Synthese 18 F-markierter Liganden zur Visualisierung der GABA-Bindungsstelle des GABA A-Rezeptors mittels PET

��-Aminobutters��ure (GABA) ist der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter im zentralen Nervensystem und bindet vorrangig an ionotrope GABAA-Rezeptoren. Diese sind an fast allen neuronalen Prozessen beteiligt und werden dar��ber hinaus mit neurologischen Erkrankungen wie Epilepsie, Angstzust��nden, Schlafst��rungen und Schizophrenie in Verbindung gebracht. Die PET bietet als molekulares bildgebendes Verfahren die M��glichkeit einzelne Stoffwechselvorg��nge des GABAergen Systems zu visualisieren und zu quantifizieren. Durch den Einsatz eines 18F-markierten Radioliganden an die GABA-Bindungsstelle k��nnten so die Rezeptorverf��gbarkeit des GABAA-Rezeptors gemessen und die Aussch��ttung des Neurotransmitters GABA quantifiziert werden.rn4-(2-Naphthylmethyl)-5-(piperidin-4-yl)isothiazolole und -isoxazolole stellen aufgrund ihrer hohen Affinit��t gegen��ber der GABA-Bindungsstelle und ihrer lipophilen Struktur vielversprechende Leitstrukturen f��r die Entwicklung eines PET-Tracers zur Visualisierung der GABA-Bindungsstelle dar. Daher wurden zun��chst 19F-substituierte Referenzverbindungen synthetisiert, um diese hinsichtlich ihrer Eignung als Radioligand in in vitro-Studien zu evaluieren. Dazu wurde Fluor direkt sowie ��ber eine Fluorethoxygruppe an Position 1 des Naphthalinrings eingef��hrt. Zus��tzlich wurde ein Fluorethylether eines Isothiazolols als Referenz-verbindung synthetisiert. In anschlie��enden Verdr��ngungsstudien wurden die Affinit��ten der synthetisierten Verbindungen mit [3H]Muscimol an Membranpr��paraten aus Rattenhirnen, sowie transfizierten HEK293-Zellen bestimmt. Zus��tzlich wurden die entsprechenden Log D-Werte bestimmt. Die Verbindung 5-(piperidin-4-yl)-4-(1-fluornaphth-2-ylmethyl)-isothiazol-3-ol VK5 zeigte in den in vitro-Studien die vielversprechendsten Ergebnisse (IC50 = 10 nM; Log D = 1,7) und wurde im Folgenden in einer dreistufigen Radiosynthese als 18F-Verbindung synthetisiert.rnZu diesem Zweck wurde ein geeigneter Markierungsvorl��ufer dargestellt und ��ber eine n.c.a. SNAr-Markierung mit [18F]F- umgesetzt. Die Reaktionsparameter wurden hinsichtlich Reaktionszeit, -temperatur, Basenkonzentration und L��sungsmittel optimiert. Die zur Aktivierung einer SNAr ein-gef��hrte Carbonylfunktion wurde in einem zweiten Schritt mit Triethylsilan/Trifluoressigs��ure reduziert. Im finalen Schritt wurden zwei Schutzgruppen mit Bortrichlorid in DCM abgespaltet und [18F]VK5 als injektionsfertige L��sung in isotoner NaCl-L��sung erhalten. Es wurden radiochemische Ausbeuten von 0,7-1 % (EOS) nach einer durchschnittlichen Synthesedauer von 275 Minuten erhalten.rnDer Radioligand [18F]VK5 wurde anschlie��end in Autoradiographie-Versuchen an Hirnschnitten der Ratte hinsichtlich seiner Spezifit��t f��r die GABA-Bindungsstelle untersucht. Die unspezifische Bindung wurde durch die Zugabe von GABA bestimmt wonach kein signifikanter Unterschied festgestellt werden konnte. Die hohe unspezifische Bindung kann m��glicherweise auf die niedrigen spezifischen Aktivit��ten zur��ckgef��hrt werden. Diese lagen, bedingt durch die drei Schritte der Radiosynthese, in einem Bereich von 0,1-0,6 GBq/��mol. Die erhaltenen Ergebnisse lassen f��r zuk��nftige Versuche noch einige Optimierungsm��glichkeiten offen. Aufgrund der bisher erhaltenen Daten l��sst sich daher keine definitive Aussage ��ber die Eignung des Liganden [18F]VK5 als PET-Tracer treffen.rn

Entwicklung und Anwendung massenspektrometrischer Methoden zur Spurenanalytik iodhaltiger Verbindungen und aliphatischer Amine in der marinen Umwelt

In der marinen Grenzschicht beeinflussen reaktive Iodspezies wie z.B. I2 sowie aliphatische Amine eine Vielzahl atmosph��rischer Prozesse, vor allem bei der Partikelneubildung spielen sie eine entscheidende Rolle. Allerdings stellt die Quantifizierung dieser Verbindungen im Spurenbereich immer noch eine gro��e analytische Herausforderung dar. rnAus diesem Grund wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit das GTRAP-AMS (Gaseous compound trapping in artificially generated particles ��� aerosol mass spectrometry) entwickelt, um gasf��rmiges I2 und aliphatische Amine zu bestimmen. Hierbei wird ein Flugzeit-Aerosolmassenspektrometer (ToF-AMS), das urspr��nglich f��r die on-line Charakterisierung von Aerosolen entwickelt wurde, mit einer GTRAP-Einheit gekoppelt. Im Fall von I2 werden mit Hilfe eines pneumatischen Zerst��ubers a-Cyclodextrin/NH4Br-Partikel erzeugt, die mit dem gasf��rmigen I2 innerhalb der GTRAP-Einheit eine Einschlussverbindung bilden und dieses dadurch selektiv in die Partikelphase aufnehmen. F��r die on-line Bestimmung gasf��rmiger aliphatischer Amine dagegen wurde Phosphors��ure als partikul��rer Reaktionspartner eingesetzt. Nach Optimierung des GTRAP-AMS Systems wurde sowohl f��r I2 als auch f��r die aliphatischen Amine eine Nachweisgrenze im sub-ppb-Bereich f��r eine Zeitaufl��sung zwischen 1 und 30 min erhalten. Als erstes wurde das GTRAP-AMS System zur Charakterisierung von Permanentdenudern eingesetzt, um deren I2-Aufnahmef��higkeit und Wiederverwendbarkeit im Vergleich zu den herk��mmlichen einmal verwendbaren a-Cyclodextrin Denudern zu testen.rnIm Anschluss daran wurde das GTRAP-AMS f��r die Bestimmung zeitlich aufgel��ster I2- Emissionsraten ausgew��hlter Makroalgen unter dem Einfluss von Ozon eingesetzt. Die Kenntnis der Emissionsraten iodhaltiger Verbindungen der wichtigsten weltweit vorkommenden Makroalgen ist f��r die Modellierung der Iodchemie in der marinen Grenzschicht von besonderer Bedeutung. Die Resultate zeigen, dass verschiedene Makroalgen sowohl unterschiedliche zeitlich aufgel��ste I2-Emissionsprofile als auch Gesamtemissionsraten liefern. Im Vergleich zu den iodorganischen Verbindungen ist die Gesamtemissionsrate an I2 allerdings eine bis zwei Gr����enordnungen gr����er. Dies und die deutlich k��rzere atmosph��rische Lebensdauer von I2 im Vergleich zu den iodorganischen Verbindungen f��hren dazu, dass I2 die dominierende iodhaltige Verbindung f��r die Bildung reaktiver Iodatome in der marinen Grenzschicht ist. rnDa ��ber dem tropischen Atlantischen Ozean bislang jedoch nur ein geringer Anteil der IO-Konzentration durch die Oxidation von iodorganischen Verbindungen erkl��rt werden kann, wurden weitere Quellen f��r I2 erforscht. Deshalb wurden Kammerexperimente mit Mikrolagen durchgef��hrt, um deren Einfluss auf die I2-Freisetzung in die Atmosph��re zu untersuchen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von Mikroalgen (z.B. Coscinodiscus Wailesii) im Meerwasser zu einer erh��hten Freisetzung von I2 aus dem Meerwasser in die Atmosph��re f��hren kann. rnDes Weiteren wurden auch Versuche zu abiotischen Bildungswegen von I2 durchgef��hrt. Die Ergebnisse der Atmosph��rensimulationsexperimente haben gezeigt, dass partikul��re Iodoxide durch organische Verbindungen zu I2 reduziert werden k��nnen, welches im Anschluss von der Partikelphase in die Gasphase ��bergehen kann und dort wieder f��r Gasphasenprozesse zur Verf��gung steht.rn

