Expressions- und Funktionsanalysen von Neuroglobin und Cytoglobin

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden Untersuchungen zur Expression und Funktion der respiratorischen Proteine Neuroglobin (Ngb) und Cytoglobin (Cygb) in Vertebraten durchgeführt. Beide Globine wurden erst kürzlich entdeckt, und ihre Funktionen konnten trotz vorliegender Daten zur Struktur und biochemischen Eigenschaften dieser Proteine bisher nicht eindeutig geklärt werden. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurde die zelluläre und subzelluläre Lokalisation von Neuroglobin und Cytoglobin in murinen Gewebeschnitten untersucht. Die Expression von Ngb in neuronalen und endokrinen Geweben hängt offensichtlich mit den hohen metabolischen Aktivitäten dieser Organe zusammen. Insbesondere im Gehirn konnten regionale Unterschiede in der Ngb-Expression beobachtet werden. Dabei korrelierte eine besonders starke Neuroglobin-Expression mit Gehirnbereichen, die bekanntermaßen die höchsten Grundaktivitäten aufweisen. In Anbetracht dessen liegt die Funktion des Neuroglobins möglicherweise im basalen O2-Metabolismus dieser Gewebe, wobei Ngb als O2-Lieferant und kurzfristiger O2-Speicher den vergleichsweise hohen Sauerstoffbedarf vor Ort sicherstellen könnte. Weitere Funktionen in der Entgiftung von ROS bzw. RNS oder die kürzlich publizierte mögliche Rolle des Ngb bei der Verhinderung der Mitochondrien-vermittelten Apoptose durch eine Reduktion des freigesetzten Cytochrom c wären darüber hinaus denkbar. Die Cygb-Expression im Gehirn beschränkte sich auf relativ wenige Neurone in verschiedenen Gehirnbereichen und zeigte dort vorwiegend eine Co-Lokalisation mit der neuronalen NO-Synthase. Dieser Befund legt eine Funktion des Cytoglobins im NO-Metabolismus nahe. Quantitative RT-PCR-Experimente zur mRNA-Expression von Ngb und Cygb in alternden Säugern am Bsp. der Hamsterspezies Phodopus sungorus zeigten keine signifikanten Änderungen der mRNA-Mengen beider Globine in alten im Vergleich zu jungen Tieren. Dies widerspricht publizierten Daten, in denen bei der Maus anhand von Western Blot-Analysen eine Abnahme der Neuroglobin-Menge im Alter gezeigt wurde. Möglicherweise handelt es sich hierbei um speziesspezifische Differenzen. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte vergleichende Sequenzanalyse der humanen und murinen NGB/Ngb-Genregion liefert zum einen Hinweise auf die mögliche Regulation der Ngb-Expression und zum anderen eine wichtige Grundlage für die funktionellen Analysen dieses Gens. Es konnte ein minimaler Promotorbereich definiert werden, der zusammen mit einigen konservierten regulatorischen Elementen als Basis für experimentelle Untersuchungen der Promotoraktivität in Abhängigkeit von äußeren Einflüssen dienen wird. Bioinformatische Analysen führten zur Identifizierung des sog. „neuron restrictive silencer element“ (NRSE) im Ngb-Promotor, welches vermutlich für die vorwiegend neuronale Expression des Proteins verantwortlich ist. Die kontrovers diskutierte O2-abhängige Regulation der Ngb-Expression konnte hingegen anhand der durchgeführten komparativen Sequenzanalysen nicht bestätigt werden. Es wurden keine zwischen Mensch und Maus konservierten Bindestellen für den Transkriptionsfaktor HIF-1 identifiziert, der die Expression zahlreicher hypoxieregulierter Gene, z.B. Epo und VEGF, vermittelt. Zusammen mit den in vivo-Daten spricht dies eher gegen eine Regulation der Ngb-Expression bei verminderter Verfügbarkeit von Sauerstoff. Die Komplexität der Funktionen von Ngb und Cygb im O2-Stoffwechsel der Vertebraten macht den Einsatz muriner Modellsysteme unerlässlich, die eine sukzessive Aufklärung der Funktionen beider Proteine erlauben. Die vorliegende Arbeit liefert auch dazu einen wichtigen Beitrag. Die hergestellten „gene-targeting“-Vektorkonstrukte liefern in Verbindung mit den etablierten Nachweisverfahren zur Genotypisierung von embryonalen Stammzellen die Grundlage zur erfolgreichen Generierung von Ngb-knock out sowie Ngb- und Cygb-überexprimierenden transgenen Tieren. Diese werden für die endgültige Entschlüsselung funktionell relevanter Fragestellungen von enormer Bedeutung sein.

Einfluss von oxidativem Stress auf die DNA-Reparatur in Säugerzellen

Gegenstand dieser Arbeit war es, das Zusammenspiel zwischen DNA-Reparatur und zellulärem anitoxidativen Abwehrsystem in Melanomzellen und gesunden Hautfibroblasten näher zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die dominierenden DNA-Läsionen im Falle einer Bestrahlung mit sichtbarem Licht (400 – 800 nm) Fpg-sensitive Läsionen, zu denen die Basenmodifikation 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG) gehört, und im Falle der UVA-Bestrahlung Cyclobutan-Pyrimidindimere (CPDs) sind. Sowohl Melanomzellen als auch Hautfibroblasten waren problemlos in der Lage, die durch sichtbares Licht und UVA-Strahlung induzierten oxidativen DNA-Modifikationen zu reparieren. Jedoch reagierten Melanomzellen in einer adaptiven Antwort mit einer Erhöhung ihres Glutathion-Gehalts auf ein Maximum (nach circa 10 - 14 h) nach Bestrahlung mit sichtbarem Licht, wohingegen die Hautfibroblasten einen massiven Einbruch direkt nach Bestrahlung und eine extrem lange Erholungsphase über 48 h aufzuweisen hatten. Die darauffolgende Untersuchung der DNA-Reparaturkapazität der Zellen unter Bedingungen von oxidativem Stress mit vorangegangener Depletion intrazellulären Glutathions zeigten eine dramatische, nahezu vollständige Hemmung der Reparatur durch UVA- bzw. Sonnenlicht-induzierter Fpg-sensitiver DNA-Modifikationen (8-oxoG) - sowohl in Melanomzellen als auch in Hautfibroblasten. Dieser Effekt ließ sich durch den Zusatz von Dithiothreitol (DTT), nach erfolgter Bestrahlung der Glutathion-depletierten Zellen, wieder komplett revertieren. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass an der Reparatur ein redoxempfindliches Protein oder zellulärer Cofaktor beteiligt sein muß. Zudem konnte durch Untersuchungen der Nukleotidexzisionsreparatur (NER) und der Einzelstrangbruchreparatur nach dem gleichen Versuchsdesign gezeigt werden, dass es sich hierbei sehr wahrscheinlich um einen für die Basenexzisionsreparatur (BER) von 7,8-dihydro-8-oxo-guanine (8-oxoG) exklusiven Effekt handelte. Zwei der wichtigsten Reparaturproteine der BER, nämlich hOGG1 und APE1, wurden anschließend auf ihre Funktionsfähigkeit hin untersucht, da es naheliegend war, dass der Reparaturhemmung ein Funktionsverlust eines dieser beiden Enzyme zugrunde liegen könnte. Im Falle des APE1-Proteins konnte dies ausgeschlossen werden, da mit Hilfe der Alkalischen Elution die volle Funktionsfähigkeit für die Reparatur von AP-Läsionen nachgewiesen werden konnte. Interessanterweise zeigte aber das hOGG1-Protein eine zwischen der dritten und vierten Stunde nach Bestrahlung Glutathion-depletierter Zellen stark abfallende Aktivität der 8-oxoG-Glykosylasefunktion. Die Western-Blot-Analyse ergab allerdings keinen Hinweis auf eine Proteinoxidation von hOGG1. Möglicherweise wird nicht hOGG1 selbst, wohl aber ein anderes, für eine konzertierte Abfolge der einzelnen Reparaturschritte entscheidend notwendiges Protein innerhalb der Zelle durch ROS leicht oxidiert. In jedem Fall bleibt festzustellen, dass Glutathion eine wichtige Aufgabe hinsichtlich einer voll funktionsfähigen Basenexzisionreparatur zuzukommen scheint. Die Ergebnisse unterstreichen die mögliche Bedeutung von oxidativem Stress für die Entstehung von Krebs durch Sonnenlicht, insbesondere durch UVA, da die durch die Strahlung (und eventuell auftretende Entzündung) gebildeten ROS nicht nur DNA-Schäden induzieren, sondern auch ihre Reparatur verhindern können.

