Serumfreie Collagen-Monolayer- und Sandwich-Kulturen primärer Hepatozyten als ein wertvolles Modell zur Detektion von Toxizität und Arzneimittelwechselwirkungen in vitro

In dieser Arbeit wurden Zellkulturen primärer Hepatozyten von Ratte und Mensch hinsichtlich ihrer Eignung untersucht Speziesunterschiede der toxischen Wirkung und des Metabolismus von Substanzen darzustellen und inwieweit die in vitro-Ergebnisse in vivo vergleichbar bzw. übertragbar sind. Des Weiteren wurde ein Zellkulturmodell entwickelt, das eine Kultivierung von primären Hepatozyten aus Ratte, Mensch und Maus über einen Zeitraum von mindestens einer bis zwei Wochen erlaubt.rnrnDie Zellkulturen primärer Hepatozyten von Ratte und Mensch zeigten deutliche Unterschiede in der substanzinduzierten Veränderung der Genexpression nach Behandlung mit den, vor allem für den Menschen, lebertoxischen Substanzen Diclofenac und Troglitazon. Diese Unterschiede traten hauptsächlich in der Induktion fremdstoffmetabolisierender Enzyme sowie deren transkriptionsregulierenden Kernrezeptoren in den humanen Hepatozyten auf. Ebenso war eine verstärkte Stressantwort zu beobachten.rnDeutliche Speziesunterschiede konnten ebenso in der Wirkung der Arzneimittelentwicklungssubstanz EMD 392949 auf die Aktivität bzw. Genexpression von Cytochrom P450 Enzymen sowie deren Regulatoren nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte hier eine sehr gute Übereinstimmung der Ergebnisse aus den Zellkulturen primärer Ratten- bzw. Humanhepatozyten mit jenen aus in vivo-Experimenten mit Ratten bzw. Affen (Macaca fascicularis) beobachtet werden, was die Aussagekraft der Primärkulturen verdeutlichte.rnDie große Übereinstimmung zwischen Enzymaktivität und Genexpression in der Induktion fremdstoffmetabolisierender Enzyme konnte durch die Behandlung mit einer Reihe speziesspezifischer Induktoren in Zellkulturen primärer Ratten- bzw. Humanhepatozyten bestätigt werden; vor allem nach dem von der amerikanischen Arzneimittelzulassungsbehörde (FDA, Food and Drug Administartion) vorgeschlagenen Bewertungsschema zur Untersuchung der CYP-Induktion.rnrnDie Lebensdauer sowie der Differenzierungsgrad von primären Hepatozyten in Kultur sind stark abhängig von den Zellkulturbedingungen. Durch diese Arbeit konnte gezeigt werden, dass spezifische Eigenschaften von Rattenleberzellen durch Kultivierung in einem Sandwich aus zwei hydratisierten Collagengelschichten und unter serumfreien Bedingungen für einen Zeitraum von mindestens zwei Wochen aufrechterhalten werden können. Dieses Kulturmodel konnte auf Primärhepatozyten von Mensch und Maus übertragen werden und erweitert die möglichen Anwendungen hin zu einer Behandlung über einen längeren Zeitraum und der Untersuchung von subchronischen Effekten.rn

Regelmechanismen und Determinanten der Transkription in Polytänchromosomen von Chironomus und Drosophila

Die kumulative Habil.‐Schrift gründet sich auf 6 Originalpublikationen, die beschreiben: [Sass, H. (1982), Cell 28: 269‐278]. RNA polymerase B in polytene chromosomes: Immunofluorescent and autoradiographic analysis during stimulated and repressed RNA synthesis. Elektronenmikroskopie charakterisierte das C. tentans Balbianiring BR2‐Gen von Speicheldrüsenchromosomen als hoch aktives 5‐6 μm langes single‐copy Gen, das 33/μm RNAPolymerasen B (Pol II) transkribieren (Diss., Sass, H., 1978, Univ. Tübingen). Diese Immunfluoreszenzstudie ortet Pol II in allen Interbanden von Region IV‐3B10‐3B5 des nichtinduzierten BR2. Prominente Fluoreszenz im BR2‐Genort 3B9/10 zeigt, das BR2‐Gen ist präaktiv, wie erwartet. 3H‐Autoradiogramme beweisen, in allen fluoreszierenden BR2, BR1, BR3, Puffs, aufgelockerten Banden, Interbanden und Loci ohne Puffing, synthetisiert Pol II RNA. Die genomweite ständige Pol II‐Präsenz zeigt, dass, wie beim nichtinduzierten BR2‐Gen, bereits schon gebundene Pol II wohl auch andere Gene präaktiviert. So erfolgt die Regulation der Transkription mehr über die transkriptionelle Elongation. Auch durch α‐Amanitin, oder Actinomycin D, oder Hitzeschock in vivo kollabierte BR2, BR1, BR3 besitzen Pol II. [Sass, H. (1984), Chromosoma 90: 20‐25]. Gene identification in polytene chromosomes: some Balbiani ring 2 gene sequences are located in an interband‐like region of Chironomus tentans. Immunfluoreszenz und 3H‐Autoradiographie zeigen, dass Injektionen von DRB in Larven die Balbianiringe (BR) sowie andere Puffs und deren Pol II‐Konzentration dramatisch reduzieren. Trotzdem zeigen 3H‐Uridin markierte Speicheldrüsenchromosomen, dass RNA‐Synthese doch in nichtinduzierten BR2, BR1, BR3 erfolgt, aber nur auf reduziertem Level. Das widerspricht der von Egyházi E. (1975, PNAS 73:947‐950) propagierten „Inhibition of Balbiani ring RNA synthesis at the initiation level“ durch DRB. Vielmehr sieht es so aus, DRB wirkt bei der transkriptionellen Elongation inhibierend. Durch in situ‐Hybridisierung von Sequenzen klonierter BR2‐DNA wurde in Speicheldrüsenchromosom IV das BR2‐Gen in Region 3B9/10 direkt identifiziert. [Sass, H. and Pederson, T. (1984), J. Mol. Biol. 180: 911‐926]. Transcription‐dependent localization of U1 and U2 small nuclear ribonucleoproteins at major sites of gene activity in polytene chromosomes. Immunolokalisation von Sm‐, U1‐ und U2snRNP‐spezifischen Antigenen in Speicheldrüsenchromosomen von C. tentans hat zur Entdeckung der beim Spleißen von prä‐mRNA beteiligten U1/U2snRNPs in Balbianiringen BR2, BR1, BR3 sowie anderen Puffs und aufgelockerten Banden geführt. Die überraschenden BR‐Daten zeigen erstmals: (i) Der Spleiß‐Apparat ist in Genloci mit intensiver RNA‐Synthese schon vorhanden. (ii) Immunfluoreszenz reflektiert den Exon‐Intron‐Bau dieser BR‐Gene. (iii) Transkription und spleißosomales Ausschneiden von Introns sind koordiniert. [Sass, H. (1989), Nucleic Acids Research 17: 10508]. Hsp82‐neo transposition vectors to study insertional mutagenesis in Drosophila melanogaster and tissue culture cells; [Sass, H. (1990), Gene 89: 179‐186]. P‐transposable vectors expressing a constitutive and thermoinducible hsp82‐neo fusion gene for Drosophila germline transformation and tissue‐culture transfection. Beschrieben sind Design, Konstruktion und Expression der Genfusion hsp82‐neo als ein in vivo selektierbares Reporter‐/Markergen, die Transposons P{hsp82‐neo/Adh} sowie P{hsp82‐neo} und Transformations‐Vektoren pHS22, pHS24, pHS85, pHS103 und pHS104. Sie stellen das von der Fliege gebildete Enzym bakteriellen Ursprungs, Neomycin‐Phosphotransferase II, für die G418‐Selektion bereit, um die Position, Struktur, Expression und Funktion von Genen mittels hsp82‐neo‐Mutagenese zu erforschen. [Sass, H. and Meselson, M. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6795‐6799]. Dosage compensation of the Drosophila pseudoobscura Hsp82 gene and the D. melanogaster Adh gene at ectopic sites in D. melanogaster. Quantitative Unterschiede in der Dosiskompensation des X‐chromosomalen hsp82‐Gens von D. pseudoobscura und autosomalen Adh‐Gens von D. melanogaster wurden als Erhöhung der RNAMenge in D. melanogaster gemessen. Beide Transgene sind dosiskompensiert, sprang P{hsp82‐ neo/Adh} in euchromatische Regionen des D. melanogaster X‐Chromosoms. Beide Transgene sind nicht dosiskompensiert, insertierte P{hsp82‐neo/Adh} ins β‐Heterochromatin in Region 20 an der Basis des X. Keine der zehn autosomalen Insertionen ist dosiskompensiert. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass X‐chromosomale regulatorische Sequenzen, die für die Verstärkung der Genaktivität um Faktor 2 in Männchen verantwortlich sind, gehäuft im X vorkommen, jedoch im β‐ Heterochromatin und den Autosomen fehlen. Das Kompensationsverhalten der transponierten Gene wird durch das neue chromosomale Milieu des Insertionsortes bestimmt.

