifiziert wurde, bietet die Aussicht, evtl. weitere dominante Antigene mit dem Verfahren identifizieren zu können. Die Verwendung von kurzzeitstimulierten MLTCs anstelle von permanent kultivierten CTL-Klonen stellt einen ersten Schritt auf dem Weg zur Beschleunigung der Suche nach Tumorantigenen dar. Die Verfahrensbeschleunigung ist die Voraussetzung dafür, in Zukunft Antigene nicht nur in archivierten Modellen zu suchen, sondern in Patienten zu einem frühen Zeitpunkt der malignen Erkrankung. Dann bestünde die Chance, dass die Kenntnis individueller Tumorantigene in immuntherapeutische Konzepte eingeht.

Analyse der Mechanismen zur Regulation der Zellzyklus-abhängigen Stabilität der MARCKS-mRNA

Die Expression des PKC-Hauptsubstrates MARCKS (myristoylated alanine-rich C kinase substrate) wird in Swiss 3T3-Fibroblasten in Abhängigkeit des Zellzyklus durch Variation der mRNA-Stabilität reguliert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Beteiligung der 3' nichttranslatierten Region (3'UTR) der MARCKS-mRNA an der Stabilitätskontrolle analysiert. Durch Einsatz der RNase/EMSA-Technik konnten zwei cis-Elemente der MARCKS 3'UTR identifiziert und lokalisiert werden, die mit RNA-bindenden Swiss 3T3-Proteinen (trans-Faktoren) interagieren. Diese neu identifizierten cis-Elemente sind AU-reiche Elemente (ARE) der Klasse III, da sie sehr große Sequenzhomologie zu ARE dieser Klasse aufweisen und der MARCKS 3'UTR, wie für ARE typisch, Instabilität vermitteln.Durch UV-crosslinking wurden vier Proteine mit Molekülmassen von 55, 40, 36 und 30 kDa nachgewiesen, die spezifisch an das 52nt lange Haupt-ARE (MARCKS 52nt) mit unterschiedlicher Affinität binden konnten. Mit Hilfe von rekombinant hergestellten ELAV/Hu-Proteinen und einem ELAV/Hu-spezifischen, affinitätsgereinigten Antiserum konnte eines der vier Proteine (p36) als das ELAV/Hu-Protein HuR identifiziert werden. Die Funktion der ELAV/Hu-Proteine für die Stabilitätskontrolle der MARCKS-mRNA ließ sich durch transiente und stabile Transfektion von HuR und neuronenspezifischem HuD mit dem Tetracyclin induzierbaren Expressionssystem (Tetoff) in Swiss 3T3- bzw. MEF/3T3-Tetoff-Zellen verdeutlichen: Durch Überexpression von HuR und HuD wurde die wachstumsinduzierte Destabilisierung der MARCKS-mRNA bei Wiedereintritt der Zellen in den Zellzyklus unterbunden.

Cholesterin-Interaktion mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und intrazelluläre Verteilung

ZusammenfassungIn dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass neben dem Oxytocinrezeptor auch die anderen Rezeptoren der Familie der Neurohypophysenhormone, die Vasopressinrezeptoren, in der gleichen Weise in ihren Bindungseigenschaften von Cholesterin beeinflusst werden. Im Gegensatz dazu zeigt der Cholecystokininrezeptor Typ B keine direkte Wechselwirkung mit Cholesterin. Durch Austausch der Transmembranhelices 6 und 7 des Oxytocinrezeptors mit entsprechenden Bereichen des Cholecystokininrezeptors wurde ein Rezeptor erzeugt, der bezüglich Bindungsverhalten und Cholesterinabhängigkeit keine Unterschiede zu dem Wildtyp-Oxytocinrezeptor zeigte. Durch den Einsatz von computergestütztem 'Modeling' wurde für die Interaktion des Oxytocinrezeptors mit Cholesterin eine Stelle zwischen den Transmembranhelices 5 und 6 vorgeschlagen. Um die Verteilung des Cholesterins in der Zelle zu untersuchen, wurde ein selbst synthetisiertes, fluoreszierendes Cholesterinderivat (Fluochol) eingesetzt. Die Komplexierung in Cyclodextrinen ermöglichte die Einlagerung von Fluochol in die Plasmamembran von Zellen. Der Einstrom des Fluochol in das ER erfolgte innerhalb von Minuten und war energieunabhängig. Schließlich wurde Fluochol in Lipidtröpfchen transportiert, die in fast allen Zellen für die Speicherung überschüssiger intrazellulärer Lipide dienen. Die Tröpfchen werden aus dem endoplasmatischen Retikulum gebildet und enthalten neben Phospholipiden auch Cholesterin, das durch das Enzym ACAT mit langkettigen Fettsäuren verestert wird.