Regulation der Phorbolester-induzierten Matrix-Metalloproteinase-9-Expression in humanen Brustkrebszelllinien durch Stickstoffmonoxid

Das Hauptziel dieser Arbeit war die Identifizierung der Regulationsebenen auf denen die TPA-induzierte Matrix-Metalloproteinase-9 (MMP-9) durch das nitrose Gas Stickstoffmonoxid (NO) in MCF-7-Zellen verändert wird. Dabei konnte sowohl mit Hilfe der Zymographie als auch mit einem MMP-9-Aktivitäts-ELISA gezeigt werden, dass die extrazellulären MMP-9-Spiegel durch die Behandlung der Zellen mit NO reduziert werden. Gleichzeitig zeigte sich auch eine durch NO bedingte Abnahme der intrazellulären MMP-9-Spiegel, wie mit Hilfe von Western-Blot-Analyse nachgewiesen werden konnte. Experimente mit dem Proteasominhibitor Lactacystin und dem Proteinsynthesehemmstoff Cycloheximid ließen darüber hinaus eine NO-bedingte Veränderung der MMP-9-Proteinstabilität ausschließen. Im Gegensatz dazu konnte mittels der metabolischen Markierung mit radioaktiv markiertem Methionin und Cystein gezeigt werden, dass die Proteinneusynthese der MMP-9 durch eine Behandlung der Zellen mit NO stark beeinträchtigt wird. In Übereinstimmung mit diesen Daten finden sich reduzierte MMP-9-mRNA-Spiegel auch in der polysomalen Zellfraktion von MCF-7-Zellen. Wie mit Hilfe des Transkriptionshemmstoffes Actinomycin D und durch Reportergenstudien mit hybriden MMP-9-Promotorkonstrukten gezeigt werden konnte, ist die NO-induzierte Reduktion der MMP-9-mRNA-Spiegel nicht auf eine Verringerung der MMP-9-mRNA-Stabilität zurückzuführen. Reportergenstudien mit einem 670bp langen Promotorfragment des 5’flankierenden Bereichs des humanen MMP-9-Gens zeigten jedoch auf, dass der hemmende Effekt des NOs zum Teil auf eine NO-vermittelte Abnahme der TPA-induzierten MMP-9-Promotoraktivität zurückgeführt werden kann. Demzufolge wurde in den nachfolgenden Experimenten nach den für die MMP-9-Expression notwendigen und von NO modulierten Transkriptionsfaktoren in MCF-7-Zellen gesucht. Anhand von Western-Blot-Analysen und Gelshiftanalysen konnte gezeigt werden, dass die Aktivität des Transkriptionsfaktors AP-1 in MCF-7-Zellen durch NO gehemmt wird, während weder die Expressionspiegel noch die Bindungsaffinität der Transkriptionsfaktoren NFκB und Sp1 durch die NO-Behandlung verändert sind. Weiterhin konnte unter Verwendung von pharmakologischen Inhibitoren der MAPK-Signalwege mit Hilfe der Western-Blot-Analyse nachgewiesen werden, dass MAPK-vermittelte Signalwege zwar für die Induktion der MMP-9-Expression essenziell sind, diese jedoch nicht von NO beeinflusst sind. Im Unterschied hierzu konnte mit Hilfe eines PKC-Aktivitätsassays gezeigt werden, dass die Gesamtaktivität von PKCs nach Behandlung von MCF-7-Zellen mit NO signifikant gehemmt ist. Zusammenfassend zeigen diese Untersuchungen, dass die NO-vermittelte Hemmung der TPA-induzierten MMP-9-Expression in MCF-7-Zellen im Wesentlichen auf eine NO-abhängige Reduktion der Protein-Kinase-C-Aktivität und einer daraus resultierenden Aktivitätshemmung des Transkriptionsfaktors AP-1 zurückgeführt werden kann.

Einfluss einer Schwerionenbestrahlung auf das Migrationsverhalten von Tumorzellen

Die Bildung von Metastasen und Rezidiven stellt ein großes Problem für eine erfolgreiche Therapie solider maligner Tumoren dar. Dabei ist die Rolle der angewendeten Therapiever-fahren in der Induktion metastasierender Zellen vor allem für eine Schwerionentherapie noch weitestgehend unklar. Die für die Metastasierung entscheidende Tumorzellmigration wurde daher unter dem Einfluss von Röntgen- und Schwerionenstrahlung untersuchen. Dazu wurden drei humane Tumorzelllinien (Gliomzelllinie U87 und kolorektale Zelllinien HCT116 und HCT116 p21-/-) unter standardisierten Bedingungen in einer Boydenkammer direkt und 24 Stunden nach Bestrahlung in vitro auf ihr Migrationsverhalten untersucht. Um mögliche Än-derungen migrationsrelevanter Proteine zu bestimmen, wurden zu denselben Zeitpunkten Zelllysate hergestellt und die Expression der Integrine b1 und b3 sowie der Proteinkinase B Isoformen Akt1 und Akt2 und deren Phosphorylierung untersucht. Gezeigt werden konnten sowohl zelllinien- als auch strahlenspezifische Unterschiede in der Migration und der Proteinexpressionen. Dabei konnten die beobachteten Migrationsänderungen nur zum Teil (vor allem nach Röntgenbestrahlung) durch die veränderte Expressionen der untersuchten Proteine erklärt werden. Daher ist zu vermuten, dass den strahleninduzierten Veränderungen der Migration der verwendeten Zelllinien verschiedene Mechanis-men zugrunde liegen, die auf der Expression unterschiedlicher Proteine beruhen. Bestrahlungen mit 12C-Ionen scheinen prinzipiell andere Expressionsmuster zu induzieren als konventionelle Strahlung und die hier untersuchten Proteine in der Migration der Zellen daher nur eine untergeordnete Rolle zu spielen. Auffällig waren die deutlich zelllinienspezifischen Unterschiede in der Migration nach Röntgenbestrahlung. Dort wurde ein zum Teil erhöhtes Migrationspotential nach klinisch relevanten Bestrahlungsdosen von U87 Gliomzellen festgestellt. Die Migrationsaktivität von kolorektalen Zelllinien hingegen nahm nach Bestrahlung ab. Nach Schwerionenbestrahlung wurden für alle Zelllinien signifikante Abnahmen der Migration festgestellt. Die hier erhaltenen Ergebnisse können aufgrund einer Vielzahl pro- und antimigratorischer Signale im Tumorgewebe nicht direkt in die in vivo Situation übertragen werden, doch können sie durchaus als Hinweise für die Abschätzung eines veränderten Metastasierungsrisikos dienen. Für kolorektale Zellen, unabhängig von ihrem p21-Status scheint eine Behandlung mit Röntgenstrahlen eher nicht mit einem erhöhten Migrationsrisiko einherzugehen. Anders ist dies bei den hier untersuchten Gliomzellen U87. Hier kann ein strahleninduziertes Metastasierungsrisiko aufgrund der erzielten Ergebnisse keinesfalls ausgeschlossen werden. Aus dieser Sicht scheint eine Behandlung von Gliomen mit 12C-Ionen vorteilhafter, da eine sehr gute reproduzierbare strahlenvermittelte Migrationshemmung beobachtet wurde.