Die funktionelle Bedeutung von MSP und Lactadherin im Rahmen der Atherosklerose

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss zweier möglicher Biomarker auf die Atherosklerose untersucht.rnMilk fat globule-EGF factor 8 (MFG-E8, Lactadherin) ist ein Glycoprotein, das vornehmlich von Makrophagen, glatten Muskelzellen und Endothelzellen sezerniert wird. MFG-E8-/--Mäuse zeigen vermehrt apoptotische Zellen in der atherosklerotischen Plaque, verstärkte Inflammationszeichen und vergrößerte Läsionen. In situ-Hybridisierung und Immunfluoreszenz zeigen eine starke Lactadherin-Expression in den Schaumzellen atherosklerotischer Plaques von Apo E-/-, Apo E-/-/GPx 1-/-und LDLR-/- Mäusen, vor allem in der Nähe des Lipid Core. Dort kolokalisiert Lactadherin mit dem Makrophagenmarker CD 68 und dem Chemokin Fraktalkin, das die MFG-E8 Sekretion stimuliert und so die Phagocytose forciert. Untersuchungen mittels RTD-PCR ergaben, dass Peritonealmakrophagen der Genotypen Apo E-/-, Apo E-/-/GPx 1-/- und GPx 1-/-, deren Gemeinsamkeit eine höhere Empfindlichkeit gegenüberrnoxidativem Stress ist, mehr Lactadherin exprimieren als andere Genotypen (B6, LDLR-/-). Die Inkubation muriner oder humaner Makrophagen mit oxLDL und eLDL hat keinen Einfluss auf die Expression der MFG-E8 mRNA. Der Kontakt mit apoptotischer Zellen hingegen erhöht die Expression signifikant. Lactadherin ist entscheidend für die effektive Phagozytose apoptotischer Zellen in der atherosklerotischen Läsion. Seine Expression wird vermutlich durch die Apoptose in der Nähe liegender Zellen und das verstärkte Vorkommen von ROS reguliert. Macrophage stimulating protein (MSP) übt Einfluss auf Migration, Proliferation und Phagocytose von Makrophagen aus. Seine Beteiligung an inflammatorischen Vorgängen und der Karzinogenese ist intensiv untersucht worden, nicht jedoch der Einfluss auf die Atherosklerose. Es ist bekannt, dass der SNP rs3197999 mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) assoziiert ist. Zudem geht er vermutlich mit einem erniedrigten Atheroskleroserisiko einher. Der Polymorphismus c2078t hat den Aminosäureaustausch R689C zur Folge. Rekombinant erzeugtes, mutantes und wildtypisches MSP induziert Migration und Proliferation bei THP-1-Makrophagen. MSPmut vermittelt dies jedoch wesentliche effektiver als MSPwt. Apoptose hingegen wird durch keine der Formen induziert. R689C führt zu einem “gain of function” des MSP-Proteins in Bezug auf die Proliferations- und Migrationsfähigkeit von Makrophagen und verändert vermutlich deren Cytokinfreisetzung. Dies führt möglicherweise zu einer erhöhten Phagocytoseeffizienz in der atherosklerotischen Läsion (erniedrigtes Atherosklerose-Risiko), und zu einer aberranten immunologischen Reaktion im Rahmen der CED (erhöhtes CED-Risiko).

Differentiation and extracellular matrix interactions of chondrocytes in response to signaling molecules and biomaterials for cartilage repair = Differenzierung und Interaktionen von Chondrozyten mit der extrazellulären Matrix als Reaktion auf Signalmoleküle und Biomaterialien für die Wiederinstandsetzung von Knorpel

Chondrocytes live isolated in the voluminous extracellular matrix of cartilage, which they secrete and is neither vascularized nor innervated. Nutrient and waste exchanges occur through diffusion leading to low oxygen tension around the cells. Consequently even normal cartilage under normal physiological conditions suffers from a poor reparative potential that predisposes to degenerative conditions, such as osteoarthritis of the joints, with significant clinical effects.rnOne of the key challenges in medicine is the structural and functional replacement of lost or damaged tissues. Current therapeutical approaches are to transplant cells, implant bioartificial tissues, and chemically induce regeneration at the site of the injury. None of them reproduces well the biological and biomechanical properties of hyaline cartilage.rnThis thesis investigates the re-differentiation of chondrocytes and the repair of cartilage mediated by signaling molecules, biomaterials, and factors provided in mixed cellular cultures (co-culture systems). As signaling molecules we have applied prostaglandin E2 (PGE2) and bone morphogenetic protein 1 (BMP-1) and we have transfected chondrocytes with BMP-1 expressing vectors. Our biomaterials have been hydrogels of type-I collagen and gelatin-based scaffolds designed to mimic the architecture and biochemistry of native cartilage and provide a suitable three-dimensional environment for the cells. We have brought chondrocytes to interact with osteosarcoma Cal 72 cells or with murine preosteoblastic KS483 cells, either in a cell-to-cell or in a paracrine manner.rnExogenous stimulation with PGE2 or BMP-1 did not improve the differentiation or the proliferation of human articular chondrocytes. BMP-1 induced chondrocytic de-differentiation in a dose-dependent manner. Prostaglandin stimulation from gelatin-based scaffolds (three-dimensional culture) showed a certain degree of chondrocyte re-differentiaton. Murine preosteoblastic KS483 cells had no beneficial effect on human articular chondrocytes jointly cultivated with them in hydrogels of type I collagen. Although the hydrogels provided the chondrocytes with a proper matrix in which the cells adopted their native morphology; additionally, the expression of chondrocytic proteoglycan increased in the co-cultures after two weeks. The co-culture of chondrocytes with osteoblast-like cells (in transwell systems) resulted in suppression of the regular de-differentiation program that passaged chondrocytes undergo when cultured in monolayers. Under these conditions, the extracellular matrix of the chondrocytes, rich in type-II collagen and aggrecan, was not transformed into the extracellular matrix characteristic of de-differentiated human articular chondrocytes, which is rich in type-I collagen and versican.rnThis thesis suggests novel strategies of tissue engineering for clinical attempts to improve cartilage repair. Since implants are prepared in vitro (ex-vivo) by expanding human articular chondrocytes (autologous or allogeneic), we conclude that it will be convenient to provide a proper three-dimensional support to the chondrocytes in culture, to supplement the culture medium with PGE2, and to stimulate chondrocytes with osteoblastic factors by cultivating them with osteoblasts.rn