Modifizierungen des Enzyms Silicatein alpha zur direkten Immobilisierung auf verschiedenen Oberfl��chen : neuartige Herstellung von Kompositmaterialien unter physiologischen Bedingungen

Das Silicatein �� ist ein 24 kDa gro��es Enzym, welches im Schwamm Suberites domuncula f��r die Synthese von Biosilikat verantwortlich ist. Vorhergehende Studien haben gezeigt, dass Silicatein auch die Synthese anderer Metalloxide wie Titandioxid, Galliumoxid und Zirkoniumdioxid katalysieren kann. Diese F��higkeiten machen das Silicatein �� f��r biomedizinische und biotechnologische Anwendungen interessant, da die Synthese unter nahezu physiologischen Bedingungen ablaufen kann, was die Herstellung neuartiger Kompositmaterialien mit einzigartigen Eigenschaften erleichtern w��rde. Zur Immobilisierung des Silicatein �� auf verschiedenen Oberfl��chen wurde bislang ein Nickel-NTA-Kopolymer eingesetzt. Diese Art der Immobilisierung bietet eine Reihe von M��glichkeiten in der Nanobiotechnologie, st����t aber in der Biomedizin an ihre Grenzen, da sich nicht alle Oberfl��chen f��r ein solches Coating eignen. Zudem k��nnen die zur Aktivierung des Polymers n��tigen L��sungsmittel und die ��ber die Zeit freigesetzten Monomere aus dem Polymerger��st toxische oder mutagene Wirkung auf das umliegende Gewebe haben. Deshalb wurde das Silicatein �� in dieser Arbeit mit zwei Affinit��ts-Tags so modifiziert, dass es an verschiedene Oberfl��chen immobilisiert werden kann und dabei seine Aktivit��t beibeh��lt. Zuerst wurde das Silicatein mit einem Glu-tag am N-terminalen Ende modifiziert. Dadurch gelang die direkte Immobilisierung an Hydroxyapatit und die folgende, enzymkatalysierte Synthese von Biosilikat-Beschichtungen auf diesem Tr��ger. Die Eigenschaften eines solchen HA-Kompositmaterials k��nnen zum Beispiel zu einem verbesserten, schnelleren und stabileren Einwachsen von Knochenimplantaten f��hren, da Biosilikat die Reifung und Differenzierung von Osteoblasten beschleunigt. rnMit dem an Hydroxyapatit-Pl��ttchen immobilisierten Glu-tag-Silicatein wurde ein modifizierter Pull-down Assay etabliert, wodurch bekannte, aber auch bis dahin noch unbekannte Protein-Interaktionspartner identifiziert werden konnten. rnUm zu zeigen, dass der entwickelte Glu-tag an pr��formierte, calciumhaltige Oberfl��chen binden kann, wurden die Nadeln des Kalkschwammes Paraleucilla magna als Modellorganismus verwendet. Die Nadeln konnten durch das immobilisierte Silicatein mit einer Titandioxid-Schicht ��berzogen werden und unter Verwendung des Interaktionspartners Silintaphin-1 konnte diese Beschichtung noch verst��rkt werden. Solche CaCO3-Kompositmaterialien k��nnten sowohl in der Biomedizin als auch in der Biotechnologie zum Einsatz kommen. Neben den erw��hnten calciumhaltigen Materialien finden auch andere Stoffe wie TiO2-Nanodr��hte Verwendung in der Forschung. In weiterf��hrenden Experimenten konnte gezeigt werden, dass der entwickelte Glu-tag auch Affinit��t zu Titandioxid-Oberfl��chen vermittelt. Auch hier konnte durch das oberfl��chenimmobilisierte Enzym eine Biosilikatbeschichtung synthetisiert werden. rnMit der zweiten Modifikation - einem Cys-tag - konnte Silicatein direkt auf Goldoberfl��chen immobilisiert werden. Durch die Verwendung eines Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempels wurde das Cys-getaggte Silicatein in einem linienf��rmigen Muster auf das Gold ��bertragen und die Synthese von Titandioxid dort nachgewiesen.rnDie Experimente und Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass Silicatein �� durch einfache Modifikationen an verschiedene Oberfl��chen immobilisiert werden kann und dabei immer noch seine Aktivit��t beh��lt. rnHierdurch ergibt sich die M��glichkeit, unter Normalbedingungen verschiedenste Kompositmaterialien herzustellen.rn

Zur Rolle der Antigendosis in IgE-vermittelten Immunantworten und der allergischen Atemwegsentz��ndung

Die Verabreichung von hohen Antigendosen im Rahmen der allergenspezifischen Immuntherapie (SIT) resultiert in der Induktion einer allergenspezifischen Toleranz in sensibilisierten Patienten. Vorangegangene Studien der Klinischen Forschergruppe Allergie identifizierten CD4-CD8- doppelt-negative T-Zellen (dnTZ), welche nach wiederholter intraperitonealer Injektion von hohen Dosen (HD) des an das Adjuvans Aluminiumhydroxid adsorbierten Antigens Keyhole Limpet Hemocyanin in Ma��usen induziert wurden, als potente Suppressorzellen fu��r die IgE-Produktion. Ma��use, die hingegen mit niedrigen Dosen (LD) desselben Antigens behandelt wurden, entwickelten eine starke, persistierende IgE-Immunantwort. rnIm Fokus meiner Doktorarbeit stand die pha��notypische Charakterisierung der dnTZ aus HD-Ma��usen sowie die Aufkla��rung mo��glicher inhibitorischer Wirkmechanismen. In Erweiterung der bisherigen Arbeiten und in Anlehnung an die klinische Praxis bei der Durchfu��hrung der SIT habe ich bei meinen Untersuchungen die subkutane Injektion ohne Adjuvans als alternative Applikationsroute verwendet. In meinen Studien konnte ich durch die zusa��tzliche Verwendung des klinisch relevanten Allergens Ovalbumin die Allgemeingu��ltigkeit des Konzepts der antigendosisabha��ngigen Regulation der IgE- Produktion durch dnTZ verifizieren. Die Vakzinierung mit hohen Antigendosen verhinderte die Ausbildung einer IgE-Produktion in antigenspezifischer Weise. HD- Ma��use wiesen in vitro eine geringere Aktivierung von TH2-Zellen als LD-Ma��use auf. Im Mausmodell der allergischen Atemwegsentzu��ndung wiesen HD-Ma��use eine reduzierte Atemwegsreaktivita��t sowie eine geringere pulmonale TH2-Zytokin- produktion auf. rnIch konnte zudem tendenziell eine leicht erho��hte Anzahl von dnTZ in HD-Ma��usen messen. Die in HD-Ma��usen induzierten dnTZ habe ich durchflusszytometrisch charakterisiert, konnte jedoch keinen eindeutigen Marker fu��r suppressive dnTZ identifizieren. In einem adoptiven Transferexperiment war eine T-Zellpopulation von HD-Ma��usen aus der ����-T-Zell-Rezeptor-tragende T-Zellen depletiert worden waren, a��hnlich wie die Ausgangs-T-Zellpopulation in der Lage die IgE-Produktion in den Rezipienten zu inhibieren, was darauf schlie��en la��sst, dass die untersuchten regulatorischen dnTZ einen ����-T-Zell-Rezeptor exprimieren. rn

