Isolierung und Charakterisierung von Spirochaeten aus dem Termitendarm

Termiten beherbergen in ihrem Darm eine einzigartige Flora aus Bakterien, Archaeen, Flagellaten und Hefen. Diese symbiontische mikrobielle Gemeinschaft ist am Abbau von komplexen organischen Verbindungen beteiligt und ermöglicht es den Termiten schwer abbaubares Material wie Holz als Nahrungsquelle zu nutzen. Spirochaeten, eine Gruppe beweglicher Bakterien die sich durch ihre besondere Morphologie und Art der Fortbewegung von allen anderen Mikroorganismen abgrenzen lassen, gehören zu den häufigsten Bakterien im Termitendarm. Ziel der Arbeit war die Isolierung und Charakterisierung bislang unbekannter Spirochaeten aus Termitendärmen. Aus drei niederen Termitenarten konnten sechs spirochaetale Stämme gewonnen und identifiziert werden. Die Isolate ließen sich anhand der 16S rRNA Gensequenzen den Gattungen Treponema und Spirochaeta zuordnen. Im Gegensatz zu allen bislang charakterisierten Spirochaeten zeigte der Stamm SPN1 aus der Termite Neotermes castaneus eine kokkoide Zellform und war unbeweglich. Der Organismus wurde daher als neue Art, Spirochaeta coccoides sp. nov., beschrieben. Bei allen gewonnenen Isolaten handelt es sich um strikt anaerobe Organismen die verschiedene Mono-, Di- und Oligosaccharide fermentieren. Als wesentliche Stoffwechselprodukte konnten Acetat und Ethanol (sowie Formiat bei einem Stamm) identifiziert werden. Weiterhin konnten bei den untersuchten Stämmen eine Reihe von enzymatischen Aktivitäten nachgewiesen werden, die für den Abbau von Lignocellulose im Termitendarm von Bedeutung sind. Die Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Spirochaeten eine wichtige Rolle bei der Fermentation von Abbauprodukten der Lignocellulose im Termitendarm spielen.

A study of nitronyl and imino nitroxide radicals attached to heterocyclic cores

Stabile organische Radikale mit zusätzlichen Funktionalitäten wie Donor/Akzepotor Eigenschaften und Ligandeneignung für Übergangsmetallkomplexierung repräsentieren eine synthetische Herausforderung beim Streben nach der Konstruktion hochdimensionaler heterospin Strukturen. In diesem Hinblick wurden acht neue Hochspinbiradikal-Moleküle zusammen mit ihren Monoradikal- Pendants in dieser Arbeit hergestellt. Die Wahl der Liganden als organische Distanzhalter der Radikaleinheiten wurde auf stickstoffhaltige Heterozyklen (Pyridin und Pyrazol) gelenkt. Diese wurden weiterhin mit den stabilen Spinträgern Nitronylnitroxid- (NN) und Iminonitroxidfragmenten (IN) dekoriert. Ihre Synthese beinhaltete mehrstufige Umsetzungen (Brominierung, Iodierung, N- und Carbaldehyd Schutzgruppen, Stille-Kupplung, Grignard Reaktion, etc.) um die Mono- und Dicarbaldehyd-heterocyclenderivate als Schlüsselvorläufer der Radikaleinheiten zu gewinnen. Die Carbaldehyd-Zwischenstufen wurden Kondensationsreaktionen mit 2,3-Dimethyl-2,3-bis(hydroxylamino)-butan unterworfen (üblicherweise in Dioxan unter Argon für ~ 7 Tage), gefolgt von der Oxidation der Bis-hydroxylimidazolidin-Vorläufer unter Phasentransferkatalyse (NaIO4/H2O). Die Radikalmoleküle wurden mit verschiedenen spektroskopischen Methoden untersucht (FT/IR, UV/Vis/ EPR etc.) und ihre Einkristalle mit Röntgenstrahlbeugung gemessen. Die UV/VIS- Lösungsspektren zeigten in einem breiten Bereich verschiedener Lösungsmittelpolaritäten keine spezifische Wechselwirkung zwischen Lösungsmittel und Radikaleinheit, während ihre Stabilitäten in protischen Lösunsgmitteln wie MeOH stark abnahmen. Als Pulver konnten sie jedoch im Kühlschrank an der Luft für eine Jahr gelagert werden, ohne sich zu zersetzen. Die spektroskopischen Fingerabdrücke der Radikale wurden eindeutig identifiziert and erschienen stark abhängig vom Typ des pi-Ringsystems an das die Spinträger gekoppelt wurden. Basierend auf diesen Informationen wurde ein schnelles Protokoll etabliert, das eine direkte Zuordnung der Art der Radikale und ihrer Anzahl ermöglicht, sowie ihre Reinheit und Verunreinigungen zu definieren. In Lösung bestätigte die Analyse der EPR Spektren der Biradikale die starke Austauschwechselwirkung J zwischen den Radikalfragmenten über die Kopplungseinheiten (J >> an, an ist die Stickstoffhyperfeinkopplungskonstante). Dies wurde weiter unterstützt durch die Beobachtungen in gefrorener Lösung über die Nullfeldaufspaltungen und verbotenen Halbfeldübergänge (Δms = 2). Die Temperaturabhängigkeiten der Δms = 2 - EPR Signale wurden bis herunter auf 4 K gemessen und das exakte Vorzeichen und die Größe von J ermittelt. Diese Arbeit unterstreicht die Möglichkeit über synthetische Chemie eine Feineinstellung der „through bond“ Austauschwechselwirkung zwischen verwandten pi- und sigma- konjugierten Heterozyklen zu erreichen, in denen der S = 1 Grundzustand angenommen wird. Zusätzlich zeigten diese Resultate, dass die Übertragung der Spinpolarisation durch verschiedene Koppler sehr effektiv war.