In vivo konditionale Depletion von latentem murinen Cytomegalovirus

Die Lunge stellt einen Hauptort der CMV-Latenz dar. Die akute CMV-Infektion wird durch infiltrierende antivirale CD8 T-Zellen terminiert. Das virale Genom verbleibt jedoch im Lungengewebe in einem nicht replikativen Zustand, der Latenz, erhalten. Es konnte bereits gezeigt werden, dass während der Latenz die Major Immediate Early- (MIE) Gene ie1- und ie2 sporadisch transkribiert werden. Bisher konnte diese beginnende Reaktivierung latenter CMV-Genome nur in einer Momentaufnahme gezeigt werden (Kurz et al., 1999; Grzimek et al., 2001; Simon et al., 2005; zur Übersicht: Reddehase et al., 2008). Die sporadische Expression der MIE-Gene führt jedoch zur Präsentation eines antigenen IE1-Peptids und somit zur Stimulation antiviraler IE1-Peptid-spezifischer CD8 T-Zellen, die durch ihre Effektorfunktion die beginnende Reaktivierung wieder beenden. Dies führte uns zu der Hypothese, dass MIE-Genexpression über einen Zeitraum betrachtet (period prevalence) häufiger stattfindet als es in einer Momentaufnahme (point prevalence) beobachtet werden kann.rnrnUm die Häufigkeit der MIE-Genexpression in der Dynamik in einem definierten Zeitraum zu erfassen, sollte eine Methode entwickelt werden, welche es erstmals ermöglicht, selektiv und konditional transkriptionell aktive Zellen sowohl während der akuten Infektion als auch während der Latenz auszulöschen. Dazu wurde mit Hilfe der Zwei-Schritt BAC-Mutagenese ein rekombinantes death-tagged Virus hergestellt, welches das Gen für den Diphtherie Toxin Rezeptor (DTR) unter Kontrolle des ie2-Promotors (P2) enthält. Ist der P2 transkriptionell aktiv, wird der DTR an der Zelloberfläche präsentiert und die Zelle wird suszeptibel für den Liganden Diphtherie Toxin (DT). Durch Gabe von DT werden somit alle Zellen ausgelöscht, in denen virale Genome transkriptionell aktiv sind. Mit zunehmender Dauer der DT-Behandlung sollte also die Menge an latenten viralen Genomen abnehmen.rnrnIn Western Blot-Analysen konnte das DTR-Protein bereits 2h nach der Infektion nachgewiesen werden. Die Präsentation des DTR an der Zelloberfläche wurde indirekt durch dessen Funktionalität bewiesen. Das rekombinante Virus konnte in Fibroblasten in Gegenwart von DT nicht mehr replizieren. In akut infizierten Tieren konnte die virale DNA-Menge durch eine einmalige intravenöse (i.v.) DT-Gabe signifikant reduziert werden. Verstärkt wurde dieser Effekt durch eine repetitive i.v. DT-Gabe. Auch während der Latenz gelang es, die Zahl der latenten viralen Genome durch repetitive i.v. und anschließende intraperitoneale (i.p.) DT-Gabe zu reduzieren, wobei wir abhängig von der Dauer der DT-Gabe eine Reduktion um 60\% erreichen konnten. Korrespondierend zu der Reduktion der DNA-Menge sank auch die Reaktivierungshäufigkeit des rekombinanten Virus in Lungenexplantatkulturen. rnrnrnUm die Reaktivierungshäufigkeit während der Latenz berechnen zu können, wurde durch eine Grenzverdünnungsanalyse die Anzahl an latenten viralen Genomen pro Zelle bestimmt. Dabei ergab sich eine Kopienzahl von 9 (6 bis 13). Ausgehend von diesen Ergebnissen lässt sich berechnen, dass, bezogen auf die gesamte Lunge, in dem getesteten Zeitraum von 184h durch die DT-Behandlung 1.000 bis 2.500 Genome pro Stunde ausgelöscht wurden. Dies entspricht einer Auslöschung von 110 bis 280 MIE-Gen-exprimierenden Lungenzellen pro Stunde. Damit konnte in dieser Arbeit erstmals die Latenz-assoziierte Genexpression in ihrer Dynamik dargestellt werden.rn

Altersabhängige Besonderheiten in der Entwicklung des Bedeutungsfeldes der binären Opposition von „Möglichkeit“ vs. „Unmöglichkeit“

Die vorliegende Arbeit zum kindlichen Erwerb der binären Opposition von „Möglichkeit“ und „Unmöglichkeit“ und ihrer modalen Ausdrucksweisen im Russischen ist in ihrem praktischen Teil eine Einzelfall- und Langzeitstudie, die eine Ergänzung zu den bisher veröffentlichten, durchgehend eher experimentell und statistisch orientierten Forschungsarbeiten darstellen soll.rnÜber dreieinhalb Jahre hinweg wurde kontinuierlich Sprachmaterial eines Kindes sowie einiger ungefährer Altersgenossen und Spielkameraden aufgezeichnet, geordnet und ausgewertet. Zu Beginn des Untersuchungszeitraums war die Hauptprobandin dreieinhalb Jahre alt, zum Schluß sieben Jahre. Dieses Verfahren wurde bisher für das Russische noch nicht angewandt und wird im theoretischen Teil sorgfältig begründet.rnDas Sammeln für die Fragestellung relevanten sprachlichen Materials erfordert naturgemäß einen hohen Zeit- und Arbeitsaufwand, liefert dafür aber Daten, die eine Beeinflussung durch einen vorgegebenen Versuchsaufbau ausschließen, der natürlichen, spontanen Kommunikation entspringende Äußerungen festhalten und es ermöglichen, unprovozierte Interaktion, situationsbedingte Einflüsse, das Diskursverhalten der Probanden und ähnliche, individuelle Faktoren bei der Interpretation des Sprachmaterials in angemessener Weise zu berücksichtigen.rnUm die Fülle modaler Ausdrucksweisen sinnvoll zu strukturieren, konzentriert sich die Analyse auf die kindliche Verwendung von Modalverben und Prädikative als zentrale Mittel innerhalb des „Möglichkeitsfeldes“ und richtet den Fokus dabei auf das Verb moč’. Aus diesem Grunde wurde das theoretische Fundament, das der Arbeit zugrunde liegt, zu einem nicht geringen Teil aus dem Ansatz I.V. Šatunovskijs entwickelt, der die differenzierteste Analyse der zahlreichen Bedeutungsschattierungen des Verbs moč’ vorgelegt hat. Für besonders bedeutungsvoll für die vorliegende Arbeit erweist sich die Unterscheidung von kontrollierbarer und unkontrollierbarer Möglichkeit.rnIm Rahmen der Untersuchung ließen sich die grundlegenden Entwicklungstendenzen verfolgen. Dabei wurde nicht nur versucht nachzuvollziehen, in welcher Weise sich bei einem Kind das Fundament des Sprachgebrauchs in Gestalt eines allgemeinen „Zitatenschatzes“ formiert, sondern es gelang mitunter sogar, erste Fälle der Verwendung des einen oder anderen kommunikativen Fragments mit der Bedeutung von „Möglichkeit“ / „Unmöglichkeit“ oder erste Fälle der Konfrontation des Kindes mit einer neuen Situation, die eine solche Bedeutung verlangte, und sein Sprachverhalten in diesem Moment zu fixieren.