Analysing the possible influence of transposon TCl4.7 insertion on the function of the genome of Cydia pomonella granulovirus

CpGV-MCp5 is a natural mutant of the Cydia pomonella Granulovirus (Mexican isolate) (CpGV-M) that harbors an insect host transposon termed TCl4.7 in its genome. TCl4.7 is located between the open reading frames Cp15 and Cp16 and separates two homologous regions hr3 and hr4, which have been recently shown to be origins of replication of CpGV-M. The MCp5 has a significant replication disadvantage in the presence of the wild-type CpGV-M. In this study, the possible effects of TCl4.7 transposon insertion on the genome function of its insertion site has been analysed. The role of Cp15 and Cp16 in the context of the virus infection cycle was examined by generating a CpGV-Bacmid (CpBAC) and Cp15 knock-out (CpBACCp15KO) and Cp16 knock-out (CpBACCp16KO) mutants. The mutant CpBACCp15KO was not able to replicate in CM larvae suggesting that Cp15 was essential for virus replication. In contrast, the mutant CpBACCp16KO infected CM larvae and produced viable occlusion bodies (OBs) demonstrating that Cp16 is a non-essential gene for virus in vivo infection of C. pomonella. The temporal transcription of Cp15 and Cp16, as well as of Cp31 (F protein) as a control, was analysed using RT-PCR and quantitative real-time PCR. It suggested a general delay or reduction of gene transcription of MCp5 compared to the parental CpGV-M. Western blot analyses using anti-Cp15 and anti-Cp16 polyclonal antibodies, however, did not show any immuno-reactive response. Thus, a direct influence of TCl4.7 on the expression of Cp15 and Cp16 could not be substantiated. To investigate whether the interruption of hr3 and hr4 palindromes affects the virus replication, two mutant bacmids with a deletion of hr3 and hr4 (CpBAChr3/hr4-KO) and another with an insertion of a Kanamycin resistance cassette between hr3 and hr4 (CpBAChr3-kan-hr4) were generated. Both mutant bacmids replicated and produced infectious virus OBs, which did not significantly differ in their median lethal concentration (LC50) and median survival time (ST50) compared to the parental CpBAC. Interestingly, the mutant CpBAChr3-kan-hr4 was very effectively out-competed by parental CpBAC, when CM larvae were co-infected with known ratios of OBs of CpBAC and the mutant CpBAChr3-kan-hr4. These observations suggested a functional co-operation between hr3 and hr4 which was interrupted by the KanR insertion in CpBAChr3-kan-hr4 and possibly by TCl4.7 transposon insertion in the mutant MCp5. This hypothesis may explain the observed replication disadvantage of the mutants MCp5 and CpBAChr3-kan-hr4 in the presence of the parental viruses CpGV-M and CpBAC, respectively.

Identifizierung und Charakterisierung neuer Proteine des Abwehrsystems der Porifera - ein Apoptoseregulator und ein antimikrobielles Protein aus dem Schwamm Suberites domuncula

Aufgrund ihrer Lebensweise und -umgebung sind effiziente Strategien zur Abwehr bedrohender Einflüsse essentiell für die Porifera. Eine dieser Strategien stellen die Apoptose in höheren Metazoen, sowie ein effizientes Immunsystem dar. Diese sichern sowohl das Überleben des Organismus als auch die Entfernung beschädigter, infizierter oder redundanter Zellen. Bei Untersuchungen der Porifera auf Moleküle, die an diesen Prozessen beteiligt sind, konnten in den letzten Jahren beachtliche Erfolge erzielt werden. So konnten das in der Apoptose involvierte Protein GCDD2 (proapoptotisch), die antiapoptotischen GCBHP1 und GCBHP2 Proteine (Wiens et al., 2001), sowie ein LPS induzierbarer TNF (Wiens et al., 2007) und zwei Caspasen (Wiens et al., 2003) in Schwämmen identifiziert werden. Um diese essentiellen Mechanismen besser verstehen zu können, sollte ein möglicher Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor identifiziert werden. Hierzu wurde die SpongeBase Datenbank nach Proteinen mit Todesdomänen durchsucht und diese unter Anwendung von PCR- und Screening-Techniken in einer cDNA-Bank des marinen Schwammes S. domuncula komplettiert. Im Anschluss an ihre Sequenzierung wurde ein Klon ausgewählt, dessen Todesdomäne größte Homologie zu einem TNFR zeigte. Dieser Klon SD_TNFR-like (Suberites domuncula TNFR-homologes Protein) wurde anschließend diversen Sequenz- und Strukturanalysen unterzogen. Diese offenbarten die Existenz zweier funktional bedeutsamer Domänen (Ubiquitin-like und Todesdomäne). Vor allem die Todesdomäne impliziert eine Beteiligung des Proteins an apoptotischen Prozessen. Über einen „Yeast Two Hybrid Screen“ sollten Proteine identifiziert werden, welche mit dem Ausgangsprotein interagieren. Hierbei wurde ein Protein identifiziert, das Ähnlichkeit mit einem antimikrobiellen Peptid aufweist. Dieses Protein kann analog zu einer Gruppe von antimikrobiellen Peptiden, den α-helikalen kationischen Peptiden, in drei Teile gespalten werden. Das Signalpeptid sowie ein anionisches Propeptid werden abgespalten und es entsteht ein kationisches, antimykotisch wirksames Peptid. Beide Proteine sollten, sofern sie in die Abwehrreaktionen involviert sind, durch Inkubation mit mikrobiellen Strukturen vermehrt exprimiert werden. Eine Überprüfung der Transkription mittels Northern Blot Analysen bestätigte dies für das SD_TNFR-like nach Inkubation mit LPS und TNF- α sowie für SD_Brevinin-like nach Inkubation mit LPS, PAM und Hefe. Mit der Herstellung eines rekombinanten SD_TNFR-like-Proteins wurde die Immunisierung von Kaninchen und die folgende Gewinnung eines polyklonalen SD_TNFR-like-Antikörpers ermöglicht. Dieser gestattete den Nachweis der SD_TNFR-like -Expression mittels Western Blot-Analysen sowie die stressinduzierte erhöhte Expression mittels Dot Blot-Analysen auch auf Proteinebene. Um die Funktion des SD_TNFR-like Proteins zu charakterisierten, wurde ein Test mit RAW-Blue™-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse implizieren, dass das Protein Teil der Immunreaktion analog der der TLR- bzw. NLR- Reaktion ist. Auch die Interaktion mit einem antimikrobiellen Protein, welches für das Überleben des Organismus und die Bekämpfung der Mikroorganismen sorgt, deutet auf eine solche Beteiligung hin. Zusätzlich wird diese These durch ein Ergebnis der Strukturanalysen unterstützt, nämlich die Identifizierung einer TRAF2 Bindestelle. TRAF2 ist ein Adapterprotein der TNFR und aktiviert Überlebensfaktoren über den NF - B-Weg. Immunohistochemische Analysen zeigten, dass das SD_TNFR-like Protein im Organismus vor allem um die Bakteriozysten, um verschiedene Mikroorganismen und am Rand des Schwammes exprimiert wird, was ebenfalls für eine immunologische Funktionsweise spricht. Auch im restlichen Gewebe wird es kontinuierlich, auch ohne vorherige LPS Inkubation exprimiert. Diese Akkumulation zeigt deutlich, dass das Protein in einen Schutzmechanismus gegen äußere Bedrohungen involviert ist. Es scheint dabei direkt an den eindringenden Mikroorganismen zu wirken. Das SD_TNFR-like ist demnach ein potentieller Bestandteil der Immunantwort des Schwammes, welches Apoptose verhindern und Überlebensmechanismen aktivieren kann. Das SD_Brevinin-like Protein besitzt antimykotische Aktivität, wie in einem antimikrobiellen Test gezeigt werden konnte. Weiterhin scheint es für das SD_TNFR-like Protein als positiver bzw. negativer Regulator von Bedeutung zu sein, der eine Reaktion entweder beendet oder die Expression von Überlebensfaktoren verstärkt. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse und Schlussfolgerungen demonstrieren somit die Identifizierung eines neuen Schwammproteins, welches eine Rolle in der Immunantwort spielt, sowie eines neuen antimikrobiellen Peptids, welches die Wirkung des TNFR-like moduliert. Es müssen jedoch noch weitere Funktionsanalysen folgen, um den Mechanismus des SD_TNFR-like Proteins und seine Regulation genauer charakterisieren zu können