Method development using ICP-MS and LA-ICP-MS and their application in environmental and material science

Within this PhD thesis several methods were developed and validated which can find applicationare suitable for environmental sample and material science and should be applicable for monitoring of particular radionuclides and the analysis of the chemical composition of construction materials in the frame of ESS project. The study demonstrated that ICP-MS is a powerful analytical technique for ultrasensitive determination of 129I, 90Sr and lanthanides in both artificial and environmental samples such as water and soil. In particular ICP-MS with collision cell allows measuring extremely low isotope ratios of iodine. It was demonstrated that isotope ratios of 129I/127I as low as 10-7 can be measured with an accuracy and precision suitable for distinguishing sample origins. ICP-MS with collision cell, in particular in combination with cool plasma conditions, reduces the influence of isobaric interferences on m/z = 90 and is therefore well-suited for 90Sr analysis in water samples. However, the applied ICP-CC-QMS in this work is limited for the measurement of 90Sr due to the tailing of 88Sr+ and in particular Daly detector noise. Hyphenation of capillary electrophoresis with ICP-MS was shown to resolve atomic ions of all lanthanides and polyatomic interferences. The elimination of polyatomic and isobaric ICP-MS interferences was accomplished without compromising the sensitivity by the use of a high resolution mode as available on ICP-SFMS. Combination of laser ablation with ICP-MS allowed direct micro and local uranium isotope ratio measurements at the ultratrace concentrations on the surface of biological samples. In particular, the application of a cooled laser ablation chamber improves the precision and accuracy of uranium isotopic ratios measurements in comparison to the non-cooled laser ablation chamber by up to one order of magnitude. In order to reduce the quantification problem, a mono gas on-line solution-based calibration was built based on the insertion of a microflow nebulizer DS-5 directly into the laser ablation chamber. A micro local method to determine the lateral element distribution on NiCrAlY-based alloy and coating after oxidation in air was tested and validated. Calibration procedures involving external calibration, quantification by relative sensitivity coefficients (RSCs) and solution-based calibration were investigated. The analytical method was validated by comparison of the LA-ICP-MS results with data acquired by EDX.

Untersuchung zur Bestimmung quantitativer Parameter der Lungenventilation mittels CT und MRT