Klonale Analysen im embryonalen Gehirn von Drosophila mit besonderem Fokus auf die Entwicklung der Pilzkörper

Eine wichtige Voraussetzung für das Verständnis der Spezifizierungsmechanismen unterschiedlicher Zelltypen im embryonalen Gehirn ist die detaillierte Kenntnis des neuroektodermalen Ursprungs seiner neuralen Stammzellen (Neuroblasten, NB), sowie der Morphologie und zellulären Komposition der daraus hervorgehenden Zellstammbäume (ZSBe). In der vorliegenden Arbeit wurde die Entstehung und Topologie von 21 embryonalen ZSBen im anteriorsten Gehirnteil, dem Protocerebrum, charakterisiert, mit besonderem Fokus auf solche ZSBe, die den Pilzkörper konstituieren. Pilzkörper sind prominente, paarige Neuropilzentren, die eine wichtige Rolle bei der Verarbeitung olfaktorischer Informationen, beim Lernen und bei der Gedächtnisbildung spielen. In dieser Arbeit konnte erstmalig die Embryonalentwicklung der Pilzkörper ab dem Zeitpunkt der Entstehung ihrer NBen im procephalen Neuroektoderm (pNE), bis hin zum funktionellen Gehirnzentrum in der frühen Larve auf Ebene individueller ZSBe bzw. einzelner Neurone beschrieben werden. Mittels der klonalen Di-Markierungstechnik konnte ich zeigen, dass die vier NBen der Pilzkörper (PKNBen) jeder Gehirnhemisphäre innerhalb des NE aus dem ventralen Bereich der mitotischen Domäne B (δB) hervorgehen. Ein in diesem Bereich liegendes proneurales Feld beherbergt etwa 10-12 Zellen, die alle das Potential haben sich zu PKNBen zu entwickeln. Des Weiteren zeigen diese Untersuchungen, dass die PKNBen (und weitere NBen der δB) aus benachbarten NE-Zellen hervorgehen. Dieser Befund impliziert, dass der Mechanismus der lateralen Inhibition in diesem Bereich des NE keine Rolle spielt. Weiterhin stellte sich heraus, dass jeder PKNB eine ihm eigene Position im sich entwickelnden Pilzkörperkortex besetzt und eine spezifische Kombination der Transkriptionsfaktoren Dachshund, Eyeless und Retinal homeobox exprimiert. Dadurch konnte jeder der vier PKNBen in den betreffenden frühembryonalen NB-Karten einem der ca. 105 NBen pro Gehirnhemisphäre zugeordnet werden. Die PKNBen bringen individuelle ZSBe hervor, die Pilzkörper-intrinsische γ-Neurone beinhalten, aber auch jeweils charakteristische Sets an Interneuronen, die nicht am Aufbau des Pilzkörpers beteiligt sind. Diese verschiedenen Neuronentypen entstehen in einer zeitlichen Abfolge, die für jeden PKNBen spezifisch ist. Ihre embryonalen ZSBe sind aber nicht nur durch individuelle Sets an frühgeborenen ni-Neuronen charakterisiert, sondern auch durch spezifische Unterschiede in der Anzahl ihrer γ-Neurone, welche jedoch, wie ich zeigen konnte, nicht durch Apoptose reguliert wird. Weiterhin konnte ich zeigen, dass γ-Neurone, in einer PKNB Klon-abhängigen Weise, spezifische Unterschiede in der räumlich-zeitlichen Innervation des Pedunkels, der Calyx und der Loben aufweisen. Im Weiteren wurde die Expression verschiedener molekularer Marker in diesen ZSBen charakterisiert, u.a. die Expression verschiedener Gal4-Fliegenstämme, und solcher Transkriptionsfaktoren, die eine wichtige Rolle bei der temporären Spezifizierung im VNS spielen. So werden hb, Kr, pdm1 auch in Nachkommenzellen der PKNBen exprimiert und haben möglicherweise eine Funktion bei ihrer temporären Spezifizierung. Diese Arbeit gibt auch erstmalig Einblick in die vollständige spätembryonale/frühlarvale Morphologie anderer protocerebraler Gehirnzellstammbäume aus δB und δ1. Die Beschreibungen dieser ZSBe beinhalten Angaben zu deren Zellzahl, Zelltypen, der Lage der ZSBe im Gehirn, axonalen/dendritischen Projektionsmustern sowie dem Entstehungsort des NBen.

Isolierung und Charakterisierung der ER-residenten Aminopeptidase ERMP1 und Untersuchung ihrer Funktion in der Prozessierung MHC I restringierter CTL Epitope