Vergleich der retinalen und dermalen mikrovaskul��ren endothelialen Funktion bei Gesunden, Insulinresistenten und Typ-2-Diabetikern

Die vorliegende klinische Studie hatte zum Ziel, die mikrovaskul��re Endothelfunktion retinaler und dermaler Gef����e von Insulinresistenten und Typ 2- Diabetikern ohne Zeichen einer diabetischen Retinopathie mit einer gesunden insulinsensitiven nicht-diabetischen Kontrollgruppe hinsichtlich fr��her morphologischer und funktioneller Ver��nderungen zu vergleichen.rnrnMethode:rnEs wurden 54 Patienten ohne Nachweis einer diabetischen Retinopathie eingeschlossen und in 3 Gruppen entsprechend ihren metabolischen Ergebnissen eingeteilt: 1.) Gruppe K (Kontrollgruppe) setzte sich aus gesunden, nicht-diabetischen, insulin-sensitiven rn(HOMA ��� 2) Probanden mit einem BMI ��� 28 kg/m2 zusammen; 2.) Gruppe IR bestand aus den nicht-diabetischen, insulin-resistenten (HOMAs > 2), ��bergewichtigen Patienten mit einem BMI > 28 kg/m2 und 3.) Gruppe DM war definiert als Patienten mit einem manifesten Typ 2-Diabetes mellitus.rnrnDie mikrovaskul��re Funktion der Retina wurde mittels eines Laserdoppler-Verfahrens (Heidelberg Retina Flowmeter) untersucht und hierbei der retinale Blutfluss und das Verh��ltnis der Gef����wand zum Lumen (WLR, wall-to-lumen-ratio) basal und nach Flickerlicht-Stimulation (10 Hz, Photo Stimulator 750) gemessen. Letzterer gilt als Marker f��r vaskul��re Sch��digung. rnZus��tzlich wurde die dermale Mikrozirkulation (Blutfluss, O2-S��ttigung) als weiterer Faktor der mikrovaskul��ren Endothelfunktion in den 3 Studiengruppen untersucht und miteinander verglichen.rnErgebnisse:rnEs zeigte sich kein signifikanter Unterschied des retinalen Blutflusses zwischen den 3 Gruppen weder basal noch nach Flickerlicht-Stimulation. Es zeigte sich keine Korrelation zwischen der mikrovaskul��ren Funktion der Haut und der Retina. rnDie arterielle WLR zeigte nur geringe Unterscheide zwischen den 3 Gruppen.rnrnMit zunehmendem Grad der Insulinresistenz wurde jedoch eine Reduktion des basalen als auch des flickerlicht-stimulierten retinalen Blutflusses deutlich, dabei zeigte sich unerwarteter Weise eine Abnahme der WLR.rnrnDer (pr��-isch��mische) muskul��re Blutfluss war in der IR-Gruppe signifikant geringer als in der K-Gruppe. Auch war die postisch��mische dermale O2-S��ttigung in der DM und IR-Gruppe signifikant niedriger im Vergleich zur K-Gruppe. Jedoch war die postisch��mische hyper��mische dermale Reaktion in der IR und DM-Gruppe nur geringgradig weniger als in der K-Gruppe. rnrnSchlussfolgerung:rnEine Korrelation zwischen der Entwicklung der Insulinresistenz und retinaler sowie dermaler mikrovaskul��rer endothelialer Funktion wurde bei der Studie deutlich. Mithilfe des neuen Verfahrens der Laser Scanner Flowmeter zur Messung der retinalen Endothelfunktion lassen sich sehr fr��he morphologische Ver��nderungen des mikrovaskul��ren Blutflusses erfassen. rnDie fehlende Korrelation zwischen retinaler und dermaler mikrovaskul��rer Funktion als auch die geringen Unterschiede der WLR sollte Gegenstand weiterer Studien seinrn

Pr��klinische Evaluierung von therapeutischer Vakzinierung zur Effizienzsteigerung der adoptiven Immuntherapie von Cytomegalovirus-Erkrankungen

Klinische Manifestationen einer Cytomegalovirus (CMV)-Infektion gef��hrden den therapeutischen Erfolg der h��matopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT). Dabei stellt insbesondere die Reaktivierung von latentem CMV im HSCT-Rezipienten das h��ufigste Infektionsrisiko dar. Die Inzidenz der CMV-Erkrankung kann durch Rekonstitution adoptiv transferierter CMV-spezifischer CD8 T-Zellen im HSCT-Rezipienten reduziert werden. Das Modell der sogenannten adoptiven Immuntherapie wurde zun��chst im murinen Modell entwickelt und bereits in klinischen Studien best��tigt. Jedoch ist der adoptive Transfer (AT) aufgrund der nur limitiert zur Verf��gung stehenden therapeutisch effektiven Zellzahlen zurzeit in der klinischen Routine nicht einsetzbar.rnZiel dieser Arbeit war daher die pr��klinische Evaluierung einer Kombinationstherapie aus AT einer limitierten Anzahl CMV-spezifischer T-Zellen und deren in vivo Expansion durch therapeutische Vakzinierung nach HSCT. Zur Testung dieser Therapie wurde ein murines Modell auf der Grundlage von rekombinanten murinen CMV (mCMV) und rekombinanten HCMV Dense Bodies (DB) etabliert. Beide exprimieren das gut charakterisierte MHC-Klasse-I Kb-restringierte SIINFEKL-Peptid (OVA257-264) des Ovalbumins (OVA) bzw. die Funktions-verlustmutante SIINFEKA als Modellantigen. In den rekombinanten mCMV, mCMV-��m157Luc/m164-SIINFEKL/-A (mCMV-SIINFEKL/-A), wurde mittels orthotopen Peptid-austauschs das m164257-265 Peptid des gp36,5/m164 Proteins deletiert und durch das SIINFEKL- bzw. SIINFEKA-Peptid ersetzt. Anhand von Priming-Analysen konnte gezeigt werden, dass nach Infektion von C57BL/6 M��usen mit mCMV-SIINFEKL SIINFEKL-spezifische T-Zellen nachweisbar sind und das im CMV-Genom integrierte SIINFEKL funktional prozessiert und pr��sentiert wird. Parallel hierzu konnte nach Immunisierung mit DB-SIINFEKL in vivo ein SIINFEKL-spezifisches CD8 T-Zell-Priming induziert werden. In weiteren Experimenten konnte nach DB-SIINFEKL-Immunisierung im poplitealen Lymphknoten sowie in der Milz eine Proliferation von adoptiv transferierten CD8 T-Zellen beobachtet werden. Die anschlie��enden Challenge-Versuche zeigten, dass eine DB-SIINFEKL-Immunisierung epitopspezifisch vor einer hoch dosierten Challenge-Infektion mit mCMV-SIINFEKL sch��tzt. Im AT-Modell konnte gezeigt werden, dass adoptiv transferierte OT-I Zellen h��matoablativ behandelte Rezipienten epitopspezifisch vor einer mCMV-SIINFEKL-Infektion sch��tzen k��nnen, wobei der erzielte Schutz durch zus��tzliche Vakzinierung mit DB-SIINFEKL deutlich verbessert werden konnte. Im Anschluss konnte im HSCT-Rezipienten erstmals eine durch zus��tzliche Vakzinierung signifikante Verbesserung des protektiven Potenzials adoptiv transferierter OT-I Zellen best��tigt werden. Diese Verst��rkung der Protektion erm��glicht die Reduktion der Anzahl der f��r den Schutz ben��tigten Zellzahl und erh��ht damit die Effizienz der adoptiven Immuntherapie.