Die zuverlässige Berechnung von quantitativen Parametern der Lungenventilation ist für ein Verständnis des Verhaltens der Lunge und insbesondere für die Diagnostik von Lungenerkrankungen von großer Bedeutung. Nur durch quantitative Parameter sind verlässliche und reproduzierbare diagnostische Aussagen über den Gesundheitszustand der Lunge möglich. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue quantitative Verfahren zur Erfassung der Lungenventilation basierend auf der dynamischen Computer- (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT) entwickelt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Frage untersucht, ob das Aufblähen der Lunge in gesunden Schweinelungen und Lungen mit Akutem Lungenversagen (ARDS) durch einzelne, diskrete Zeitkonstanten beschrieben werden kann, oder ob kontinuierliche Verteilungen von Zeitkonstanten die Realität besser beschreiben. Hierzu wurden Serien dynamischer CT-Aufnahmen während definierter Beatmungsmanöver (Drucksprünge) aufgenommen und anschließend aus den Messdaten mittels inverser Laplace-Transformation die zugehörigen Verteilungen der Zeitkonstanten berechnet. Um die Qualität der Ergebnisse zu analysieren, wurde der Algorithmus im Rahmen von Simulationsrechnungen systematisch untersucht und anschließend in-vivo an gesunden und ARDS-Schweinelungen eingesetzt. Während in den gesunden Lungen mono- und biexponentielle Verteilungen bestimmt wurden, waren in den ARDS-Lungen Verteilungen um zwei dominante Zeitkonstanten notwendig, um die gemessenen Daten auf der Basis des verwendeten Modells verlässlich zu beschreiben. Es wurden sowohl diskrete als auch kontinuierliche Verteilungen gefunden. Die CT liefert Informationen über das solide Lungengewebe, während die MRT von hyperpolarisiertem 3He in der Lage ist, direkt das eingeatmete Gas abzubilden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde zeitlich hochaufgelöst das Einströmen eines 3He-Bolus in die Lunge erfasst. Über eine Entfaltungsanalyse wurde anschließend das Einströmverhalten unter Idealbedingungen (unendlich kurzer 3He-Bolus), also die Gewebeantwortfunktion, berechnet und so eine Messtechnik-unabhängige Erfassung des Einströmens von 3He in die Lunge ermöglicht. Zentrale Fragestellung war hier, wie schnell das Gas in die Lunge einströmt. Im Rahmen von Simulationsrechnungen wurde das Verhalten eines Entfaltungsalgorithmus (basierend auf B-Spline Repräsentationen) systematisch analysiert. Zusätzlich wurde ein iteratives Entfaltungsverfahren eingesetzt. Aus zeitlich hochaufgelösten Messungen (7ms) an einer gesunden und einer ARDS-Schweinelunge konnte erstmals nachgewiesen werden, dass das Einströmen in-vivo in weniger als 0,1s geschieht. Die Ergebnisse zeigen Zeitkonstanten im Bereich von 4ms–50ms, wobei zwischen der gesunden Lungen und der ARDS-Lunge deutliche Unterschiede beobachtet wurden. Zusammenfassend ermöglichen daher die in dieser Arbeit vorgestellten Algorithmen eine objektivere Bestimmung quantitativer Parameter der Lungenventilation. Dies ist für die eindeutige Beschreibung ventilatorischer Vorgänge in der Lunge und somit für die Lungendiagnostik unerlässlich. Damit stehen quantitative Methoden für die Lungenfunktionsdiagnostik zur Verfügung, deren diagnostische Relevanz im Rahmen wissenschaftlicher und klinischer Studien untersucht werden kann.

Aktivierung von Hämocyanin zur Tyrosinase

Ziel der Arbeit war die enzymatische Aktivierung von Cheliceraten-Hämocyanin zur Erforschung ihrer Phenoloxidase-Aktivität. Hierzu wurden zwei Hämocyanine in vergleichenden Untersuchungen herangezogen: Das bekannte 24-mer aus der Spinne Eurypelma californicum und das ebenfalls 24-mere Hämocyanin des Skorpions Pandinus imperator, dessen Struktur hier aufgeklärt wurde. Elektronenmikroskopisch und in der dynamischer Lichtstreuung sind sich beide Hämocyanine sehr ähnlich und sedimentieren bei analytischer Ultrazentrifugation ebenfalls in gleicher Weise (Sedimentationskoeffizient von 37 S (S20, W)). Durch Dissoziation im alkalischen Milieu gewinnt man bis zu zwölf Untereinheiten, von denen sich neun immunologisch unterscheiden lassen. Das absorptionsspektroskopische Verhalten von P. imperator- und E. californicum-Hämocyanin sowie Sekundärstrukturanalyse mittels CD-Spektroskopie ist nahezu identisch. Die Stabilität des Hämocyanins gegenüber Temperatur und Denaturierungsmitteln wurde mit Circulardichroismus- und Fluoreszenzspektroskopie sowie durch die enzymatische Aktivität untersucht. Erstmals konnten die Hämocyanine von P. imperator und E. californicum nicht nur zu einer stabilen Diphenoloxidase umgewandelt werden, sondern auch eine Monophenolhydroxylase-Aktivität induziert und reguliert werden. Für letztere Aktivität ist dabei die Präsenz von Tris- oder Hepes-Puffer wesentlich. Während sich die Monophenolhydroxylase-Aktivität nur auf Ebene der oligomeren Zustände beobachten lässt, erkennt man bei den isolierten Untereinheiten-Typen lediglich eine Diphenoloxidase-Aktivität. Bei dem Spinnen-Hämocyanin zeigen die Untereinheiten bc die stärkste katalytische Aktivität auf, bei P. imperator-Hämocyanin findet man drei bis vier Untereinheiten, die enzymatisch aktiv sind. Die Aktivierung mit SDS liefert den Hinweis, dass die Quartärstruktur in eine andere Konformation gebracht und nicht durch SDS denaturiert wird. Zugabe von Mg2+ reguliert die Phenoloxidase-Aktivität und verschiebt bei P. imperator-Hämocyanin die enzymatische Aktivität zugunsten der Diphenoloxidase. Mit keiner der zur Verfügung stehenden Methoden konnte jedoch ein Konformationsübergang eindeutig nachgewiesen werden. Die Stabilität scheint durch die niedrigen SDS-Konzentrationen nicht beeinträchtigt zu werden. Die sehr lange “Verzögerungsphase“ bei der Monophenolhydroxylase-Aktivität konnte durch Zugabe von katalytischem Diphenol drastisch verkürzt werden, was ein Hinweis auf die echte Tyrosinase-Aktivität des aktivierten Hämocyanins ist. Ein in vivo-Aktivator konnte bis jetzt noch nicht gefunden werden. Trotzdem scheinen die Hämocyanine in der Immunologie von Cheliceraten eine bedeutende Rolle zu spielen, indem sie die Rolle der Tyrosinasen / Phenoloxidasen beziehungsweise Catecholoxidasen übernehmen, die bei Cheliceraten nicht vorkommen. Weitere Möglichkeiten des Cheliceraten-Immunsystems, eindringende Fremdorganismen abzuwehren, wurden untersucht. Das Fehlen einer ´echten` Phenoloxidase-Aktivität bei den Cheliceraten, mit der Fähigkeit, sowohl mono- als auch diphenolische Substrate umzusetzen, stützt die Hypothese, dass aktiviertes Hämocyanin in vivo an die Stelle der Phenoloxidase tritt.