Die effiziente Generierung von Peptid-Epitopen aus zelleigenen oder viralen Proteinen für die Präsentation auf „Major Histocompatibility Complex I“ (MHC I) Molekülen ist essentiell für die Aktivierung des adaptiven Immunsystems und die Effektorfunktion der CD8+ zytotoxischen T-Zellen (CTLs). CTLs erkennen diese Peptide in Kontext mit MHC I Molekülen über ihren spezifischen T-Zellrezeptor (TCR). Die Generierung dieser Epitope ist das Resultat eines komplexen proteolytischen Prozesses, der im Zytosol und im endoplasmatischen Retikulum (ER) stattfindet. Im Zytosol generiert das Proteasom N-terminal verlängerte Epitop-Vorläufer. Diese werden durch weitere zytosolische Proteasen abgebaut, es sei denn, sie werden durch den „transporter associated with antigen processing“ (TAP) in das ER transportiert. Dort werden sie durch Aminopeptidasen getrimmt, um den Bindungsvoraussetzungen der MHC I Moleküle zu genügen. Im murinen System ist die „ER aminopeptidase associated with antigen processing“ (ERAAP) die bislang einzige beschriebene Aminopeptidase, die dieses N-terminale Trimming von CTL Epitopen vermitteln kann. Das Profil der proteolytischen Aktivität in angereichertem murinen ER kann jedoch nicht allein durch die Aktivität von ERAAP erklärt werden, was auf die Anwesenheit weiterer Aminopeptidasen mit einer potentiellen Funktion in der Antigenprozessierung hinweist. In dieser Arbeit konnte die immunologisch bislang noch nicht beschriebene Aminopeptidase ERMP1 (endoplasmic reticulum metallopeptidase 1) im murinen ER identifiziert werden. Nach Aufreinigung muriner Mikrosomen und anschließender Anionenaustausch-Chromatographie wurden die gesammelten Fraktionen mit fluorogenen Substraten auf Aminopeptidase-Aktivität getestet. Durch massenspektrometrische Analyse konnten in den beobachteten Peaks die schon beschriebenen Aminopeptidasen ERAAP, die „insulin regulated aminopeptidase“ IRAP und die immunologisch bislang nicht beschriebene Aminopeptidase ERMP1 identifiziert werden. Durch Fluoreszenzmikroskopie konnte die intrazelluläre Lokalisation von ERMP1 im ER durch Kolokalisation mit TAP verifiziert werden. Wie viele Komponenten des MHC I Prozessierungsweges wird auch die Expression von ERMP1 durch IFN-γ stimuliert. Dies macht ERMP1 zu einer potentiellen zweiten trimmenden Aminopeptidase im murinen ER. Überexpression von ERMP1 hat einen allelspezifischen Einfluss auf die globale MHC I Präsentation auf der Zelloberfläche und durch Überexpression und shRNA vermitteltes gene silencing konnte außerdem ein epitopspezifischer Effekt nachgewiesen werden. Da N-terminales Trimming durch ERAAP mit der Evasion von Tumoren und veränderter Immundominanz assoziiert wird, ist die detaillierte Charakterisierung der Aminopeptidase ERMP1 ein wichtiger Schritt zum Verständnis der MHC I Antigen-Prozessierung und der Generierung von CTL Epitopen im ER.

Inhibition allergenspezifischer Immunantworten im Mausmodell der Typ-I Allergie nach biolistischer Vakzinierung mit allergenkodierenden Plasmiden in Kombination mit für immunmodulatorische Moleküle kodierender Plasmid-DNA

Die Induktion von Toleranz spielt bei der Inhibition allergischer Immunreaktionen eine wichtige Rolle. Hierbei ist die Induktion regulatorischer T Zellen (Treg) von großer Bedeutung. Da zu einer erfolgreichen Behandlung von allergischen Erkrankungen bisher nur wenige Therapiemöglichkeiten zur Verfügung stehen wie die spezifische Immuntherapie (SIT), die allerdings nicht immer zum Erfolg führt, ist es wichtig neue Therapieformen zu entwickeln. rnIn dieser Arbeit wurde daher die biolistische DNA-Immunisierung mit Kombinations-Vakzinen bestehend aus einem allergenkodierenden Plasmid (βGalaktosidase (βGal)) in Kombination mit einem Plasmid, welches für ein immunmodulatorisches Molekül kodiert (Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO), Transforming Growth Factor beta (TGF-β) oder Interleukin-10 (IL-10)), durchgeführt und im Mausmodell der allergeninduzierten IgE-vermittelten Atemwegsinflammation auf ihre Wirksamkeit untersucht. Die Expression des Allergens zusammen mit dem immunregulatorischen Molekül in transfizierten Dendritischen Zellen (DCs) sollte zu einer Induktion von Treg führen und somit eine Suppression der Immunantwort bewirken. rnIn den Versuchen wurde zunächst der Effekt einer Transgenexpression unter der Kontrolle des ubiquitären CMV-Promotors mit dem der Transgenexpression unter der Kontrolle des Fascin-Promotors, der eine Genxpression spezifisch in DCs erlaubt, verglichen. Hierbei stellte sich heraus, dass es wichtig ist die Expression des Antigens mit Hilfe des Fascin-Promotors auf DCs zu beschränken. Einzig in diesem Fall konnte nach der Vakzinierung ein inhibitorischer Effekt auf die Entwicklung einer Atemwegshyperreaktivität durch Expression des Immunmodulatoren IDO beobachtet werden. Es zeigte sich auch, dass es von Vorteil ist, wenn das immunregulatorische Molekül unter Verwendung des CMV-Promotors in allen transfizierten Zellen exprimiert wird. Dies bewirkt, dass IDO in ausreichenden Konzentrationen vorhanden ist. rnDie Expression von βGal unter der Kontrolle des Fascin-Promotors (pFascin-βGal) in Kombination mit der Expression der Moleküle IL-10, TGF-β oder IDO unter Kontrolle des CMV-Promotors (pCMV-IL-10, pCMV-TGFβ, pCMV-IDO) bewirkte eine Immunsupprimierung, die sich in einer inhibierten Produktion antigenspezifischer Antikörper, einer verminderten Zytokin-Produktion, einer reduzierten Induktion zytotoxischer T-Zellen und in einer Inhibition der allergeninduzierten Atemwegshyperreaktivität zeigte, im Vergleich zu einer Vakzinierung mit pFascin-βGal in Kombination mit einem Kontroll-Plasmid. Bei nachfolgender Proteinsensibilisierung blieben diese Effekte jedoch nicht bestehen. Einzig durch Vakzinierung mit IL-10-kodierenden Plasmiden konnte eine moderate Verminderung der Atemwegsreaktivität nachgewiesen werden. rnIn einem therapeutischen Modell der Atemwegsinflammation, in dem die Mäuse vor der DNA-Immunisierung mit dem Protein sensibilisiert wurden, wurde demonstriert, dass im Vergleich zu Mäusen, die nur mit dem Protein sensibilisiert wurden, eine DNA-Immunisierung mit pFascin-βGal aber auch mit pCMV-βGal einen inhibierenden Einfluss auf die Entwicklung einer Atemwegsinflammation hat. Eine weitere Reduktion der Atemwegsreaktivität durch eine kombinierte Vakzinierung mit pCMV-IDO wurde nur erreicht, wenn βGal unter der Kontrolle des Fascin-Promotors exprimiert wurde, nicht aber unter Kontrolle des CMV-Promotors.rn