Klonierung und Charakterisierung der Luziferase und des Luziferin regenerierenden Enzyms aus dem marinen Schwamm Suberites domuncula

Bereits 1971 erkannte Reiswig bei einigen Schwämmen in der Kontraktion des Osculums eine Reaktion auf Licht. Nachfolgend konnte für eine Reihe von Schwämmen die Existenz von Lichtreaktionen beobachtet werden (Wapstra & van Soest, 1987). In dieser Arbeit sollten Gene eines Luziferin/Luziferase Systems im marinen Schwamm Suberites domuncula identifiziert werden, die eine Rolle bei der Bio¬lumineszenz spielen. Mit Hilfe der PCR-Technik konnten die in der cDNA-Bank identifizierten Fragmente einer Luziferase und eines Luziferin regenerierenden Enzyms erfolgreich vervollständigt, kloniert und analysiert werden. Datenbank¬analysen der abgeleiteten Aminosäuresequenzen ergeben sowohl für die Luziferase als auch für das Luziferin regenerierende Enzym Ähnlichkeiten zu den entsprechenden Proteinen aus Leuchtkäfern, wie z. B. Photinus pyralis. Ausgehend von der cDNA wurden zunächst beide Enzyme in E. coli rekombinant exprimiert und affinitätschromatographisch aufgereinigt. Für die Luziferase gelang es, spezifische Antikörper herzustellen, die im Anschluss an den im Western Blot durchgeführten Nachweis eine Identifizierung in histologischen Schwamm¬schnitten ermöglichte. Weitere Analysen konnten für Suberites domuncula sowohl im Schwammgewebe, im Proteinextrakt als auch für das rekombinante Protein die Licht-generierende Fähigkeit nachweisen. Das ermittelte in vitro Biolumineszenz-Emissionsspektrum der rekombinanten Luziferase weist eine Lichtemission im gelb-grünen Bereich des Spektrums mit einem Maximum bei 548 nm und einer Schulter bei 590 nm auf. Ausserdem bestätigte die Funktionanalyse des rekombinanten Enzyms die für Luziferasen bekannte ATP- und Temperatur¬abhängigkeit sowie den stimulierenden Effekt von Coenzym A. Die Existenz einer bioaktiven Luziferase in einem der ältesten, rezent vertretenen Metazoa deutet darauf hin, dass sich die Oxygenasefunktion der Luziferasen bereits früher entwickelte, als bisher von Viviani* vermutet. Die bisherigen Daten über die optischen Eigenschaften der Spiculae liefern gemeinsam mit den Ergebnissen dieser Arbeit – einer Licht-emittierenden Luziferase in S. domuncula – die Voraussetzungen für die mögliche Existenz eines Photorezeptionssystems in Schwämmen.

Entwicklung eines immunologischen Testsystems zur Detektion des marinen Biotoxins Domoinsäure

Domoinsäure ist ein von mehreren Arten mariner Kieselalgen der Gattung Pseudonitzschia produziertes Toxin, welches während einer Algenblüte in Molluscen wie z.B. der Miesmuschel Mytilus sp. akkumuliert werden kann. Beim Verzehr solch kontaminierter Muscheln können sowohl beim Menschen als auch bei Tieren erhebliche Vergiftungserscheinungen auftreten, die von Übelkeit, Kopfschmerzen und Orientierungsstörungen bis hin zum Verlust des Kurzzeitgedächtnisses (daher auch als amnesic shellfish poisoning bekannt) reichen und in einigen Fällen tödlich enden. rnDie heute gängigen Methoden zur Detektion von Domoinsäure in Muschelgewebe wie Flüssigkeitschromatographie und Maus-Bioassay sind zeit- und kostenintensiv bzw. in Anbetracht einer Verbesserung des Tierschutzes aus ethischer Sicht nicht zu vertreten. Immunologische Testsysteme stellen eine erstrebenswerte Alternative dar, da sie sich durch eine vergleichsweise einfache Handhabung, hohe Selektivität und Reproduzierbarkeit auszeichnen.rnDas Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein solches immunologisches Testsystem zur Detektion von Domoinsäure zu entwickeln. Hierfür wurden zunächst Antikörper gegen Domoinsäure gewonnen, wofür das Toxin wiederum als erstes über die Carbodiimid-Methode an das Trägerprotein keyhole limpet hemocyanin (KLH) gekoppelt wurde, um eine Immunantwort auslösen zu können. Kaninchen und Mäuse wurden mit KLH-DO-Konjugaten nach vorgegebenen Immunisierungsschemata immunisiert. Nach vier Blutabnahmen zeigte das polyklonale Kaninchenantiserum eine ausreichend hohe Sensitivität zum Antigen; das nachfolgende Detektionssystem wurde mit Hilfe dieses polyklonalen Antikörpers aufgebaut. Zwar ist es gegen Ende der Arbeit auch gelungen, einen spezifischen monoklonalen Antikörper aus der Maus zu gewinnen, jedoch konnte dieser aus zeitlichen Gründen nicht mehr im Detektionssystem etabliert werden, was durchaus wünschenswert gewesen wäre. rnWeiterhin wurde Domoinsäure im Zuge der Entwicklung eines neuartigen Testsystems an die Trägerproteine Ovalbumin, Trypsininhibitor und Casein sowie an Biotin konjugiert. Die Kopplungserfolge wurden im ELISA, Western Blot bzw. Dot Blot nachgewiesen. Die Ovalbumin-gekoppelte sowie die biotinylierte Domoinsäure dienten im Folgenden als die zu messenden Größen in den Detektionsassays- die in einer zu untersuchenden Probe vorhandende, kompetitierende Domoinsäure wurde somit indirekt nachgewiesen. rnDer zulässige Höchstwert für Domoinsäure liegt bei 20 µg/g Muschelgewebe. Sowohl mit Biotin-DO als auch mit OVA-DO als den zu messenden Größen waren Domoinsäurekonzentrationen unterhalb dieses Grenzwertes nachweisbar; allerdings erwies sich der Aufbau mit Biotin-DO um das ca. 20-fache empfindlicher als jener mit OVA-DO. rnDie in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse könnten als Grundlage zur Etablierung eines kommerzialisierbaren immunologischen Testsystems zur Detektion von Domoinsäure und anderen Biotoxinen dienen. Nach erfolgreicher Validierung wäre ein solches Testsystem in seiner Handhabung einfacher als die gängige Flüssigkeitschromatographie und besser reproduzierbar als der Maus-Bioassay.rn