Generierung leicht dispergierbarer Inhalationspulver mittels Sprühtrocknung

Das Ziel dieser Arbeit besteht darin, die Möglichkeiten der Sprühtrocknung für die Generierung von Inhalationspulvern zur Therapie von Lungenkrankheiten zu nutzen. Die Erzeugung von physikalisch stabilen und leicht dispergierbaren Partikeln steht hierbei im Vordergrund. Aufgrund von physiko-chemischen Untersuchungen (Glasübergangstemperatur, Fragilität, Relaxationsverhalten, Hygroskopizität) unterschiedlicher amorpher Hilfsstoffe (Lactose, Raffinose, Dextrane, Cyclodextrine) ist für Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin das größte Potential für die Stabilisierung eines Wirkstoffes innerhalb einer amorphen Matrix erkennbar. Sprühgetrocknete Partikel weisen im Vergleich zu strahlgemahlenen Partikeln günstigere Dispergier- und Depositionseigenschaften auf. Dies ist vorrangig auf größere Berührungsflächen zwischen strahlgemahlenen Partikeln zurückzuführen. Kugelförmige sprühgetrocknete Partikel besitzen dagegen aufgrund einer punktförmigen Berührung geringere Haftkräfte. Versuche mit unterschiedlich stark gefalteten Partikeloberflächen weisen auf geringere Haftkräfte hin, wenn sich die Partikel an Stellen geringerer Krümmungsradien berühren. Dispergierversuche in einer definierten Rohrströmung (Deagglomerator) lassen auf einen kaskadenartigen Agglomeratzerfall schließen. Durch Sprüheinbettung unterschiedlicher Modellwirkstoffe (Salbutamolsulfat, Ipratropiumbromid, Budesonid) in Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin konnten sowohl Einzelformulierungen als auch eine Kombinationsformulierung mit allen drei Wirkstoffen erzeugt werden. Diese weisen bei einem Wirkstoffgehalt bis max. 14% selbst nach vierwöchiger Offenlagerung bei 40°C und 75% r.F. keine bzw. nur geringfügige Veränderungen in der „Fine Particle Dose“ (FPD) auf. Die „Fine Particle Fraction“ (FPF) liegt bei diesen Formulierungen im Bereich von 40% bis 75%. In Verbindung mit einem geeigneten Pack- bzw. Trockenmittel, ist hierbei mit einer physikalischen Stabilität zu rechnen, die eine sinnvolle Produktlaufzeit eines Inhalationspulvers ermöglicht. Formulierungen mit höheren Wirkstoffkonzentrationen zeigen dagegen stärkere Veränderungen nach Stresslagerung. Als Beispiel einer kristallinen Sprühtrocknungsformulierung konnte ein Pulver bestehend aus Mannitol und Budesonid erzeugt werden.

Imine von Formyl-[2.2]paracyclophanen und ihre Anwendung in der enantioselektiven Katalyse