Charakterisierung einer pflanzlichen Variante des Cytoskelettproteins gamma-Tubulin durch Strukturmodellierung, ��berexpression und Analyse der Interaktionspartner

Wie alle Eukaryoten besitzen auch h��here Pflanzen ein mikrotubul��res Cytoskelett. Einige Funktionen dieses Cytoskeletts sind relativ stark konserviert, andere dagegen scheinen sehr pflanzenspezifisch zu sein. Dies betrifft insbesondere charakteristische mikrotubul��re Netzwerke, die bei der Neubildung und der Verst��rkung der Zellw��nde wichtige Rollen ��bernehmen. Wie der Aufbau dieser Netzwerke kontrolliert wird, ist bisher relativ unklar. Typische Mikrotubuli organisierende Zentren (MTOC), insbesondere Centrosomen oder Spindelpolk��rper, sind bei h��heren P���anzen nicht beobachtet worden. Von pilzlichen und tierischen Organismen wei�� man, dass gamma-Tubulin (gTUB) mit seinen assoziierten Proteinen in den MTOC bei der Nukleation von Mikrotubuli eine Schl��sselfunktion hat. Dieses Mitglied der Tubulin-Superfamilie wird aber auch in P���anzen gefunden, dessen genaue Funktion bisher unbekannt ist. Zu Beginn der Arbeit wurden mittels in silico Berechnungen Strukturmodelle des p���anzlichen gTUBs aus Nicotiana tabacum erarbeitet, da die Struktur, die zu einem Verst��ndnis der p���anzlichen Wachstumsregulation beitragen k��nnte, bisher unbekannt ist. Auf Grundlage der bioinformatischen Daten konnte f��r weitere Studien eine notwendige gTUB-Deletionsmutante entwickelt werden. F��r R��ntgendi���raktionsstudien und gTUB-Interaktionspartneranalysen war die Verf��gbarkeit verh��ltnism����ig gro��er Proteinmengen notwendig. Die Expression der gTUB-Volll��ngensequenz in gel��ster und aktiver Form stellte einen immanent wichtigen Zwischenschritt dar. Das Escherichia coli T7/lacO-Expressionssystem lieferte, trotz vielversprechender Erfolge in der Vergangenheit, kein gel��stes rekombinantes gTUB. So wurden zwar verh��ltnism����ig hohe Expressionsraten erzielt, aber das rekombinante gTUB lag quantitativ als Inclusion bodies vor. Eine Variationen der Expressionsparameter sowie umfangreiche Versuche mittels verschiedenster Konstrukte sowie potentiell die L��slichkeit erh��henden Tags gTUB in gel��ster Form in E. coli zu exprimieren blieben erfolglos. Eine Denaturierung der Inclusion bodies und R��ckfaltung wurde aufgrund der wohl bei der Tubulinfaltung notwendigen komplexeren Chaperone sowie thermodynamischer ��berlegungen ausgeschlossen. Die h��her evolvierte Chaperonausstattung war ein Hauptgrund f��r die Verwendung der eukaryotischen Hefe-Expressionssysteme K. lactis und des S. cerevisiae-Stammes FGY217 zur gTUB-Expression. So konnten nach der Selektion nur transgene Hefe-Zellen dokumentiert werden, die die gTUB-Expressionskassette nachweislich an der vorgesehenen Zielposition in ihrem Genom integrierten, aber keine dokumentierbare Expression zeigten. Die wahrscheinlichste Begr��ndung hierf��r ist, dass ein erh��hter intrazellul��rer gTUB-Titer mit dem Zellwachstum und der Zellteilung dieser eukaryotischen Organismen interferierte und durch R��ckkopplungen die rekombinante gTUB-CDS aus N. tabacum ausgeschaltet wurde. Der Versuch einer transienten gTUB-��berexpression in di���erenzierten Blattgeweben h��herer P���anzen war eine logische Konsequenz aus den vorherigen Ergebnissen und lieferte, wenn auch nicht die f��r eine Proteinkristallisation notwendigen Mengen, gel��stes gTUB. Bestrebungen einer stabilen Transfektion von A. thaliana oder BY-2-Zellkulturen mit einer gTUB-CDS lieferten keine transgenen Organismen, was starke Interferenzen der rekombinanten gTUB-CDS in den Zellen vermuten lies. Transfektionsversuche mit nur GFP tragenden Konstrukten ergaben hingegen eine hohe Anzahl an transgenen Organismen, die auch verh��ltnism����ig starke Expressionsraten zeigten. Die erzielten Proteinmengen bei der transienten gTUB-��berexpression in N. benthamiana Blattgeweben, in Co-Expression mit dem Posttransriptional Gene Silencing-Suppressorprotein p19, waren f��r einen Pull-Down sowie eine massenspektroskopische Analyse der Interaktionspartner ausreichend und ergaben Befunde. Eine abschlie��ende Auswertung des erarbeiteten massenspektroskopischen Datensatzes wird jedoch erst dann m��glich sein, wenn das Tabak-Proteom vollst��ndig sequenziert ist. Die Erweiterung der bestehenden p���anzlichen Vergleichsdatenbanken um das bisher bekannte Tabak-Proteom vervielfachte die Anzahl der in dieser Studie identi���zierten gTUB-Interaktionspartner. Interaktionen mit dem TCP1-Chaperon untermauern die Hypothese der zur Faltung p���anzlichen gTUBs notwendigen Chaperone. Beobachtete gTUB-Degradationsmuster in Verbindung mit Interaktionen des 26S-Proteasoms deuten auf eine Gegenregulationen bei erh��htem gTUB-Titer auf Proteinebene hin. Da Blattgewebe selbst nur noch ��ber eine sehr geringe und inhomogene Teilungsaktivit��t verf��gen ist diese Regulation hoch spannend. Auch konnte durch Co-Expression des PTGS-Suppressorproteins p19 gezeigt werden, dass bei der gTUB-Expression eine Regulation auf RNA-Ebene erfolgt.

Autorenwerkzeuge f��r digitale, multimediale und interaktive Lernbausteine im Web 2.0

Die Forschungsarbeit siedelt sich im Dreieck der Erziehungswissenschaften, der Informatik und der Schulpraxis an und besitzt somit einen starken interdisziplin��ren Charakter. Aus Sicht der Erziehungswissenschaften handelt es sich um ein Forschungsprojekt aus den Bereichen E-Learning und Multimedia Learning und der Fragestellung nach geeigneten Informatiksystemen f��r die Herstellung und den Austausch von digitalen, multimedialen und interaktiven Lernbausteinen. Dazu wurden zun��chst methodisch-didaktische Vorteile digitaler Lerninhalte gegen��ber klassischen Medien wie Buch und Papier zusammengetragen und m��gliche Potentiale im Zusammenhang mit neuen Web2.0-Technologien aufgezeigt. Darauf aufbauend wurde f��r existierende Autorenwerkzeuge zur Herstellung digitaler Lernbausteine und bestehende Austauschplattformen analysiert, inwieweit diese bereits Web 2.0-Technologien unterst��tzen und nutzen. Aus Sicht der Informatik ergab sich aus der Analyse bestehender Systeme ein Anforderungspro���l f��r ein neues Autorenwerkzeug und eine neue Austauschplattform f��r digitale Lernbausteine. Das neue System wurde nach dem Ansatz des Design Science Research in einem iterativen Entwicklungsprozess in Form der Webapplikation LearningApps.org realisiert und stetig mit Lehrpersonen aus der Schulpraxis evaluiert. Bei der Entwicklung kamen aktuelle Web-Technologien zur Anwendung. Das Ergebnis der Forschungsarbeit ist ein produktives Informatiksystem, welches bereits von tausenden Nutzern in verschiedenen L��ndern sowohl in Schulen als auch in der Wirtschaft eingesetzt wird. In einer empirischen Studie konnte das mit der Systementwicklung angestrebte Ziel, die Herstellung und den Austausch von digitalen Lernbausteinen zu vereinfachen, best��tigt werden. Aus Sicht der Schulpraxis liefert LearningApps.org einen Beitrag zur Methodenvielfalt und zur Nutzung von ICT im Unterricht. Die Ausrichtung des Werkzeugs auf mobile Endger��te und 1:1-Computing entspricht dem allgemeinen Trend im Bildungswesen. Durch die Verkn��pfung des Werkzeugs mit aktuellen Software Entwicklungen zur Herstellung von digitalen Schulb��chern werden auch Lehrmittelverlage als Zielgruppe angesprochen.