Analyse molekularer Mechanismen der Immundominanz MHC Klasse I-präsentierter Antigene bei Humaner Cytomegalovirus-Infektion

Das Humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein Erreger von großer klinischer Relevanz. Die HCMV-Infektion, die insbesondere bei immunsupprimierten Patienten mit hoher Morbidität und Mortalität assoziiert ist, wird vorwiegend durch CD8+-zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) kontrolliert. Das Tegumentprotein pp65 und das immediate early 1-Protein (IE1) waren als die dominanten CTL-Antigene bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, die zur Immundominanz des pp65 führenden molekularen Mechanismen aufzuklären und die Grundlagen für die Analyse der IE1-spezifischen Immunantwort zu erarbeiten. Durch Peptidimmunisierung HLA-A2-transgener Mäuse wurden hochaffine pp65-spezifische CTL-Klone generiert. Für die Generierung ähnlicher CTL-Klone gegen IE1 konnte erstmals ein konserviertes HLA-A2-bindendes Peptid identifiziert werden. Mit Hilfe der pp65-spezifischen CTL-Klone konnte gezeigt werden, dass das durch Viruspartikel in die Zelle eingebrachte pp65 die Erkennung infizierter Zellen durch CD8+-CTL vermittelt. Durch den Nachweis der außergewöhnlichen Stabilität von pp65 in der Zelle gelang es, eine hohe metabolische Umsatzrate als eine Ursache von Immundominanz auszuschließen. Dagegen hob die Blockierung des CRM1-vermittelten nukleären Exportweges durch Zugabe von Hemmstoffen oder Zutransfektion kompetitiver Inhibitoren die Erkennung des pp65 nahezu auf. Hiermit wurde erstmalig eine Abhängigkeit der Präsentation eines immundominanten nukleären Proteins vom nukleozytoplasmatischen Transport nachgewiesen. Die Erkenntnisse dieser Arbeit stellen die Grundlage für die detaillierte Analyse der Zusammenhänge zwischen nukleärem Export und Antigenpräsentation dar.

Die Funktion von Dystroglycan in der Entwicklung des zentralen Nervensystems

Die Funktion von Dystroglycan in der Entwicklung des zentralen Nervensystems Der DAG ist ein oligomerer Proteinkomplex, der in den Muskelfasern die extrazelluläre Matrix mit dem Zytoskelett verbindet und dadurch der Muskulatur die mechanische Stabilität bei der Kontraktion verleiht. Mutationen des DAG sind die genetische Grundlage für verschiedene Formen von muskulären Dystrophien. Muskuläre Dystrophien sind Krankheiten, die neben einer Degeneration der Muskulatur auch verschiedene ZNS-Defekte aufweisen. Die Funktion des DAG im ZNS ist bisher unbekannt. Um seine Funktion im ZNS zu analysieren, wurde Huhn-Dystroglycan, eine zentrale Komponente des DAG, kloniert. Dystroglycan besteht aus dem extrazellulären Matrixprotein alpha-Dystroglycan und dem transmembranen beta-Dystroglycan. Beide Proteine werden vom selben Gen codiert und posttranslational gespalten. Die Huhn-Dystroglycan-Sequenz ist sehr homolog zu anderen Spezies. Antikörper hergestellt gegen die Interaktionsdomänen von alpha- und beta-Dystroglycan, wurden verwendet um die Interaktion von Dystroglycan selektiv an der Grenzfläche zwischen Gliazellendfüßen und Basallamina in der Retina zu stören. Die Antikörper wurden in vivo intravitreal in Augen von Hühnerembryoanen der Stadien E6 bis E10 injiziert. Die Injektion der Antikörper und entsprechender Fab-Fragmente führten zu schweren Veränderungen in der Retina, unter anderem Hyperproliferation, Auflösung der radialen Struktur der neuroepithelialen Zellen und einer veränderten Schichtung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß der DAG am Kontakt der radiären Glizellen zur Basalmembran beteiligt sind.

Untersuchung über Proliferation und Apoptose in der Morphogenese und der Anagenphase des murinen Haarfollikels

Die Koordination der Zunahme an Zellen (Proliferation) und deren program-mierter Untergang (Apoptose) hat entscheidende Bedeutung für die Entwicklung und das Wachstum von Organen, ist aber bisher weitgehend unverstanden. In dieser Arbeit werden deshalb das Auftreten von Apoptose und Proliferation während der Entwicklung (Morphogenese) und des Wachstums des Haarfollikels (Anagen) untersucht. Der Haarfollikel ist hierfür als Modellorgan besonders gut geeignet, da dessen Stadien der Organogenese und des Anagens histologisch im Detail untersucht sind.Die vorliegende Arbeit zeigt, daß Proliferation das Leitmerkmal der Morpho-genese und des Anagens darstellt. In Abhängigkeit des Entwicklungsstadiums des Follikels sind charakteristische Schwerpunkte der Proliferation in Keratino-zyten und Zellen mesenchymaler Herkunft identifizierbar. Haarfollikelmorphogenese und Anagen sind sich dabei in den späten Entwicklungsstadien sehr ähnlich.Darüberhinaus zeigen unsere Untersuchungen erstmals, daß in allen Stadien der Haarfollikelmorphogenese und Anagens, insbesondere in den frühen Phasen und in Regionen mit hoher Proliferationsrate, Apoptose stattfindet. Das läßt schließen, daß Apoptose als Regulativ der Proliferation an der Organformung beteiligt ist. In den späteren Stadien findet sich Apoptose vor allem im Epithel des Haarkanals wo sie zur Gewebshomöostase beiträgt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen erstmals, daß Proliferation und Apoptose beim wachsenden Haarfollikel 1) präzise aufeinander abgestimmt, 2) in spezifischen Arealen und 3) zu genau definierten Zeitpunkten auftreten. Dies legt nahe, daß die streng kontrollierte Interaktion von Proliferation und Apoptose für die normale Entwicklung und das Wachstum von Organen, hier speziell des Haarfollikels, notwendig ist. Auf der Basis dieser Beobachtungen lassen sich nun 1) gezielte funktionelle Untersuchungen anschließen und 2) das Zusammenspiel von Proliferation und Apoptose bei krankhaften Prozessen in der Entwicklung und während des Wachstums von Organen vergleichend charakterisieren.