Kohlenhydrate wurden bislang nur selten zur Darstellung chiraler Liganden verwendet. Sie gelten als zu polyfunktionell und konformativ zu flexibel, um daraus mit vertretbarem Aufwand Liganden zu synthetisieren, die die Anforderungen an ein leistungsfähiges Katalysatorsystem - die spezifische Komplexierung des Metalls in einer konformativ möglichst rigiden Umgebung - erfüllen.rnDas Element der planaren Chiralität erwies sich in vielen asymmetrischen, katalytischen Prozessen als entscheidend für die Erzielung hoher Enantioselektivitäten.rnDie vorliegende Arbeit baut auf den Kohlenhydratliganden-Synthesen mit Glycosylaminen auf, die über geeignete komplexierende Zentren verfügen, um damit andere als die bisher mit Kohlenhydraten bekannten enantioselektiven Katalysen durchführen zu können. Zur Synthese stickstoffhaltiger chiraler Verbindungen haben sich besonders perpivaloylierte Glycosylamine vom Typ des 2,3,4,6-Tetra-O-pivaloyl-β-D-galactopyranosylamins bewährt. Im Rahmen dieser Dissertation wurden Schiff-Basen aus pivaloyliertem Galactosylamin bzw. verschiedenen anderen Galactosylamin-Bausteinen als chiralem Rückgrat, und einem Aldehyd auf der Basis von planar chiralem [2.2]Paracyclophan dargestellt. Die neuen N-Galactosylimine wurden außerdem in asymmetrischen Ugi-Reaktionen und in Tandem Mannich-Michael-Reaktionen zu N-Galactosyl-dehydropiperidinonen untersucht. Bei der Spaltung der dargestellten N-Galactosylimine von Paracyclophan-aldehyden unter mineralsauren Bedingungen sollten die entsprechenden mono- und di-substituierten Formyl- [2.2]paracyclophane in enantiomerenreiner Form erhalten werden. Die erhaltenen Verbindungen wurden als potentielle N,O-Liganden in der asymmetrischen Strecker Reaktion, in die enantioselektiven Epoxidierungen und in der Addition von Diethylzink an aromatische und aliphatische Aldehyde untersucht.rn

Spinpolarisierte Rastertunnelmikroskopie magnetischer Nanostrukturen am Beispiel von bcc-Co/Fe(110), Fe/Mo(110) und Kupfer-Phthalocyanin/Fe(110)

In dieser Arbeit werden, nach einer Einführung in die spinpolarisierte Rastertunnelmikroskopie und -spektroskopie als experimentelle Methode zur Untersuchung magnetischer Nanostrukturen, Ergebnisse zur spinpolarisierten elektronischen Struktur in Abhängigkeit von der Kristallstruktur am Beispiel ultradünner Co-Schichten sowie in Abhängigkeit von der Magnetisierungsrichtung für ultradünne Fe-Schichten vorgestellt. Hochaufgelöste Messungen zeigen die ortsabhängige Spinpolarisation auf einem einzelnen Kupfer-Phthalocyanin Molekül. rnrnKobalt wurde durch pseudomorphes Wachstum auf den (110)-Oberflächen der kubisch raumzentrierten Metalle Chrom und Eisen deponiert. Im Unterschied zu früheren Berichten in der Literatur lassen sich nur zwei Lagen Co in der kubisch raumzentrierten (bcc) Ordnung stabilisieren. Die bcc-Co Schichten auf der Fe(110)-Oberfläche zeigen keine Anzeichen von epitaktischen Verzerrungen. rnDickere Schichten rekonstruieren in eine dicht gepackte Struktur (hcp/fcc). Durch die bcc Ordnung wird die Spinpolarisation von Kobalt auf P=62% erhöht (hcp-Co: P=45%). rnrnDie temperaturabhängige Spinreorientierung (SRT) ultradünner Filme Fe/Mo(110) wurde mit spinpolarisierter Spektroskopie untersucht. Eine Neuausrichtung der Magnetisierung aus der senkrechten [110]-Achse in die in der Ebene liegenden [001]-Achse wird bei T=(13,2+-0,5)K festgestellt, wobei es sich um einen diskontinuierlichen Reorientierungsübergang handelt, d.h. die freie Energie weist innerhalb eines bestimmten Temperaturbereichs gleichzeitig zwei Minima auf. Weiterhin wird in der Mono- und Doppellage Fe/Mo(110 eine Abhängigkeit der elektronischen Struktur von der Ausrichtung der magnetisch leichten Achse und von der Magnetisierung beobachtet. rnrnDie Untersuchung des spinpolarisierten Ladungstransports durch ein Kupfer-Phthalocyanin-Molekül auf der Fe/Mo(110) Oberfläche liefert einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis des Spintransports an der Grenzfläche zwischen Metall und organischem Molekül. Die HOMO-LUMO-Energielücke des freien Moleküls wird durch die Wechselwirkung mit der Metalloberfläche mit Grenzflächenzuständen gefüllt. Diese Zustände reduzieren die Spinpolarisation des durch das Molekül fließenden Tunnelstroms durch einen zusätzlichen unpolarisierten Strombeitrag um einen Faktor zwei. Spinpolarisierte hybridisierte Grenzflächenzustände mit größerem Abstand zur Fermi-Energie führen in Abhängigkeit von der Position auf dem Molekül zu weiteren Beiträgen zur effektiven Spinpolarisation. Diese Untersuchungen belegen die Möglichkeit einer effektiven Spininjektion in organische Halbleiter und damit das Potential dieser Materialien für die weitere Entwicklung von Spintronik-Bauteilen.