Medeae Medea forem! : zur Euripidesrezeption Ovids in den Heroides

In den Briefen 4, 6, 11 und 12 der Heroides hat Ovid direkt oder indirekt Figuren des Mythos zum Gegenstand seiner Dichtung gemacht, die den zeitgen��ssischen wie auch den heutigen Rezipienten insbesondere durch Trag��dien des Euripides bekannt sind. Die zu Beginn dieser Arbeit dazu durchgef��hrte historische Analyse der grunds��tzlichen Bedingungen der Rezeption der Trag��dien des Euripides in der Zeit Ovids zeigt, dass der r��mische Dichter f��r ein intertextuelles Dichten in den Heroides die Werke des griechischen Tragikers als Pr��texte nutzen konnte, da die Rezipienten ��ber die theoretische und praktische Kompetenz verf��gten, entsprechende Verweisungen zu identifizieren, diese in einem Prozess der intertextuellen Lekt��re zu dekodieren und den Text auf diese Weise zu interpretieren. Eine Beschreibung dieses antiken literarischen Kommunikationsprozesses zwischen Ovid und seinen Rezipienten erfolgt dabei mit den Mitteln einer f��r die Euripidesrezeption Ovids konkretisierten Intertextualit��tstheorie (Kapitel A.I und II). Die ausf��hrlichen Interpretationen zu den Heroides-Briefen 12, 6, 4 und 11 sowie zur Rezeption des Medea-Prologs in verschiedenen Gedichten Ovids (Kapitel B.I bis V) zeigen, dass der r��mische Dichter verschiedene Formen intertextueller Verweisungen nutzt, um in den bekannten Geschichten von Medea, Hypsipyle, Phaedra und Canace bislang ungenutztes narratives Potential zu entdecken und auf dieser Grundlage eine alte Geschichte neu zu erz��hlen. Das in der Forschung bereits vielfach beschriebene Prinzip Ovids des idem aliter referre ist in den untersuchten Texten konkret darauf ausgerichtet, die aus den Trag��dien bekannten Heroinen in einer bestimmten Phase ihrer Geschichte zu Figuren einer elegischen Welt werden zu lassen. Diese neu geschaffene elegische Dimension einer urspr��nglich tragischen Geschichte dient dabei nicht einer umwertenden Neuinterpretation der bekannten tragischen Figur. Vielmehr l��sst Ovid seine Briefe zu einem Teil des Mythos werden, zu einem elegischen Vorspiel der Trag��die, die einen durch Euripides vorgegebenen Rahmen des Mythos erweitern und damit zugleich zentrale Motive der tragischen Pr��texte vorbereiten. Ovid gestaltet aus, was in dem von Euripides initiierten Mythos angelegt ist, und nutzt das elegische Potential der tragischen Erz��hlung, um das Geschehen und vor allem die Heroine selbst in seinem Brief zur Trag��die hinzuf��hren. Damit bereitet Ovid in den Heroides die weitere Entwicklung der ��u��eren tragischen Handlung vor, indem er vor allem eine innere Entwicklung der von ihm geschaffenen Briefschreiberin aufzeigt und auf diese Weise jeweils aus einer von ihm geschaffenen elegischen Frau jene tragische Heldin werden l��sst, die den Rezipienten aus der jeweiligen Trag��die des Euripides bekannt ist. Die sich daraus notwendigerweise ergebenden Spannungen und Interferenzen zwischen den Erwartungen der Rezipienten und der Realit��t der von Ovid neu gestalteten Figur in ihrem elegischen Kontext werden von dem r��mischen Dichter produktiv genutzt und durch die im Text initiierte Entwicklung aufgehoben. So scheinen dann letztlich aus den Elegien Ovids die Trag��dien des Euripides hervorzugehen.

Untersuchungen zur Wechselbeziehung zwischen Proteom, Energiestoffwechsel, Redoxstatus und Radiosensibilit��t von Tumorzellen in vitro und in vivo

Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war die Erforschung urs��chlicher Unterschiede im Energiestoffwechsel von hoch- und niedrig-glykolytischen Tumorzelllinien. Dar��ber hinaus wurde die Hypothese ��berpr��ft, wonach eine hohe glykolytische Aktivit��t in Tumorzellen zu einer Anreicherung von antioxidativen Metaboliten f��hrt und infolgedessen eine Therapieresistenz gegen Gammabestrahlung hervorruft. Abschlie��end sollte durch biochemische und gentechnische Manipulationen des Energie- bzw. Glukosestoffwechsels die Strahlenresistenz von Tumorzellen ver��ndert und somit neue therapeutische Interventionen er��ffnet werden.rnDie zur Kl��rung dieser Fragestellung erforderlichen molekularbiologischen Experimente erfolgten an jeweils zwei Ovarialkarzinomzelllinien (OC316 und IGROV-1) und zwei Plattenepithelkarzinomzelllinien der Kopf- und Halsregion (SAS und FaDu) sowie den entsprechenden Experimentaltumoren.rnUnabh��ngig von der Tumorentit��t und dem Tumormodell konnte gezeigt werden, dass eine erh��hte Expression Stoffwechsel-assoziierter Proteine mit einem gesteigerten Energiestoffwechsel einhergeht. Der Transfer der Ovarial- und Plattenepithelkarzinomzelllinien in das Mausmodell f��hrte zu keiner grunds��tzlichen ��nderung des Tumormikromilieus. So wies die hoch-metabolische Linie OC316 in vitro und in vivo eine stark erh��hte MCT-4 Expression auf, deren gentechnische Inhibition jedoch zu keiner Reduktion der Glykolyserate f��hrte.rnDie Hypothese, dass die Laktatproduktion als pr��diktiver Marker f��r die Strahlenresistenz einer Tumorzelllinie fungiert, konnte nicht best��tigt werden. Jedoch f��hrte die Manipulation der intrazellul��ren Laktatbildung und des Energiestoffwechsels mit nicht zelltoxischen Konzentrationen von 2-Deoxy-D-glukose (2DG) und Rotenon (ROT) bei den Ovarialkarzinomzelllinien zu einer Erh��hung der intrazellul��ren O2--Anionen, einer Zunahme der Strahlenempfindlichkeit sowie zur Steigerung der initialen und residualen DNA-Doppelstrangbr��che nach Gammabestrahlung.rnHierbei wirken 2DG und ROT synergistisch durch die Inhibierung antioxidativer Systeme sowie durch die Erh��hung des zellul��ren Radikal-Status. Die Anwendung von Stoffwechselmanipulatoren zur Optimierung und Unterst��tzung vorhandener Radikal-erzeugender Therapieformen wird aktuell in klinischen Studien ��berpr��ft. Translational k��nnte die durch 2DG und ROT beschriebene Erh��hung der Strahlenempfindlichkeit bei Ovarialkarzinomzelllinien z. B. in Kombination mit intensit��tsmodulierten Strahlentherapien neue Behandlungsm��glichkeiten er��ffnen, was in weiterf��hrenden in vivo Studien zu ��berpr��fen ist.rn

Entwicklung und Anwendung eines Verfahrens zur Bestimmung von halogenierten Kohlenwasserstoffen in Luft mittels anreichernder Probenahme,Thermodesorption und GC,MS mit negativer chemischer Ionisation