Modulation der Strahlen- und Chemosensitivität menschlicher Tumorzellen durch Interferon

Pankreaskarzinome und maligne Melanome weisen eine hohe Resistenz gegenüber Zytostatika und Bestrahlung in der Therapie auf. Die Behandlung eines metastasierenden Pankreaskarzinoms besteht aus einer Kombination aus 5-FU, CDDP und IR. Für die Behandlung des malignen Melanoms ist das methylierende Agenz DTIC das Mittel erster Wahl. Das ebenfalls methylierende Agenz TMZ, welches jedoch in Deutschland noch nicht für die Behandlung von malignen Melanomen zugelassen ist, erlangt immer größere Bedeutung. Die Ansprechrate der Tumore kann durch Kombination mit IFNs erhöht werden. In der vorliegenden Arbeit wurde an Pankreaskarzinom- bzw. Melanomzelllinien untersucht, ob IFNs einen radio- bzw. chemosensibilisierender Effekt ausüben und, wenn ja, welcher Mechanismus hierfür verantwortlich ist. Es wurden zehn Pankreaskarzinom-Zelllinien (Panc-1, Su8686, Capan-1, Capan-2, Bxpc-3, PA-TU 8988T, Aspc-1, HS 766T, Mia-PaCa-2 und PA-TU 8902) untersucht. Diese zeigten eine hohe Variabilität in ihrer intrinsischen Radiosensitivität sowie in ihrer Sensitivität gegenüber IFN-alpha und IFN-beta. IFN-beta erwies sich als toxischer im Vergleich zu IFN-alpha. Die radiosensibilisierende Wirkung der IFNs an Pankreaskarzinom-Zelllinien war moderat, wobei IFN-beta im Vergleich zu IFN-alpha effektiver war. Der radiosensibilisierende Effekt ging mit einer deutlichen Erhöhung der alpha-Komponente, der Überlebenskurven einher und kam durch eine IFN-beta vermittelte Verstärkung der IR-induzierten Apoptoserate zustande. Dies wurde sowohl durch SubG1 als auch durch Annexin V / PI Messungen gezeigt. Einen Einfluss von IFN-beta auf den Zellzyklus und die DSB-Reparatur konnte durch funktionelle Untersuchungen sowie durch PCR bzw. Western-Blot-Analysen als Grund für den sensibilisierdenen Effekt ausgeschlossen werden. Ein sensibilisierender Effekt von IFN-beta auf die durch TMZ-induzierte Zytotoxizität war für die Pankreaskarzinom-Zelllinien weder in MGMT-profizientem noch –depletiertem Zustand zu beobachten. Zur Untersuchung der sensibilisierenden Eigenschaften von IFNs gegenüber TMZ in malignen Melanomzelllinien wurden p53-Wildtyp (D05 und A375) und mutierte Zelllinien (D14 und RPMI 7951) untersucht. Gegenüber alleiniger TMZ-Behandlung reagierten die untersuchten p53-Wildtyp Melanomzelllinien nicht sensitiver auf eine Behandlung mit TMZ als p53-mutierte Zelllinien. Der Nachweis des Spaltprodukts der Caspase-9 lieferte einen Hinweis darauf, dass in den Melanomzelllinien unabhängig vom p53-Status nach alleiniger TMZ-Behandlung der mitochondriale Apoptoseweg aktiviert wird. Durch eine Vorbehandlung der Zellen mit IFN-alpha oder IFN-beta konnte die TMZ-induzierte Apoptoserate in malignen Melanomzellen deutlich gesteigert werden. In p53-Wildtyp Melanomzellen war der chemosensibilisierende Effekt der IFNs besonders ausgeprägt. IFN-beta erwies sich hierbei als effektiver, weshalb es für die folgenden Versuche verwendet wurde. Durch stabile Transfektion der Zelllinie D05 mit MGMT konnte das durch TMZ-induzierte Addukt O6MeG als für den sensibilisieredenen Effekt ausschlaggebende DNA-Schädigung charakterisiert werden. Western-Blot-Analysen und gamma-H2AX-Immunfluoreszenz Untersuchungen konnten einen Einfluss von IFN-beta auf die Prozessierung der Läsion O6MeG sowie einen Einfluss von IFN-beta auf die Induktion und Reparatur von TMZ verursachten DSBs ausschließen. Durch Experimente mit einem Fas-aktivierenden Antikörper und durch eine stabile Transfektion der Zelllinien D05 und A375 mit DN-FADD konnte gezeigt werden, dass p53-Wildtyp Melanomzellen nicht oder nur eingeschränkt in der Lage sind, nach TMZ-Behandlung über den Fas-Rezeptor Signalweg Apoptose zu induzieren. Ausschlaggebend hierfür ist die geringe Pro-Caspase-8 Expression dieser Zelllinien. Eine IFN-beta Vorbehandlung bewirkte eine Reaktivierung des Fas-Rezeptor Signalweges, was mit einer verstärkten Expression der Pro-Caspase-8 einherging. Durch Experimente mit Caspase-8 siRNA konnte diese IFN-beta induzierte Verstärkung der Pro-Caspase-8 Expression als entscheidender Faktor für den sensibilisierenden Effekt ausgemacht werden. Zum ersten Mal konnte damit in dieser Arbeit gezeigt werden, dass p53-Wildtyp Melanomzellen durch eine IFN-beta vermittelte Hochregulation der Pro-Caspase-8 ihre Fähigkeit wiedererlangen, nach TMZ-Behandlung über den Fas-Rezeptor Signalweg Apoptose auszulösen. Diese Arbeiten weisen einen Weg, auf welchem die hohe Resistenz von malignen Melanomzellen, welche zu 80 % das nicht mutierte p53 Gen beherbergen, über eine IFN-beta induzierte Reaktivierung der Fas-Rezeptor vermittelten Apoptosekaskade überwunden werden kann.