Amidverknüpfte Ferrocene - schaltbare molekulare Drähte und Sensoren

In dieser Arbeit werden Synthesen und Eigenschaften von Verbindungen mit einer oder mehreren Ferrocen- bzw. Biferroceneinheiten beschrieben, die über Amid-, Anhydrid- oder Harnstoff-Funktionen verknüpft oder mittels Amidfunktion an α-Aminosäurederivate gebunden sind. Als Zentralbausteine dienen die künstlichen Aminosäuren 1’-Aminoferrocen-1-carbonsäure (Fca) bzw. 1’-Aminobiferrocen-1-carbonsäure (Bfca). Die Ferroceneinheit agiert als redoxschaltbares Gelenk, die Amidfunktion ermöglicht die Ausbildung von Sekundärstrukturen und die Bindung von Anionen. Das redoxschaltbare „Multiwellenlängen“-Sensorpaar [Dansyl-Ala-Fca-Ala-CH2-Naphthyl]0/+ ist in der Lage, insgesamt sieben Anionen aufgrund von sechs einfach zu erhaltenden optischen Messwerten eindeutig zu diskriminieren. Die Vorzugskonformation des neutralen Rezeptors mit intramolekularen Wasserstoffbrücken wird mittels X-Ray, NMR- und DFT-Methoden im Festkörper, in Lösung und in der Gasphase bestimmt. Die oligomeren Fca-Verbindungen SG-Fcan-HN-Fc (SG = Boc, Fmoc; n = 1, 2) und SG-Fca2-OMe (SG = Boc, Fmoc) werden mittels Peptidkupplung in Lösung hergestellt, Fmoc-Fca3-Gly-OMe, Fmoc-Fcan-OMe (n = 3-5) und Fmoc-Fca4-NH2 dagegen durch ein neu entwickeltes Festphasensynthese-Protokoll. Die amidverknüpften Verbindungen bilden eine „Zick-Zack“-Struktur mit 1,2’-Konformation der Fca-Einheiten und achtgliedrigen intramolekularen Wasserstoffbrücken-Ringen, wie durch X-Ray, 2D-NMR-, DFT-Methoden und Dipolmoment-Bestimmung gezeigt wird. Elektrochemische Experimente belegen eine elektronische Wechselwirkung der Eisenzentren. Die gemischt-valenten Verbindungen zeichnen sich durch IVCT-Banden im nahen Infrarot aus. Die elektronische Kopplungskonstante beträgt Hab ≈ 145-215 cm–1 für einen einzelnen FeII/FeIII-Übergang und belegt die Zugehörigkeit der Verbindungen zur Robin-Day-Klasse II. Im Festkörper sind die Valenzen gemäß Mößbauerspektren lokalisiert. Die vollständig oxidierten Verbindungen liegen nach DFT-Rechnungen nicht mehr in einer „Zick-Zack“-Struktur, sondern in einer gestreckten Konformation vor. Als Nebenprodukte bei der Amidkupplung werden die Anhydride SG-(Fca)2O (SG = Ac, Boc, Fmoc) isoliert. Diese zählen aufgrund des Fehlens einer IVCT-Bande zur Klasse I-II. Die ferrocenyloge Bfca wird in Form der N- und C-geschützten Bfca auf zwei Wegen synthetisiert. Schlüsselschritte stellen die Cu(II)-vermittelte Homokupplung bzw. die Pd-katalysierte Stille-Kupplung dar. Bfca und die amid- und harnstoffverknüpften Bis-Bfca-Verbindungen besitzen keine nachweisbare Vorzugskonformation in Lösung. Die gemischt-valenten Bfca-Kationen zeigen eine IVCT-Bande (Hab ≈ 300-600 cm–1) und gehören eher zur Klasse II-III. Die gemischt-valenten Verbindungen des als Nebenprodukt isolierten Tetraferrocenylstannans Sn[Fn(COOMe)4] (Fn = 1,1’-Ferrocenylen) mit einatomiger σ-Brücke zwischen den Ferroceneinheiten, zeigen IVCT-Banden im NIR-Spektrum und gehören somit zur Klasse II. Die elektronischen Kopplungen in Sn[Fn(COOMe)4]+/2+ betragen Hab ≈ 145 und 220 cm–1.