Funktionsaufklärung von Atmungsproteinen in Insekten

Globine sind kleine globuläre Proteine mit nahezu ubiquitärem Vorkommen in allen Tiergruppen. Sie weisen eine typische Sandwichstruktur auf, die in der Regel aus acht α-Helices mit einer zentralen prosthetischen Häm-Gruppe besteht und die Proteine zur Bindung gasförmiger Liganden befähigt. Die Funktionen der Globine reichen von O2-Transport und – Speicherung, über eine Beteiligung bei der Entgiftung reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies bis hin zu sensorischen physiologischen Aufgaben. Innerhalb der Klasse der Insekten schien das Vorhandensein von Globinen zunächst auf Insekten mit offensichtlich hypoxischen Habitaten beschränkt zu sein. Die Entdeckung des Globins glob1 in Drosophila melanogaster deutete jedoch eine sehr viel weitere Verbreitung der Globine in Insekten an, die sich durch die Identifizierung von Globingenen in einer Vielzahl von normoxisch lebenden Insekten, wie z.B. Apis mellifera oder Aedes aegypti bestätigte. D. melanogaster besitzt drei Globine, glob1, glob2 und glob3. Glob1 ist eng mit anderen intrazellulären Insektenglobinen verwandt, was zu der Annahme führte, dass es sich bei glob1 um das ursprüngliche und bei glob2 und glob3 um abgeleitete D. melanogaster Globine handelt. Glob1 wird in allen Entwicklungsstadien exprimiert, wobei die Hauptexpressionsorte der Fettkörper und das Tracheensystem sind. Die Transkription des glob1 startet von zwei alternativen Promotoren (Promotor I und II), wodurch in Kombination mit alternativem Splicing vier Transkriptvarianten (Isoform A-D) entstehen, deren Translation jedoch in einer Proteinvariante (glob1) resultiert. Hypoxische Bedingungen führen zu einer vermutlich HIF (=‚hypoxia-inducible factor‘) -vermittelten Abnahme der glob1 Genexpression, wohingegen Hyperoxie eine leichte Zunahme der glob1 mRNA Menge bewirkt. Der mithilfe des UAS/Gal4- Systems erzeugte, RNAi-vermittelte glob1 Knockdown führt zu einer schlechteren Überlebensrate adulter Fliegen unter hypoxischen Bedingungen, einer verkürzten Erholungszeit nach hypoxischem Stupor in Weibchen sowie zu einer erhöhten Resistenz gegenüber dem ROS (=‘reactive oxygen species‘) -generierenden Herbizid Paraquat in Larven und adulten Weibchen. Diese Beobachtungen sprechen für eine Funktion des Drosophila glob1 innerhalb der O2-Versorgung. Unter hyperoxischen Bedingungen hingegen wurde kein Unterschied zwischen Fliegen mit wildtypischer und manipulierter glob1-Expression festgestellt, wodurch eine Beteiligung des glob1 bei der Entgiftung reaktiver Sauerstoffspezies als mögliche Funktion vorerst ausscheidet. Bei glob2 und glob3 handelt es sich um duplizierte Gene. Auf phylogenetischen Rekonstruktionen basierend konnte die Entstehung der Globin-Duplikate auf ein Duplikationsereignis vor der Radiation des Subgenus Sophophora vor mindestens 40 Millionen Jahren zurückgeführt werden. Die durchgeführten Analysen zur molekularen Sequenzevolution der Globin-Duplikate deuten darauf hin, dass glob2 und glob3 nach der Duplikation eine Kombination aus Sub- und Neo-Funktionalisierungsprozessen durchlaufen haben. Glob2 und glob3 zeigen eine deckungsgleiche mRNA Expression, die auf die männliche Keimbahn beschränkt ist. Aufgrund des hohen Konservierungsgrads der für die Häm- und O2-Bindung essentiellen Aminosäuren kann von der Funktionalität beider Proteine ausgegangen werden. Die streng auf die männliche Keimbahn begrenzte Expression von glob2 und glob3 deutet auf eine Rolle der Globin-Duplikate innerhalb der Spermatogenese hin, die möglicherweise in einem Schutz der Spermatogenese vor oxidativem Stress besteht. Auch eine Beteiligung beim korrekten Ablauf der Spermien-Individualisierung, beispielsweise durch Regulation von Apoptoseprozessen wäre denkbar.

Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Biomarkern beim Glaukom

Das Glaukom ist, nach dem Katarakt, die zweithäufigste Ursache für Erblindungen weltweit mit Milionen von Betroffenen, die von dieser zunächst weitgehend symptomfreien neurodegenerativen Erkrankung heimgesucht werden. Die Möglichkeiten auf dem Feld der Diagnose beschränken sich bislang weitestgehend auf die Messung des Augeninnendrucks und der Beurteilung des Augenhintergrundes durch einen erfahrenen Augenarzt. Eine labordiagnostische Prophylaxe ist bis heute nicht verfügbar, die Zahl unerkannter Erkrankungen dementsprechend hoch. Hierdurch geht wertvolle Zeit verloren, die man für eine effektive Therapie nutzen könnte.rnBezüglich der Pathogenese des Glaukoms geht man heute von mehreren, miteinander wechselwirkenden Pathomechanismen aus, zu denen neben mechanischen Einflüssen durch einen erhöhten IOD auch Hypoxie, verminderte Neutrophinversorgung, Exzitotoxizität, oxidativer Stress und eine Beteiligung autoimmuner Prozesse gezählt werden. Unabhängig vom Pathomechanismus folgt stets die Etablierung umfangreicher degenerativer Prozesse im Sehnervenkopf, den retinalen Ganglienzellen und den Axonen des Sehnerven, die letztlich im irreversiblen Untergang dieser Neuronen münden. Diese pathologischen Prozesse im ZNS hinterlassen auf Proteomebene Spuren, die mithilfe moderner massenspektrometrischer Methoden in Kombination mit multivariaten statistischen Methoden detektierbar und als sogenannte Biomarker-Kandidaten mit definiertem Molekulargewicht darstellbar sind. In dieser Arbeit wurde ein „Workflow“ entwickelt, der es ermöglicht, diese Biomarker-Kandidaten im Blutserum und in der Tränenflüssigkeit in einfachen, reproduzierbaren Schritten zu identifizieren und zu charakterisieren. Abweichend von der etablierten Methotik der Bottom-Up-Proteomics musste hierfür eine Methode entsprechend einer Top-Down-Philosophie entwickelt werden, die es erlaubt, die Spuren des Glaukoms im Proteom zu detektieren und zu charakterisieren.rnDies erfolgte in dieser Arbeit durch sowohl massenspektroskopischen Methoden wie SELDI-TOF® und MALDI-Tof-Tof als auch durch Bead-, Gel- und Flüssigkeits-chromatographisch-basierte Separations und Fraktionierungstechniken.rnDie erfolgreiche Kombination dieser Methoden führte zu Identifikationen einer ganzen Reihe von Biomarker-Kandidaten. Unter den identifizierten Proteinen, die bezüglich ihres korrespondierenden SELDI-Peaks im Massenbereich von Biomarker-Kandidaten liegen, finden sich Zytokine und Effektormoleküle der angeborernen Immunität, stressinduzierbare Kinasen, Faktoren, die zum Schutz der Telomeren dienen, Proliferationsmarker, neuronale Antigene und Transportproteine. Darüber hinaus wurden Komponenten identifiziert, die an der neuronalen Neutrophinversorgung beteiligt sind, neuronale Rezeptoren und Antigene, Komponenten des Komplementsystems und des MHC-I-Komplexes. All diese identifizierten Proteine sind bezüglich ihrer Funktion und möglichen Rolle innerhalb der Pathogenese des Glaukoms detailliert beschrieben und charakterisiert. Dies erlaubt einen umfassenden Einblick in alle Pathomechanismen, denen nach heutigem Kenntnisstand, eine Rolle an der Pathogenese des Glaukoms unterstellt wird.rn

Sozioökonomische Modernisierung und Demokratie in postkommunistischen Transformationsstaaten : eine quantitativ-empirische Analyse zwischen 1996 und 2009 unter Einbezug von Globalisierung

Die vorliegende Arbeit untersucht, in wie weit sich sozioökonomische Entwicklung und die Einbindung in Globalisierungsprozesse verantwortlich für die demokratische Entwicklung postkommunistischer Transformationsstaaten zeigen. Zu diesem Zweck wird ein theoretisches Modell hergeleitet, welches die klassische Modernisierungstheorie um neuere Ansätze erweitert und um Aspekte der Globalisierungsforschung ergänzt. Die empirischen Resultate basieren auf einer quantitativen Betrachtung von 19 postkommunistischen Staaten im Zeitraum zwischen 1996 und 2009. Die Ergebnisse zeigen, dass sich sozioökonomische Entwicklung und ökonomische Aspekte der Globalisierung positiv auf die Demokratieentwicklung auswirken; eine ungleiche Verteilung von Einkommen in der Bevölkerung sowie soziale Globalisierungsaspekte hingegen weisen lediglich marginale Effekte auf.