Fl��chtige organische Halogenverbindungen ��bernehmen in der Chemie der Troposph��re eine Schl��sselrolle. Photolytisch gebildete Halogenatome reagieren mit troposph��rischem Ozon und k��nnen durch Oxidation, vor allem von Iod, zur Neubildung von Partikeln beitragen. Auf diese Weise beeinflussen Halogenalkane den Strahlungshaushalt der Atmosph��re. Aus analytischem Blickwinkel ist es wichtig die Konzentration der einzelnen Spezies zu untersuchen um R��ckschl��sse auf deren biotische oder abiotische Quellen ziehen und die Emissionswege besser verstehen zu k��nnen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher eine sensitive Methode zur Untersuchung von halogenierten Kohlenwasserstoffen entwickelt, basierend auf anreichernder Probenahme mit anschlie��ender Thermodesorption und der Analyse mittels Massenspektrometrie mit negativer chemischer Ionisation. Die Kennwerte der Methode sind: Nachweisgrenzen zwischen 0.11 pg und 5.86 pg bzw. zwischen 1.0 ppqV und 44.7 ppqV, Linearit��t zwischen R2=0.993 und R2=1.000, Reproduzierbarkeit (Triplikate) RSD < 15 % und ein sicheres Probenahmevolumen von 10 L. Die Methode wurde im Anschluss im Rahmen von zwei Feldmessungen, in Mace Head, Irland und auf einer Schiffskampagne im antarktischen Amundsen-Meer, angewendet. Durch die Ergebnisse aus Irland kann gezeigt werden, dass die Mischungsverh��ltnisse der Iodalkane mit denen fr��herer Studien vergleichbar sind, und dass die verschiedenen untersuchten Algenarten deutlich unterschiedliche Emissionsraten zeigen. Die Ergebnisse der Kampagne im Amundsen-Meer zeigen einen gro��en Einfluss der Windrichtung auf die Halogenalkan-Konzentrationen. So sind die Mischungsverh��ltnisse der Halogenalkane deutlich h��her, wenn der Wind zuvor ��ber die antarktischen Eisfl��chen str��mt. F��r die biotischen Quellen wurden die Emissionsraten ausgew��hlter Makroalgen unter dem Einfluss von Ozon untersucht. Die Emissionsrate der Iodalkane zeigt einen exponentiellen Zusammenhang, sowohl zur I2-Emission als auch zum Gesamtiodgehalt der Algen. Unter oxidativen Bedingungen zeigt L. Digitata eine linear steigende Iodalkanemission. Mit diesem Verhalten wird die These der Bildung von Iodalkanen als Nebenprodukt beim Abbau reaktiver Sauerstoffspezies unterst��tzt. Neben den Makroalgen wurden auch Mikroalgen als biotische Quellen untersucht. Hierbei k��nnen zwei unterschiedliche Emissionsmuster der Halogenalkane f��r Diatomeen und Phaeocystis sp. gezeigt werden. Im Gegensatz zur Iodalkan-Emission h��ngt die I2 Emission der Mikroalgenproben von der Ozonkonzentration der Luft ab. Durch die lineare Korrelation der I2-Emission mit der Iodid-Konzentration der w��ssrigen Phase einerseits, und dem Ozonverbrauch andererseits, kann die Bildung von I2 durch Oxidation von Iodid durch Ozon best��tigt werden. F��r das Emissionsverhalten der Mikroalgenprobe aus dem Sylter Wattenmeer, welche keine Korrelation mit dem verbrauchten Ozon zeigt, gibt es zwei Erkl��rungen: Zum einen kann I2 durch den hohen Gehalt an organischen Verbindungen an diesen adsorbiert bzw. chemisch gebunden werden und wird dann nicht mehr in die Gasphase emittiert. Zum anderen k��nnen aktive organische Verbindungen das Gleichgewicht zwischen HOI und I2 in Richtung HOI verlagern. Im Versuch zur abiotischen Bildung von Iodalkanen aus Partikeln, bestehend aus I2O5 und verschiedenen Alkoholen, kann gezeigt werden, dass die Bildung von Iodmethan und Diiodmethan abl��uft, dass jedoch die Emission bis zu zwei Gr����enordnungen kleiner ist als die von I2. Somit tr��gt die Bildung von Iodalkanen nur in einem sehr eingeschr��nkten Rahmen zum Recycling des Iods in der Atmosph��re bei. Der vorgestellte abiotische Bildungsweg h��ngt sowohl vom pH-Wert als auch vom Mischungsverh��ltnis im Partikel ab.

Etablierung eines humanisierten Mausmodells zur In-vivo-Analyse von DC-adressierenden Nanopartikeln

In dieser Arbeit wurde zun��chst ein humanisiertes Mausmodell entwickelt f��r die Analyse von humanen DCs in vivo. Dar��ber hinaus wurden erste Versuche mit Nanopartikelbeladenen DCs durchgef��hrt, mit der Intention, durch diese Kombination humane DCs zu untersuchen. Es wurden immunsupprimierte NOD/LtSz-scid IL2R (NSG) M��use verwendet und mit humanen CD34+ PBSCs transplantiert. Es wurden insgesamt 14 Modelle getestet, mit einer durchschnittlichen Humanisierungsrate von 76 %. In allen Modellen konnten ab Woche sechs nach Transplantation humane CD45+ Zellen sowie humane Bund NK-Zellen und CD14+ Monozyten gefunden werden. Dar��ber hinaus waren myeloide DC-Vorl��uferzellen, konventionelle HLA DR CD11c DCs (cDCs) und plasmazytoide DCs (pDCs) vorhanden. Humane T-Zellen konnten nicht vor Woche 18 nach Transplantation beobachtet werden. Neben der Rekonstitution humaner DCs in peripheren Organen, wurde ebenfalls nach gewebsst��ndigen DCs, insbesondere den Langerhans Zellen (LCs) der Epidermis geschaut. Waren humane LC vorhanden, konnten diese ab Woche zw��lf nach Transplantation in der murinen Epidermis detektiert werden. Diese waren konstant bis in Woche 30 nach Transplantation nachweisbar. In Hinblick auf die Etablierung der DCs in diesem humanisierten Mausmodells wurden verschiedene Einflussgr����en getestet. IL-7 f��hrte zu keiner ver��nderten H��matopoese, wohingegen Flt3L zu einer Zunahme von CD14+ Monozyten und cDCs f��hrte. Dar��ber hinaus konnte eine drastische Abnahmernhumaner B-Zellen beobachtet werden. Es zeigte sich, dass der Zeitpunkt der Flt3LrnApplikation einen entscheidenen Faktor f��r den Effekt von Flt3L auf die Rekonstitution humaner Zellen darstellt. F��r die in dieser Arbeit durchgef��hrten funktionellen in vivo Studien, wurden humanisierten M��usen alloreaktive CD8+ T-Zellen appliziert. Somit sollte die Funktionalit��t der rekonstituierten humanen APCs getestet werden. Es wurde deutlich, dass Monozyten und DCs ihre Funktionalit��t erst ab Woche 14 nach Transplantation zu entwickeln schienen,rnwohingegen B-Zellen bereits zu fr��heren Zeitpunkten als Zielzellen f��r die alloreaktiven T-Zellen dienten. Dies wurde durch den R��ckgang der jeweiligen Zellen nach Applikation der T-Zellen sichtbar. Zu erw��hnen ist, dass das Anwachsen einer humanen H��matopoese stark spenderabh��ngig ist und somit keine allgemeing��ltigen Aussagen hinsichtlich der in vivo Funktion getroffen werden k��nnen. Um im Gewebe verbliebende APCs zu manipulieren gibt es verschiedene M��glichkeiten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf Polystyren-basierende Nanopartikel getestet. Die verwendeten Partikel hatten eine Gr����e von 80 bis 160 nm und waren unfunktionalisiert oder mit Amino- bzw. Carboxy-Gruppen versehen. Zus��tzlich wurden die Partikel mit BODIPY (Durchflusszytometrie und kLSM-Messungen), einem Infrarotnahem Farbstoff IR 780 (BFI-Messungen) und Platin (in vivo Messungen) beladen. Der Carboxy-funktionalisierte Partikel zeigte den geringsten Einfluss auf die Vitalit��t von humanen DCs, wohingegen der Amino-funktionalisierte Partikel bei steigender Konzentration toxisch wirkte. Bei unfunktionalisierten Partikeln stieg die Toxizit��t bei zunehmender Konzentration. Hinsichtlich der Expression diverser DC spezifischer Oberfl��chenmolek��le nach Beladung mit Nanopartikeln zeigte sich, dass allein der unfunktionalisierte, mit Lutensol AT50 hergestellte Partikel zu einer leichten Hochregulation von MHC-Klasse-II Molek��len f��hrte. Die Expression von CD86 wurde im Gegenzug nur durch die Beladung mit den Amino-, bzw. Carboxy funktionalisierten Partikeln und dem unfunktionalisierten, mit SDS hergestellten Partikel leicht gesteigert. Trotz der teilweise leicht ver��nderten Expression von Oberfl��chenmarkern, konnte mit Hilfe von IFN-g ELISpots keine Beeinflussungrnder Funktion als APCs von Nanopartikel-beladenen DCs beobachtet werden. In den in vivo Untersuchungen zeigten alle vier Partikel eine konstante Zirkulation imrnOrganismus und konnten bis 96 h nach Applikation nachgewiesen werden. Alle Partikel konnten prim��r in der Leber detektiert werden, wobei der unfunktionalisierte, mit Lutensol AT50 hergestelle Partikel das weiteste Verbreitungsmuster zeigte. Erste Versuche im humanisierten Mausmodell zeigten keine Beeinflussung der Verteilung und Kinetik von Nanopartikeln durch die humane H��matopoese. Mit dem in dieser Arbeit etablierten humanisierten Mausmodell ist es m��glich, die Entwicklung, Differenzierung, Aktivierung und Funktionalit��t humaner DCs in vivo zu untersuchen. Dar��ber hinaus kann das gezielte Adressieren von DCs in vivo analysiert werden, was sowohl die M��glichkeit der Manipulation von DCs zur Vermeidung einer akuten GvHD bietet als auch Verwendung in anderen DC-vermittelten Therapien (z.B.Vakzinationsstudien) findet.