Nachweis und Charakterisierung der Ketocarotinoidakkumulation in Zygosporen des Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii

Ketocarotinoide sind in den Dauerstadien vieler Grünalgen anzutreffen und aufgrund ihres hohen antioxidativen Potentials vermutlich von großer Bedeutung für deren Überleben unter ungünstigen Umweltbedingungen. Daneben ist die Aufnahme von Ketocarotinoiden im Zuge der Nahrungskette für verschiedene Tiere lebensnotwendig. Trotz zahlreicher Untersuchungen des Biosynthesewegs der Ketocarotinoide, vorwiegend in der Grünalge Haematococcus pluvialis, sind viele grundlegende Aspekte der Synthese nicht verstanden. Dazu zählt neben dem genauen Reaktionsmechanismus des ketolierenden Enzyms ß-Carotin-Ketolase (BKT) vor allem der noch nicht aufgeklärte Zusammenhang zwischen Lipidsynthese und Ketocarotinoidakkumulation. Nach der Entdeckung eines zur BKT aus H. pluvialis homologen Gens in einer EST-Datenbank des Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii wurden im Rahmen der vorliegenden Forschungsarbeit die als orange-rot beschrieben Zygosporen von C. reinhardtii als mögliches ketocarotinoidhaltiges Zellstadium untersucht. Dabei wurden für C. reinhardtii erstmals Ketocarotinoide in Konzentrationen bis zu einem Femtomol pro Zelle nachgewiesen und mittels HPLC-Analytik, chemischer Derivatisierung und Massenspektrometrie zweifelsfrei identifiziert. Es wurden, in aufsteigender Quantität, drei Ketocarotinoide detektiert: Canthaxanthin, Astaxanthin und 4-Ketolutein. Letzteres wurde bisher selten in anderen ketocarotinoidakkumulierenden Organismen beschrieben und stellt, im Gegensatz zu den vom ß-Carotin abgeleiteten Pigmenten Astaxanthin und Canthaxanthin, ein Pigment des α-Carotin-Zweiges dar. Astaxanthin und 4-Ketolutein wurden vor allem in Form von Pigment-Fettsäureestern nachgewiesen. Mit Hilfe von Paarungsansätzen mit der lor1-Mutante, die keine α-Carotinoide synthetisieren kann, und Vergleichen mit Ketocarotinoiden aus H. pluvialis konnte gezeigt werden, dass 4 Ketolutein nur als Monoacylester in der Alge vorliegt, während Astaxanthin sowohl als Monoacyl- wie auch als Diacylester anzutreffen ist. Ketocarotinoide wurden innerhalb der ersten 14 Tage der Zygotenreife gebildet. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen der Zygoten dokumentierten, dass damit ein starker Umbau der Zelle einherging, der sich vor allem in der Reduktion des Chloroplasten und der Bildung von Lipidtröpfchen darstellte. Letztere nahmen bei reifen Zygosporen den größten Teil des Zelllumens ein und wurden mittels dünnschichtchromatografischer Analysen als Neutralfette identifiziert. Der sinkende Zellgehalt an Carotinoiden im Zuge der Zygosporenreifung und Inhibitorexperimente an reifenden Zygoten mittels Norflurazon zeigten, dass für die Ketocarotinoidakkumulation keine Neusynthese von Carotinoiden nötig ist und lassen die Hypothese zu, dass C. reinhardtii die im Zuge der Chloroplastenreduktion freigesetzten Photosynthese-Carotinoide als Substrate für die Ketocarotinoidsynthese verwendet. Physiologische Bedeutung könnte den Ketocarotinoiden vor allem beim Schutz der Speicherlipide vor Peroxidation durch reaktive Sauerstoffspezies zukommen. Diese Reservestoffe stellen die Energieversorgung während des Auskeimens der Zellen sicher. Durch den im Rahmen der vorliegenden Forschungsarbeit dokumentierten Nachweis der Ketocarotinoidakkumulation in C. reinhardtii können die Ketocarotinoidsynthese und vor allem der Zusammenhang von Lipid- und Ketocarotinoidakkumulation zukünftig mit Hilfe der für diesen Modellorganismus vorliegenden umfangreichen molekulargenetischen Methoden detailliert untersucht werden.

Kontrolle der Morphologie und Polymorphie von Calciumcarbonat durch monomere und polymere ionische Additive

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von monomeren und polymeren ionischen Additiven auf die Kristallisation von Calciumcarbonat untersucht. Dabei wurden die Wirkungen der Additive auf die Morphologie und auf die Phasenzusammensetzung (relative Verhältnisse der Calciumcarbonat-Polymorphe Calcit, Aragonit und Vaterit) sowohl experimentell als auch theoretisch im Sinne von Molecular Modelling studiert.rnrnMit Hilfe der monomeren Additive, wie z.B. Monocarbonsäuren, konnten grundlegende Mechanismen bei der Interaktion von Additiven mit dem wachsenden Kristall aufgeklärt werden. Auch der Einfluss der Stereochemie auf die Phasenselektion des Calciumcarbonats konnte detailliert untersucht werden. Die polymeren ionischen Additive vertiefen die Untersuchungen zu den bei den monomeren Additiven gefundenen Mechanismen. Auch hier konnte der Einfluss der Stereochemie studiert werden.rnrnAußerdem konnten verschiedene kooperative Wechselwirkungen der Polymere mit dem Kristall bzw. der zugrunde liegenden Oberfläche (im Sinne von self assembled-monolayers, SAM) gefunden und erklärt werden.