Langzeitergebnisse nach Trabekulektomie bei Glaukompatienten

Hintergrund: Die antimetabolitgestützte Trabekulektomie stellt seit längeren denrnGoldstandard bei medikamentös nicht ausreichend therapierbaren Glaukomen dar. Kurz- und mittelfristige Erfolge wurden durch viele Studien bestätigt. Allerdings unterliegen diese sehr unterschiedlichen Erfolgsdefinitionen. Eine strikte Druckkontrolle ≤ 15 mm Hg ohne zusätzliche medikamentöse Therapie erscheint sinnvoll einen risikofreien Therapieerfolg zu bewerten. Es existieren nur wenige Langzeitstudien mit diesem Erfolgskriterium. Die durchgeführte Studie soll einen Eindruck der ophthalmologischen Versorgung trabekulektomierter Patienten an der Universitätsaugenklinik Mainz über einen bewusst langen Zeitraum bieten. Patienten und Methoden: In diese retrospektiven Studie wurden alle Patienten, die aufgrund einer fortgeschrittenen Glaukomerkrankung in den Jahren 1996, 2001 oder 2006 eine Trabekulektomie erhielten, aufgenommen. Von den 723 Augen der 664 Patienten dieser Jahrgänge konnten 447 (61,8%) nachverfolgt werden. Die Zusammensetzung der Patienten war mit anderen Studien vergleichbar. 28% konnten mindestens 7 Jahre, 10% sogar 10 Jahre nachverfolgt werden. Esrnwurde untersucht, ob ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem ophthalomologisch-internistischem Entlassstatus (Visus, Tensio, Gesichtsfeld,rnGlaukomtyp, Voroperationen, Medikation, Vorerkrankungen, Art der Operation) undrnder erstrebten Kontrolle des Intraokulardruckes besteht. Ergebnisse: Die mittlere Nachbeobachtungszeit betrug 4,3 ± 3,4 Jahre. Nach 1, 3,rn5, 7 und 10 Jahren wiesen 217 (82,1%) (p < 0,001), 133 (67,7%) (p < 0,001), 70rn(50%) (p < 0,001), 59 (47,7%) (p = 0,056) und 16 (38,1%) (p = 0,06) Augen Intraokulardrücke ≤ 15 mm Hg ohne zusätzliche Antiglaukomatosa auf. Nichtrnstatistisch signifikant waren die 7- und 10-Jahresergebnisse. Mit Hilfe von Antiglaukomatosa waren es insgesamt, 225 (85,1%), 156 (79,7%), 87 (62,5%), 93 (75%) und 23 (54,7%) (alle p < 0,001). Die mediane Überlebenszeit für IOD ≤ 15 mm Hg ohne Medikation betrug 7,4 Jahre ± 5 Monate. Druckobergrenzen von ≤ 18 bzw. 21 mm Hg erfüllten bis zu 20% mehr Patienten. Der mittlere Visus von 0,32 ± 6 Stufen blieb nach einem mittleren postoperativen Abfall auf 0,25 ± 5 Stufen in den Folgeuntersuchungen stabil. Er zeigte ab dem 3-Jahresintervall keine statistisch signifikante Verschlechterung zum präoperativen Visus. 5,8 Jahre ± 80 Tage betrug die mediane Überlebenszeit für ein stabiles Gesichtsfeld. Gesichtsfelddaten, MD und PSD zeigten keine statistisch signifikante Verschlechterung (p > 0,05). Risikofaktoren für ein Scheitern der Operation waren Patientenalter (RR = 1,01, KI: 0,95 - 1,34, p = 0,043), arterielle Hypertonie (RR = 1,87, KI: 1,21-2,9, p = 0,005) und männliches Geschlecht (RR = 1,24; KI: 1,07 – 1,43; p = 0,004). Komplikationen waren passagere okuläre Hypotonien an 85 (19%), Fistulation an 46(10,2%), Aderhautschwellung an 29 (6,4%) –abhebung an 14 (3,1%), retinale Amotio an 9 (2%), hypotone Makulopathie an 5 (1,1%) und Hypertonien an 70 (15,6%) Augen. 150 (33,5%) Augen erhielten einen Folgeeingriff, 117 (26%) eine Phakoemulsifikation, 149 (33%) eine Fadenlockerung, 122 (27%) 5-FU-Injektionen, 42 (9,4%) eine Fadennachlegung, 33 (7,4%) ein Needling, 26 (5,8%) eine Zyklophotokoagulation, 19 (4,3%) eine Re-TE und 9 (2%) sonstige chirurgische Revisionen. Schlussfolgerung: Die Kontrolle des Augeninnendruckes ≤ 15 mm Hg ohne zusätzliche Medikation erreichten viele Patienten über einen langen Nachbeobachtungszeitraum. Die Häufigkeit der Komplikationen oder nötiger Folgeeingriffe war meist niedriger als in vergleichbaren Studien. Selbst Patienten mit hohem Risikoprofil hatten gute Ergebnisse. Aufgrund mangelnder Gesichtsfelddaten fanden sich keine Hinweise auf statistisch relevantes Fortschreiten des Glaukoms zur angestrebten medikationsfreien Druckkontrolle. Weitere Studien für einen Untersuchungszeitraum von 10 Jahren mit gleichen Erfolgskriterien wie in der vorliegenden Arbeit mit genauer Analyse der Gesichtsfelddaten wären wünschenswert, um zu belegen, dass die guten Langzeitergebnisse nach Trabekulektomie an der Universitätsaugenklinik Mainz auch eine Glaukomprogredienz dauerhaft verhindern. Damit stellt die an der Universitätsaugenklinik Mainz durchgeführte antimetabolitgestützte Trabekulektomie und deren postoperative Nachbetreuung an einer repräsentativen Population eine sichere und komplikationsarme Methode dar.