Towards antibody-mediated targeting of dendritic cells for cancer immunotherapy with multivalent polymer-antigen conjugates

Der Fokus dieser Arbeit lag auf der definierten Synthese multifunktioneller Polymer-Konjugate zur Anwendung in der Krebs-Immunotherapie. Durch gezielte Variation der Kon-jugationsbedingungen wurde Zusammensetzung, Gr����e und Aggregationsverhalten in Zell-medium sowie in humanem Serum untersucht. Nach definierter physikalisch-chemischer Charakterisierung wurde dann die induzierte Antigen-Pr��sentation zur Aktivierung der T-Zellproliferation analysiert.rnDaf��r wurden zwei verschiedene polymere Carrier-Systeme gew��hlt, lineares Poly-L-lysin und eine Polylysinb��rste (PLL-B��rste). Es wird vermutet, dass die PLL-B��rste aufgrund der anisotropen Form eine bessere Verteilung im K��rper und eine verl��ngerte Zirkulationsdauer zeigen wird. Die zu konjugierenden biologisch aktiven Komponenten waren der antiDEC205-Antik��rper (aDEC205) f��r die gezielte Adressierung CD8-positiver dendritischer Zellen (DC), ein Ovalbumin (OVA)-spezifisches Antigen mit der Kernsequenz SIINFEKL f��r die Spezifit��t der Immunantwort gegen Krebszellen, die dieses Antigen tragen, und ein immunaktivieren-der TLR9-Ligand, CpG1826. Die Effizienz dieses Konjugates dendritische Zellen zu aktivieren, welche wiederum eine Immunantwort gegen OVA-exprimierende Krebszellen induzieren, wurde durch die Konjugation aller Komponenten am identischen Tr��germolek��l deutlich h��her erwartet.rnLineares Poly-L-lysin diente als Modellsystem um die Konjugationschemie zu etablieren und dann auf die zylindrische Polylysinb��rste zu ��bertragen. Anhand dieser polymeren Tr��ger wurde das Verhalten der verschiedenen Topologien des Kn��uels und der B��rste im Hinblick auf den Einfluss struktureller Unterschiede sowohl auf Konjugationsreaktionen als auch auf das in situ und in vitro Verhalten untersucht.rnFluoreszenzmarkiertes Antigen und der CpG Aktivator konnten jeweils aufgrund einer Thiol-Modifizierung an die Thiol-reaktive Maleimidgruppe des heterobifunktionellen Linkers Sulfo-SMCC an PLL-AlexaFluor48 konjugiert werden. Anschlie��end wurde aDEC205-AlexaFluor647 an PLL gekoppelt, entweder durch Schiff Base-Reaktion des oxidierten Antik��rpers mit PLL und anschlie��ender Reduzierung oder durch Click-Reaktion des PEG-Azids modifizierten An-tik��rpers mit Dicyclobenzylcyclooctin (DIBO)-funktionalisiertem PLL. Die Konjugation der biologisch aktiven Komponenten wurde mit Durchflusszytometrie (FACS) und konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) untersucht und die Zusammensetzung des Konjugatesrnmittels UV/Vis-Spektroskopie bestimmt. Die PLL-B��rste alleine zeigte eine hohe Zytotoxizit��t bei HeLa und JAWS II Zelllinien, wohingegen lineares PLL und PLL-Konjugate sowie die PLL B��rsten-Konjugate keine ausgepr��gte Zytotoxizit��t aufwiesen. Die Polymer-Konjugate wie-sen keine Aggregation in Zellmedium oder humanem Serum auf, was mittels winkelabh��ngi-ger dynamischer Lichtstreuung bestimmt wurde. CLSM Aufnahmen zeigten Kolokalisation der an die einzelnen Komponenten gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe in dendritischen Zel-len, was die erfolgreiche Konjugation und Internalisierung der Konjugate in die Zellen bele-gen konnte. FACS Messungen ergaben eine geringf��gig erh��hte Aufnahme des adressierten PLL-Antigen-Antik��rper-Konjugates verglichen mit dem PLL-Antigen-Konjugat. Experimente mit dem ���Specific Hybridization Internalization Sensor��� (SHIP) zeigten jedoch nur Aufnahme der PLL-Konjugate in CD8+ unreife DC, nicht in reife DC, die nicht mehr unspezifisch, sondern nur noch ��ber Rezeptoren internalisieren. Dies bewies die unspezifische Aufnahme des Kon-jugates, da Antik��rper-Konjugation keine Rezeptor-vermittelte Endozytose in reife DC indu-zieren konnte. T-Zell-Proliferationsassays ergaben eine Aktivierung von CD8+ T-Zellen indu-ziert durch Antigen-tragende Konjugate, wohingegen Konjugate ohne Antigen als Negativ-kontrollen dienten und keine T-Zell-Proliferation erzielten. Es konnte jedoch kein Unter-schied zwischen adressierten und nicht adressierten Konjugaten aufgrund der unspezifischen Aufnahme durch das Polymer beobachtet werden. L��sliches SIINFEKL alleine bewirkte schon bei geringeren Konzentrationen eine T-Zell-Proliferation.rnEs war somit m��glich, drei biologischen Komponenten an einen polymeren Tr��ger zu konju-gieren und diese Konjugate im Hinblick auf Zusammensetzung, Gr����e, Internalisierung in dendritische Zellen und Aktivierung der T-Zell-Proliferation zu untersuchen. Au��erdem wur-de die Konjugationschemie erfolgreich von dem Modellsystem des linearen PLL auf die PLL-B��rste ��bertragen. Die Polymer-Konjugate werde unspezifisch in DC aufgenommen und in-duzieren T-Zellproliferation, die mit Antigen-Pr��sentationsassays nachgewiesen wird. Es konnte jedoch durch Konjugation des Antik��rpers keine Rezeptor-vermittelte Aufnahme in CD8+ DC erzielt werden.rnDiese Studien stellen einen erfolgsversprechenden ersten Schritt zur Entwicklung neuer Na-nomaterialien f��r die Anwendung in Krebs-Immuntherapie dar.