Die Rolle der Ubiquitin-Ligase Smurf2 in T-Lymphozyten bei der Entwicklung von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

TGF-beta ist ein Schlüsselmolekül zellvermittelter Immuntoleranz. So spielt es neben seiner pleiotropen Rolle in Immunzellen auch bei der Tumorentwicklung eine große Rolle. Das TGF-beta hat bei der Tumorentwicklung eine duale Rolle. So dient es in frühen Phasen als Tumorsuppressor, währenddessen es in späten Phasen der Entwicklung als Tumorpromotor wirkt. Eine strikte Regulation des TGF-beta Signalweges ist daher für ein funktionierendes Immunsystem von essentieller Bedeutung. Die Ubiquitin Ligase Smurf2 ist dabei ein wichtiger negativ Regulator des TGF-beta Signalweges.In der vorliegenden Arbeit konnte eine neue Spleißform des Smurf2 (dE2Smurf2) aus murinen CD4+ T-Zellen isoliert werden, deren Funktion in vitro und in vivo in T-Lymphozyten untersucht worden ist. Für diese Spleißform konnte zudem eine humane Relevanz nachgewiesen werden. Mit Hilfe von Überexpressionen in Cos7 Zellen konnte eine veränderte Lokalisation der Smurf2 Spleißformen (WT und dE2) festgestellt werden. Dabei konnten lysosomale und endosomale Kompartimente bei der Kolokalisation mit dem dE2Smurf2 Konstrukt beobachtet werden. Das Spleißen des Exons2 führte dabei zu Änderungen der Topologie der N-terminalen C2-Domäne, wodurch sich eine veränderte Lokalisation in der Zelle beschreiben ließ. Mit der veränderten intrazellulären Verteilung erfuhr auch die Funktion der dE2Smurf2 Ubiquitin Ligase eine Änderung. So konnte überraschenderweise eine positive Signalinduktion des TGF-beta Signalweges beobachtet werden, was im Gegensatz zum beschriebenen WTSmurf2 stand. Durch eine Überexpression des dE2Smurf2 Proteins in T-Lymphozyten wurde der TGF-beta Signalweg in CD4+ und CD8+ Zellen positiv reguliert, dabei wurde der TGFbetaRII vermehrt exprimiert und gleichzeitig fand eine verstärkte Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren Smad2 und Smad3 nach TGF-beta Stimulation statt. Die transgenen T-Lymphozyten waren somit sensitiver gegenüber TGF-beta. Dies führte zur Hypothese, die durch Western Blot Analyse bestätigt werden konnte, daß das dE2Smurf2 nach Überexpression seine WT-Form bindet und dadurch degradiert. Die Degradation der Ubiquitin Ligase war dabei Smad7 abhängig. Zur Analyse des Einflusses der Ubiquitin Ligase dE2Smurf2 auf die Differenzierung von CD4+ T-Zellen, sowie ihre Rolle bei der T-Zell Proliferation, konnte gezeigt werden, daß durch die höhere Sensitivität gegenüber TGF-beta naive T-Zellen unter Einfluß von TGF-beta und IL6 vermehrt in TH17 Zellen differenzierten. Zudem konnte gezeigt werden, daß die Proliferationsrate transgener naiver CD4+ T-Zellen bei geringen Mengen von TGF-beta starkt vermindert war. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß bei einer Differenzierung der naiven CD4+ T-Zellen in TH1 Zellen, diese signifkant weniger das proinflammatorische Zytokin INFγ produzierten.So zeigten in vivo Versuche, daß die transgenen Tiere in der Entwicklung von Kolorektalen Karzinomen protektiert waren. Sowohl im kolitisassiziierten Tumor Modell als auch bei der spontanen Entwicklung von Tumoren im APCmin Modell. Dies konnte zum einen auf eine deutlich verminderte Entzündung (geringere Produktion an Zytokinen durch verminderte Proliferation) des Darms und zum anderen durch eine stärkere Produktion an zytotoxischen Genen, wie Perforin, INFγ und Granzym B erklärt werden. Interessanterweise konnte jedoch im Transfer Kolitis Modell eher eine proinflammatorische Wirkung des dE2Smurf2 Proteins nachgewiesen werden. So wiesen die immundefizienten Mäuse, in denen die transgenen T-Zellen injiziert wurden, eine signifikant stärkere Kolitis auf als die Kontrollen. Dies konnte mit einer Überproduktion an IL17 sezernierenden T-Zellen erklärt werden. Klonierungsexperimente führten zudem zur Identifikation einer bisher nicht beschriebenen nicht kodierenden RNA. Diese zeigte in Kombination mit dem dE2Smurf2 Protein in einer Reportergen Analyse eine Hyperaktivierung des Smad3 Promotors. Diese Daten liefern zum einen ein genaueres Modell über die Regulation des TGF-beta Signalweges sowie wichtige Erkenntnisse zur Pathophysiologie chronisch entzündlicher Darmerkrankung und daraus resultierende Tumorerkrankungen. So entwickelt sich das dE2Smurf2, Teil des TGF-beta Signalweges, als attraktives Zielprotein für die Modulation von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und (kolitisassoziierte) Kolonkarzinomen.

Einfluss der Modulation von P-Glykoprotein (P-gp) auf die Verfügbarkeit und Wirksamkeit der pharmakologischen Behandlung psychiatrischer Erkrankungen im Tiermodell

P-Glykoprotein (P-gp) ist ein ATP-verbrauchender Transporter, der in Organschranken exprimiert wird, um Fremdstoffe auszuschleusen, darunter auch Psychopharmaka. Im Rahmen dieser Arbeit wurde im Tiermodell der Maus untersucht, welche pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Konsequenzen sich bei Verabreichung von Risperidon als P-gp Modellsubstrat ergeben, wenn die Expression von P-gp induziert wird. Als potenzielle Induktoren wurden Dexamethason, Rifampicin, Quercetin, 5-Pregnen-3ß-ol-20-on-16α-Carbonitril (PCN) und Acitretin geprüft. Es konnte gezeigt werden, dass alle Substanzen die Verteilung von Risperidon und seinem aktiven Metaboliten 9-Hydroxyrisperidon beeinflussten. Während sich für Quercetin und Acitretin leichte P-gp inhibitorische Eigenschaften ergaben, die an Hand von erhöhten Konzentrationen von Risperidon und 9-Hydroxyrisperidon gezeigt werden konnten, führten die bekannten P-gp Induktoren Rifampicin, Dexamethason und PCN zu verringerten Konzentrationen im Vergleich zur Kontrollgruppe. Durch Western Blot Untersuchungen wurde bestätigt, dass die Induktoren die P-gp Expression im Hirngewebe tendenziell steigerten. Dies sprach dafür, dass bei Verabreichung einer Komedikation, die P-gp induziert, mit einer veränderten Verteilung von P-gp Substraten zu rechnen ist. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass durch eine Hemmung bzw. Induktion von P-gp nicht nur die Pharmakokinetik, sondern auch die Pharmakodynamik von Risperidon und 9-Hydroxyrisperidon verändert wird. Dies wurde durch verhaltenspharmakologische Untersuchungen gezeigt. Durch Risperidon induzierte motorische Effekte auf dem RotaRod waren nach Induktion von P-gp abgeschwächt. Dies zeigte sich auch für Haloperidol, welches kein Substrat ist. Da P-gp abhängige Effekte in diesem Fall keine bedeutende Rolle spielen, ist davon auszugehen, dass neben der Induktion von P-gp an der Blut-Hirn Schranke auch andere Mechanismen wie z.B. eine Induktion von Enzymen der CYP-Familie an den beobachteten Effekten beteiligt sind. Bei Untersuchungen von kognitiven Leistungen in der Barnes Maze konnte gezeigt werden, dass Haloperidol im Gegensatz zu Risperidon das Lernverhalten negativ beeinflussen kann. Eine P-gp Induktion schien jedoch keinen deutlichen Einfluss auf das Lernverhalten unter Antipsychotika-Gabe zu haben und sprach vielmehr für substanzabhängige Effekte der einzelnen Antipsychotika bzw. P-gp Modulatoren. Zusatzuntersuchungen zur Hirngängigkeit von Acitretin, einem synthetischen Retinoid, welches derzeit als potenzielles Antidementivum geprüft wird, konnten belegen, dass es die Blut-Hirn Schranke überwindet. Bereits 1h nach Injektion war Acitretin in hoher Konzentration im Gehirn nachweisbar. Durch die Analyse zur Verteilung von Acitretin in Hirngewebe und Serum von P-gp Wildtyp und P-gp doppel knockout Mäusen konnte belegt werden, dass Acitretin nicht P-gp abhängig transportiert wird. Die Daten insgesamt betrachtet, lassen den Schluss zu, dass durch Verabreichung von Medikamenten, die P-gp Modulatoren sind, bei Antipsychotika mit pharmakokinetischen Interaktionen zu rechnen ist, welche die Wirksamkeit der Medikamente einschränken können.