Präklinische Evaluierung von therapeutischer Vakzinierung zur Effizienzsteigerung der adoptiven Immuntherapie von Cytomegalovirus-Erkrankungen

Klinische Manifestationen einer Cytomegalovirus (CMV)-Infektion gefährden den therapeutischen Erfolg der hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT). Dabei stellt insbesondere die Reaktivierung von latentem CMV im HSCT-Rezipienten das häufigste Infektionsrisiko dar. Die Inzidenz der CMV-Erkrankung kann durch Rekonstitution adoptiv transferierter CMV-spezifischer CD8 T-Zellen im HSCT-Rezipienten reduziert werden. Das Modell der sogenannten adoptiven Immuntherapie wurde zunächst im murinen Modell entwickelt und bereits in klinischen Studien bestätigt. Jedoch ist der adoptive Transfer (AT) aufgrund der nur limitiert zur Verfügung stehenden therapeutisch effektiven Zellzahlen zurzeit in der klinischen Routine nicht einsetzbar.rnZiel dieser Arbeit war daher die präklinische Evaluierung einer Kombinationstherapie aus AT einer limitierten Anzahl CMV-spezifischer T-Zellen und deren in vivo Expansion durch therapeutische Vakzinierung nach HSCT. Zur Testung dieser Therapie wurde ein murines Modell auf der Grundlage von rekombinanten murinen CMV (mCMV) und rekombinanten HCMV Dense Bodies (DB) etabliert. Beide exprimieren das gut charakterisierte MHC-Klasse-I Kb-restringierte SIINFEKL-Peptid (OVA257-264) des Ovalbumins (OVA) bzw. die Funktions-verlustmutante SIINFEKA als Modellantigen. In den rekombinanten mCMV, mCMV-Δm157Luc/m164-SIINFEKL/-A (mCMV-SIINFEKL/-A), wurde mittels orthotopen Peptid-austauschs das m164257-265 Peptid des gp36,5/m164 Proteins deletiert und durch das SIINFEKL- bzw. SIINFEKA-Peptid ersetzt. Anhand von Priming-Analysen konnte gezeigt werden, dass nach Infektion von C57BL/6 Mäusen mit mCMV-SIINFEKL SIINFEKL-spezifische T-Zellen nachweisbar sind und das im CMV-Genom integrierte SIINFEKL funktional prozessiert und präsentiert wird. Parallel hierzu konnte nach Immunisierung mit DB-SIINFEKL in vivo ein SIINFEKL-spezifisches CD8 T-Zell-Priming induziert werden. In weiteren Experimenten konnte nach DB-SIINFEKL-Immunisierung im poplitealen Lymphknoten sowie in der Milz eine Proliferation von adoptiv transferierten CD8 T-Zellen beobachtet werden. Die anschließenden Challenge-Versuche zeigten, dass eine DB-SIINFEKL-Immunisierung epitopspezifisch vor einer hoch dosierten Challenge-Infektion mit mCMV-SIINFEKL schützt. Im AT-Modell konnte gezeigt werden, dass adoptiv transferierte OT-I Zellen hämatoablativ behandelte Rezipienten epitopspezifisch vor einer mCMV-SIINFEKL-Infektion schützen können, wobei der erzielte Schutz durch zusätzliche Vakzinierung mit DB-SIINFEKL deutlich verbessert werden konnte. Im Anschluss konnte im HSCT-Rezipienten erstmals eine durch zusätzliche Vakzinierung signifikante Verbesserung des protektiven Potenzials adoptiv transferierter OT-I Zellen bestätigt werden. Diese Verstärkung der Protektion ermöglicht die Reduktion der Anzahl der für den Schutz benötigten Zellzahl und erhöht damit die Effizienz der adoptiven Immuntherapie.

Untersuchung der Pharmakokinetik von Ciprofloxacin und Piperacillin bei Intensivpatienten mit kontinuierlichen Hämodialyseverfahren

Infektionen zählen bei hämodialysepflichtigen Intensivpatienten zu den häufigsten Todesursachen. Um die Wirksamkeit und Sicherheit der Antibiotikatherapie zu verbessern, müssen verschiedene Faktoren, zum Beispiel die Pharmakodynamik und Pharmakokinetik des Antibiotikums, die Art des Hämodialyseverfahrens, die Art des Dialysefilters und der Zustand des Patienten berücksichtigt werden. Im Rahmen einer klinischen Studie wurde die antibiotische Wirkung von Piperacillin und Ciprofloxacin bei kontinuierlichen Hämodialyseverfahren mittels pharmakokinetischer Methoden bestimmt.Für die klinische Studie wurde eine HPLC-Methode mit kombinierter Festphasenextraktion (SPE) entwickelt und nach den Grenzwerten der EMA Guideline on Bioanalytical Method Validation validiert. Die Methode erwies sich für die gleichzeitige Bestimmung von Piperacillin und Ciprofloxacin in Plasma- und Dialysatproben als valide und zuverlässig. Die ermittelten Konzentrationen der beiden Antibiotika wurden für die Berechnung der pharmakokinetischen Parameter verwendet.In der klinischen Studie wurden bei 24 Intensivpatienten mit kontinuierlicher venovenöser Hämodialyse (CVVHD) bzw. kontinuierlicher venovenöser Hämodiafiltration (CVVHDF), bei denen Piperacillin/Tazobactam, Ciprofloxacin oder eine Kombination dieser Antibiotika indiziert war, die Antibiotikakonzentrationen im Plasma und Dialysat im Steady State gemessen. Unmittelbar vor einer Antibiotikainfusion (0 min) wurde ein Volumen von sechs Milliliter Blut entnommen. Weitere Blutentnahmen erfolgten 30 Minuten nach der Infusion sowie nach 1, 2, 3, 4, 8, 12 und 24 Stunden. Sobald ein Filtratbeutel ausgetauscht wurde, wurden parallel zu den Blutproben Dialysatproben entnommen. Die Konzentrationen von Piperacillin und Ciprofloxacin wurden nach der Festphasenextraktion aus den Plasmaproben mit der validierten HPLC-Methode innerhalb von 15 Minuten zuverlässig bestimmt. Neben den gemessenen Plasmakonzentrationen (Cmax, Cmin) wurden pharmakokinetische Parameter wie t0,5, VdSS, AUC, Cltot, ClCRRT und Clextrarenal berechnet. Für Piperacillin wurde untersucht, ob die Plasmaspiegel der Patienten für das gesamte Dosierungsintervall oberhalb der geforderten vierfachen MHK von 64 mg/l liegen. Für Ciprofloxacin wurde untersucht, ob die aus gemessenen Plasmaspiegeln berechnete AUC den Quotienten aus AUC und MHK (=AUIC) ≥ 125 h erfüllt.Bei zehn der 21 mit Piperacillin behandelten Patienten lagen die Plasmaspiegel unterhalb der angestrebten Konzentration von 64 mg/l für das gesamte Dosierungsintervall. Das Patientenkollektiv wies eine große interindividuelle Variabilität auf. Mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 % waren 26 - 70 % der Patienten unterdosiert. In der Gruppe der mit Ciprofloxacin behandelten Patienten wurde die angestrebte AUIC von 125 h nur bei neun der 20 Patienten erreicht. Mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 % waren 29 - 76 % der Patienten unterdosiert. Die kontinuierlichen Nierenersatzverfahren hatten nur einen geringen Anteil an der totalen Clearance der untersuchten Antibiotika. Während die Clearance des kontinuierlichen Nierenersatzverfahren bei Piperacillin für ein Drittel der Arzneistoffelimination verantwortlich war, trug diese im Fall von Ciprofloxacin lediglich zu 16 % zur Arzneistoffelimination bei.Die Dosierung von Piperacillin/Tazobactam bzw. Ciprofloxacin sollte bei kritisch kranken Intensivpatienten mit kontinuierlicher Hämodialyse mindestens 4 mal 4/0,5 g pro Tag bzw. 2 mal 400 mg pro Tag betragen. Diese Empfehlungen sind insbesondere für die verwendeten Dialyseverfahren und -bedingungen zutreffend. Zur weiteren Optimierung der Antibiotikatherapie ist ein Therapeutisches Drug Monitoring empfehlenswert.