Entwicklung koh��renter Lichtquellen im XUV-Regime

Plasmabasierte R��ntgenlaser sind aufgrund ihrer kurzen Wellenl��nge und schma-rnlen spektralen Bandbreite attraktive Diagnose-Instrumente in einer Vielzahl potentieller Anwendungen, beispielsweise in den Bereichen Spektroskopie, Mikroskopie und EUV-Lithogra���e. Dennoch sind R��ntgenlaser zum heutigen Stand noch nicht sehr weit verbreitet, was vorwiegend auf eine zu geringe Pulsenergie und f��r manche Anwendungen nicht hinreichende Strahlqualit��t zur��ckzuf��hren ist. In diesem Zusammenhang wurden in den letzten Jahren bedeutende Fortschritte erzielt. Die gleichzeitige Weiterentwicklung von Pumplasersystemen und Pumpmechanismen erm��glichte es, kompakte R��ntgenlaserquellen mit bis zu 100 Hz zu betreiben. Um gleichzeitig h��here Pulsenergien, h��here Strahlqualit��t und volle r��umliche Koh��renz zu erhalten, wurden intensive Studien theoretischer und experimenteller Natur durchgef��hrt. In diesem Kontext wurde in der vorliegenden Arbeit ein experimenteller Aufbau zur Kombination von zwei R��ntgenlaser-Targets entwickelt, die sogenannte Butter���y-Kon���guration. Der erste R��ntgenlaser wird dabei als sogenannter Seed f��r das zweite, als Verst��rker dienende R��ntgenlasermedium verwendet (injection-seeding). Aufrndiese Weise werden st��rende Effekte vermieden, welche beim Entstehungsprozessrndes R��ntgenlasers durch die Verst��rkung von spontaner Emission zustande kom-rnmen. Unter Verwendung des ebenfalls an der GSI entwickelten Double-Pulse Gra-rnzing Incidence Pumpschemas erm��glicht das hier vorgestellte Konzept, erstmaligrnbeide R��ntgenlasertargets ef���zient und inklusive Wanderwellenanregung zu pum-rnpen.rnBei einer ersten experimentellen Umsetzung gelang die Erzeugung verst��rkter Silber-R��ntgenlaserpulse von 1 ��J bei 13.9 nm Wellenl��nge. Anhand der gewonnenen Daten erfolgte neben dem Nachweis der Verst��rkung die Bestimmung der Lebensdauer der Besetzungsinversion zu 3 ps. In einem Nachfolgeexperiment wurden die Eigenschaften eines Molybd��n-R��ntgenlaserplasmas n��her untersucht. Neben dem bisher an der GSI angewandten Pumpschema kam in dieser Strahlzeit noch eine weitere Technik zum Einsatz, welche auf einem zus��tzlichen Pumppuls basierte. In beiden Schemata gelang neben dem Nachweis der Verst��rkung die zeitliche und r��umliche Charakterisierung des Verst��rkermediums. R��ntgenlaserpulse mit bis zu 240 nJ bei einer Wellenl��nge von 18.9 nm wurden nachgewiesen. Die erreichte Brillanz der verst��rkten Pulse lag ca. zwei Gr����enordnungen ��ber der des urspr��nglichen Seeds und mehr als eine Gr����enordnung ��ber der Brillanz eines R��ntgenlasers, dessen Erzeugung auf der Verwendung eines einzelnen Targets basierte. Das in dieser Arbeitrnentwickelte und experimentell veri���zierte Konzept birgt somit das Potential, extrem brillante plasmabasierte R��ntgenlaser mit vollst��ndiger r��umlicher und zeitlicher Koh��renz zu erzeugen.rnDie in dieser Arbeit diskutierten Ergebnisse sind ein wesentlicher Beitrag zu der Entwicklung eines R��ntgenlasers, der bei spektroskopischen Untersuchungen von hochgeladenen Schwerionen eingesetzt werden soll. Diese Experimente sind amrnExperimentierspeicherring der GSI und zuk��nftig auch am High-Energy StoragernRing der FAIR-Anlage vorgesehen.rn

Ancient Greek harbours used as geo-archives for palaeotsunami research : case studies from Krane (Cefalonia), Lechaion (Gulf of Corinth) and Kyllini (Peloponnese)

Since historical times, coastal areas throughout the eastern Mediterranean are exposed to tsunami hazard. For many decades the knowledge about palaeotsunamis was solely based on historical accounts. However, results from timeline analyses reveal different characteristics affecting the quality of the dataset (i.e. distribution of data, temporal thinning backward of events, local periodization phenomena) that emphasize the fragmentary character of the historical data. As an increasing number of geo-scientific studies give convincing examples of well dated tsunami signatures not reported in catalogues, the non-existing record is a major problem to palaeotsunami research. While the compilation of historical data allows a first approach in the identification of areas vulnerable to tsunamis, it must not be regarded as reliable for hazard assessment. Considering the increasing economic significance of coastal regions (e.g. for mass tourism) and the constantly growing coastal population, our knowledge on the local, regional and supraregional tsunami hazard along Mediterranean coasts has to be improved. For setting up a reliable tsunami risk assessment and developing risk mitigation strategies, it is of major importance (i) to identify areas under risk and (ii) to estimate the intensity and frequency of potential events. This approach is most promising when based on the analysis of palaeotsunami research seeking to detect areas of high palaeotsunami hazard, to calculate recurrence intervals and to document palaeotsunami destructiveness in terms of wave run-up, inundation and long-term coastal change. Within the past few years, geo-scientific studies on palaeotsunami events provided convincing evidence that throughout the Mediterranean ancient harbours were subject to strong tsunami-related disturbance or destruction. Constructed to protect ships from storm and wave activity, harbours provide especially sheltered and quiescent environments and thus turned out to be valuable geo-archives for tsunamigenic high-energy impacts on coastal areas. Directly exposed to the Hellenic Trench and extensive local fault systems, coastal areas in the Ionian Sea and the Gulf of Corinth hold a considerably high risk for tsunami events, respectively.Geo-scientific and geoarcheaological studies carried out in the environs of the ancient harbours of Krane (Cefalonia Island), Lechaion (Corinth, Gulf of Corinth) and Kyllini (western Peloponnese) comprised on-shore and near-shore vibracoring and subsequent sedimentological, geochemical and microfossil analyses of the recovered sediments. Geophysical methods like electrical resistivity tomography and ground penetrating radar were applied in order to detect subsurface structures and to verify stratigraphical patterns derived from vibracores over long distances. The overall geochronological framework of each study area is based on radiocarbon dating of biogenic material and age determination of diagnostic ceramic fragments. Results presented within this study provide distinct evidence of multiple palaeotsunami landfalls for the investigated areas. Tsunami signatures encountered in the environs of Krane, Lechaion and Kyllini include (i) coarse-grained allochthonous marine sediments intersecting silt-dominated quiescent harbour deposits and/or shallow marine environments, (ii) disturbed microfaunal assemblages and/or (iii) distinct geochemical fingerprints as well as (iv) geo-archaeological destruction layers and (v) extensive units of beachrock-type calcarenitic tsunamites. For Krane, geochronological data yielded termini ad or post quem (maximum ages) for tsunami event generations dated to 4150 �� 60 cal BC, ~ 3200 �� 110 cal BC, ~ 650 �� 110 cal BC, and ~ 930 �� 40 cal AD, respectively. Results for Lechaion suggest that the harbour was hit by strong tsunami impacts in the 8th-6th century BC, the 1st-2nd century AD and in the 6th century AD. At Kyllini, the harbour site was affected by tsunami impact in between the late 7th and early 4th cent. BC and between the 4th and 6th cent. AD. In case of Lechaion and Kyllini, the final destruction of the harbour facilities also seems to be related to the tsunami impact. Comparing the tsunami signals obtained for each study areas with geo-scientific data from palaeotsunami events from other sites indicates that the investigated harbour sites represent excellent geo-archives for supra-regional mega-tsunamis.