Analyse von Pathomechanismen im Rahmen der Hepatitis-C-Infektion

Das Hepatitis C Virus stellt mit weltweit 170 Millionen infizierten Menschen ein großes gesundheitliches Problem dar. Zwar sind in den letzten Jahren deutliche Fortschritte in der Behandlung der Hepatitis C gemacht worden, gleichwohl ist die Hepatitis C durch das Fehlen eines potenten Impfstoffes weiterhin ein relevantes gesundheitliches Risiko, da sich Infektionsraten auf diesem Wege nicht eindämmen lassen. Der Ansatz dieser Dissertation bestand in der Konstruktion adenoviraler Vektoren, die Anteile des HCV-Genoms beinhalten. Mit Hilfe dieser Vektoren sollten verschiedene Zelltypen transduziert werden, eine Überexpression viraler Proteine initiert werden und Effekte der HCV Proteine HCV-Core und HCV-NS5a ermittelt werden. Diese Dissertationsschrift beschreibt die Konstruktion der adenoviralen Vektoren, die die Hepatitis Gene Core bzw. NS5a tragen. Die Klonierungsschritte werden umfassend aufgezeigt. Darauf aufbauend werden Versuche gezeigt, die die erfolgreiche adenovirale Transduktion in Zielzellen bestätigen. Es werden phänotypische Veränderungen der verschiedenen Zielzellen anhand mikroskopischer Aufnahmen demonstriert. Zusätzlich wird die erfolgreiche Konstruktion der Vektoren durch Detektion der viralen Proteine im Western Blot bestätigt. Es konnte gezeigt werden, dass sich verschiedene Zielzellen mit den Vektoren transduzieren lassen und die Proteinexpression der HCV-Proteine einer dosisabhänigen Expressionskinetik folgt. In weiteren Untersuchungen konnten Veränderungen der Viabilität der Zellen durch die Expression der viralen Proteine HCV-Core und HCV-NS5a gezeigt werden. Durch eine dosisabhängige Herunterregulation des anti-apoptoischen Proteins MCL-1 ist das Gesamtüberleben der Zellen vermindert. Die Wachstumskinetik der transduzierten Zellen ist signifikant herabgesetzt.

Misregulation of the tumour suppressor gene CYLD drives hyperactivation of T cells leading to intestinal pathology

The tumour suppressor gene cyld is mutated in familial cylindromatosis, an autosomal-dominant condition that predisposes to multiple skin tumours. The deubiquitinase CYLD acts as a negative regulator of NF-κB signaling. To analyse the function of CYLD in vivo we used the CYLDex7/8 mice, which are characterized by loss of the full-length transcript and overexpression of a short splice variant of CYLD (sCYLD). In CYLDex7/8 mice the overexpression of sCYLD results in splenomegaly and lymphadenopathy. Additionally, the B cell population in spleen and lymph nodes is increased at the expense of T cells. Analysis of CYLDex7/8 T cells showed a significant reduction of CD4 single positive (SP) and CD8 SP T cells in the thymus and in the periphery. By investigating the impact of sCYLD in TCR signaling in thymocytes, we could demonstrate that sCYLD partially inhibited the activation of Zap70 and thereby negatively regulated TCR signaling. In vitro as well as in vivo we could show that CD4+ T cells displayed a hyperactive phenotype, proliferated to a better extent than WT cells and expressed high amounts of inflammatory cytokines such as IL-6 and IL-17A. Western Blots of steady state thymocytes and peripheral CD4+ T cells were performed, showing that the noncanonical pathway was highly upregulated visualized by the expression levels of RelB and p100 leading to a hyperactive phenotype of CD4+ T cells. In order to investigate the contribution of sCYLD in positive and negative selection in the thymus in vivo, the HY-TCR transgene (HYtg) was crossed to CYLDex7/8 mice. The analysis of CYLDex7/8 HYtg males revealed an increase in CD4+CD8+ DP as well as in CD8+ SP thymocytes, suggesting a less pronounced negative selection in CYLD mutant mice compared to HYtg control mice. Interestingly, the impaired negative selection in the thymus was accompanied by a strong colitis phenotype at early ages (4 weeks). Since medullary TECs (mTECs) play an important role in the late stage of T cell development by negatively selecting autoreactive thymocytes, the levels of mTECs in the medullary compartment was investigated. Of note, low numbers of mTECs were observed, combined with decreased expression levels of the mTEC markers UEA-1, keratin-5, claudin-3 and claudin-4. The reduction of mTECs in the medullary compartment could explain the inflammatory phenotype of CD4+ T cells in CYLDex7/8 mice leading to the severe intestinal pathology observed in these mice. Taken together, these results show an important role of sCYLD in T cell development and function as well as in NF-кB signaling of T cells.

In vivo konditionale Depletion von latentem murinen Cytomegalovirus

Die Lunge stellt einen Hauptort der CMV-Latenz dar. Die akute CMV-Infektion wird durch infiltrierende antivirale CD8 T-Zellen terminiert. Das virale Genom verbleibt jedoch im Lungengewebe in einem nicht replikativen Zustand, der Latenz, erhalten. Es konnte bereits gezeigt werden, dass während der Latenz die Major Immediate Early- (MIE) Gene ie1- und ie2 sporadisch transkribiert werden. Bisher konnte diese beginnende Reaktivierung latenter CMV-Genome nur in einer Momentaufnahme gezeigt werden (Kurz et al., 1999; Grzimek et al., 2001; Simon et al., 2005; zur Übersicht: Reddehase et al., 2008). Die sporadische Expression der MIE-Gene führt jedoch zur Präsentation eines antigenen IE1-Peptids und somit zur Stimulation antiviraler IE1-Peptid-spezifischer CD8 T-Zellen, die durch ihre Effektorfunktion die beginnende Reaktivierung wieder beenden. Dies führte uns zu der Hypothese, dass MIE-Genexpression über einen Zeitraum betrachtet (period prevalence) häufiger stattfindet als es in einer Momentaufnahme (point prevalence) beobachtet werden kann.rnrnUm die Häufigkeit der MIE-Genexpression in der Dynamik in einem definierten Zeitraum zu erfassen, sollte eine Methode entwickelt werden, welche es erstmals ermöglicht, selektiv und konditional transkriptionell aktive Zellen sowohl während der akuten Infektion als auch während der Latenz auszulöschen. Dazu wurde mit Hilfe der Zwei-Schritt BAC-Mutagenese ein rekombinantes death-tagged Virus hergestellt, welches das Gen für den Diphtherie Toxin Rezeptor (DTR) unter Kontrolle des ie2-Promotors (P2) enthält. Ist der P2 transkriptionell aktiv, wird der DTR an der Zelloberfläche präsentiert und die Zelle wird suszeptibel für den Liganden Diphtherie Toxin (DT). Durch Gabe von DT werden somit alle Zellen ausgelöscht, in denen virale Genome transkriptionell aktiv sind. Mit zunehmender Dauer der DT-Behandlung sollte also die Menge an latenten viralen Genomen abnehmen.rnrnIn Western Blot-Analysen konnte das DTR-Protein bereits 2h nach der Infektion nachgewiesen werden. Die Präsentation des DTR an der Zelloberfläche wurde indirekt durch dessen Funktionalität bewiesen. Das rekombinante Virus konnte in Fibroblasten in Gegenwart von DT nicht mehr replizieren. In akut infizierten Tieren konnte die virale DNA-Menge durch eine einmalige intravenöse (i.v.) DT-Gabe signifikant reduziert werden. Verstärkt wurde dieser Effekt durch eine repetitive i.v. DT-Gabe. Auch während der Latenz gelang es, die Zahl der latenten viralen Genome durch repetitive i.v. und anschließende intraperitoneale (i.p.) DT-Gabe zu reduzieren, wobei wir abhängig von der Dauer der DT-Gabe eine Reduktion um 60\% erreichen konnten. Korrespondierend zu der Reduktion der DNA-Menge sank auch die Reaktivierungshäufigkeit des rekombinanten Virus in Lungenexplantatkulturen. rnrnrnUm die Reaktivierungshäufigkeit während der Latenz berechnen zu können, wurde durch eine Grenzverdünnungsanalyse die Anzahl an latenten viralen Genomen pro Zelle bestimmt. Dabei ergab sich eine Kopienzahl von 9 (6 bis 13). Ausgehend von diesen Ergebnissen lässt sich berechnen, dass, bezogen auf die gesamte Lunge, in dem getesteten Zeitraum von 184h durch die DT-Behandlung 1.000 bis 2.500 Genome pro Stunde ausgelöscht wurden. Dies entspricht einer Auslöschung von 110 bis 280 MIE-Gen-exprimierenden Lungenzellen pro Stunde. Damit konnte in dieser Arbeit erstmals die Latenz-assoziierte Genexpression in ihrer Dynamik dargestellt werden.rn

Generierung eines BAC-transgenen Mausstamms zur Analyse von Melanomen

Da Tumorerkrankungen ein enormes Gesundheitsproblem in der westlichen Welt darstellen, wird eine Vielzahl neuer Behandlungsstrategien entwickelt. Neuartige Tumor-Therapeutika werden jedoch üblicherweise zunächst an Tiermodellen evaluiert, bevor sie am Menschen angewandt werden.rnIn der vorliegenden Arbeit wurde ein BAC-transgenes Mausmodell generiert, welches als autochthones Melanommodell zur Anwendung kommen sollte.rnZunächst wurde dafür ein DNA-Konstrukt erzeugt. Dieses enthält die Melanom-Onkogene BrafV600E, Cdk4R24C und Mitf deren Expression durch die Tamoxifen-induzierbare Rekombinase CreERT2 kontrollierbar sein sollte. Die Verwendung des Tyrosinasepromoters sollte die melanozytenspezifische Expression der eingebrachten Gene gewährleisten. Ein weiterer Bestandteil des Konstrukts ist ein Luziferase-Gen, welches die Lokalisierung Onkogen-exprimierender Zellen durch in vivo-Biolumineszenz-Imaging erlaubt, da die Onkogen- und Luziferase-Expression durch 2A-Sequenzen gekoppelt sind.rnVor der Generierung der transgenen Tiere sollten in vitro Analysen die Funktionalität des Konstruktteils, bestehend aus den Onkogenen und der Luziferase, klären. Zu diesem Zweck wurde die Zelllinie C22 mit einem Expressionsvektor transfiziert, welcher den genannten Konstruktteil enthielt. Es konnte ein Anstieg der Braf- und Cdk4-Expression auf Protein Ebene, das Vorhandensein von Luziferase-Aktivität und die Aktivierung des MAP-Kinase-Signalwegs nachgewiesen werden. Die Funktionalität des untersuchten Konstruktteils war damit nahegelegt und die Generierung der transgenen Tiere wurde fortgesetzt.rnDie Pronukeus-Injektion resultierte schließlich in 3 Founder-Tieren, die mittels PCR und Southern Blot identifiziert wurden und die Bezeichnung „B6 tg Tyr iOnkogene“ (TyriOn) erhielten. Durch Verkreuzen der Founder-Tiere mit C57BL/6 Mäusen wurden im weiteren Verlauf 3 Linien erzeugt. Bei in vivo Biolumineszenz-Messungen zeigten Tiere der Linie D einen gewissen Grad an Hintergrund-Luziferase-Aktivität, die jedoch durch Tamoxifen-Injektionen verstärkt werden konnte. In den Folgegenerationen ging diese Tamoxifen-induzierte Verstärkung der Luziferase-Aktivität teilweise verloren. Es wurde die Vermutung angestellt, dass funktionelle und nicht-funktionelle Varianten des Transgens an unterschiedlichen Stellen im Genom von Founder D integriert hatten, und sich in den folgenden Generationen auf die Nachkommen verteilten. Die mangelnde Induzierbarkeit betroffener Tiere konnte nicht auf fehlende Integrität der Sequenz „iOnkogene“ in diesen Tieren oder auf nicht-funktionelle loxP-Stellen im Konstrukt zurückgeführt werden.rnTamoxifen-Injektionen führten in TyriOn-D Tieren im Laufe von 15 Monaten nicht zur Entwicklung von Tumoren. Ebenso wenig konnten in TyriOn-D / Cre del Tieren, welche die eingebrachten Onkogene maximal exprimieren sollten, Tumoren detektiert werden. Um zu analysieren, ob die eingebrachten Onkogene die Bildung von Tumoren begünstigen, wurden TyriOn-D Tiere mit dem Melanom-anfälligen Stamm MT/ret verkreuzt. Hierzu konnte im Rahmen dieser Arbeit noch kein Ergebnis erzielt werden. Allerdings konnte in Melanomen von TyriOn-D / MT/ret Tieren Luziferase-Aktivität bei in vivo Biolumineszenz-Messungen und CreERT2 RNA durch RT-PCR detektiert werden.rnTyriOn-D / MT/ret Tiere werden im weiteren Verlauf dieses Projektes nicht nur der Analyse der Melanomentwicklung dienen. Deren Tumore ermöglichen außerdem weitere Untersuchungen bezüglich der Funktionalität des Konstrukts, die teilweise in TyriOn Tieren keine Resultate ergaben.