Identifizierung und Quantifizierung der Ketocarotinoide in Dauerstadien von Grünalgen und Ketocarotinoidbiosynthese im Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii

Grünalgen bilden zur Überdauerung schlechter Umweltbedingungen Ruhestadien, die sich durch Ausbildung einer festen Zellwand, die Reduktion des Plastiden und die starke Akkumulation von Speicherfetten und Ketocarotinoiden im Zytosol auszeichnen. Obwohl Ketocarotinoide in Grünalgen seit über vierzig Jahren beforscht werden, gab es hierzu noch wenige molekularbiologische Untersuchungen. Im Vorfeld meiner Promotion wurde durch unsere Arbeitsgruppe entdeckt, dass auch der molekular gut zugängliche Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii im Zygotenstadium große Mengen an Ketocarotinoiden bildet. Neben dem zu erwartenden Ketocarotinoid Astaxanthin fanden wir große Mengen des bisher nur in einer Grünalge beschriebenen 4-Ketoluteins. Vorversuche ließen die Vermutung aufkommen, dass dieses Pigment bei der Untersuchung der Pigmentausstattung in Dauerstadien von vielen Grünalgen bisher übersehen wurde. rnIn der vorliegenden Arbeit wurde daher zunächst die Pigmentzusammensetzung von Dauerstadien der bereits gut untersuchten Grünalgen Muriella zofingiensis und Scenedesmus rubescens durch Vergleich mit dem Ketocarotinoidmuster aus Dauerstadien von C. reinhardtii und Fritschiella tuberosa reevaluiert und dabei erstmals das Vorkommen signifikanter Mengen an 4-Ketolutein nachgewiesen. Außerdem zeigte sich, dass die als bisheriger Modellorganismus der Ketocarotinoidbiosynthese in Grünalgen sehr gut untersuchte Alge Haematococcus pluvialis eher eine Ausnahme darstellt, da ihre Dauerstadien als einzige der hier untersuchten Algen nur minimale Mengen von 4 Ketolutein aufwiesen. Diese Beobachtungen machen es sehr wahrscheinlich, dass die Fähigkeit zur Bildung von 4-Ketolutein unter den Grünalgen wesentlich weiter verbreitet ist als bisher angenommen. Das sekundäre Carotinoid 4-Ketolutein kam in den Dauerstadien der Grünalgen neben seiner freien Form ausschließlich als Monoacylester vor, im Gegensatz zu Astaxanthin, das als mono- und diacylierte Form auftrat. rnÜber die Analyse der Pigmentausstattung hinaus konnten die entscheidenden Schritte des Synthesewegs der Ketocarotinoide in C. reinhardtii durch funktionelle Charakterisierung der beteiligten Enzyme in Bakterien aufgeklärt werden. Als Basis für die Charakterisierungen wurde ein umfangreiches Portfolio von carotinogenen E. coli-Bakterien etabliert, darunter α Carotin und Lutein produzierende Stämme, die bisher nicht zur Verfügung standen. Das wurde durch die Klonierung der Lycopinzyklase (OluLCY) aus der Grünalge Ostreococcus lucimarinus möglich, die eine Sonderolle unter den Zyklasen einnimmt, da sie die Lycopin-β-Zyklase und Lycopin-ε-Zyklase in einem Fusionsenzym vereint. Vorteile dieses Fusionsenzyms sind die Expressionskontrolle durch nur einen Promotor und die weitgehend konstante Stöchiometrie seiner Produkte α-Carotin und β-Carotin, was die OluLCY für die biotechnologische Anwendung prädestiniert.rnDie funktionelle Charakterisierung der Carotinoidbiosyntheseenzyme aus C. reinhardtii umfasste das Schlüsselenzym der Ketocarotinoidbiosynthese, die β-Carotin-Ketolase (BKT), sowie die Carotinoid-Hydroxylasen CHYB, CYP97A5 und CYP97C3. Dabei wurde für das BKT-Enzym aus C. reinhardtii nachgewiesen, dass es nicht nur die Ketolierung von β Carotin zu Canthaxanthin und von Zeaxanthin zu Astaxanthin, sondern auch die Bildung der von α-Carotin abgeleiteten Ketocarotinoide wie 4-Keto-α-Carotin und 4 Ketolutein katalysieren kann.rn

Interactions of inhaled nanoparticles with the alveolar-capillary barrier of the human respiratory tract

In dieser Arbeit wurden zytotoxische Effekte sowie die inflammatorische Reaktionen des distalen respiratorischen Traktes nach Nanopartikelexposition untersucht. Besondere Aufmerksamkeit lag auch auf der Untersuchung unterschiedlicher zellulärer Aufnahmewege von Nanopartikeln wie z.B. Clathrin- oder Caveolae-vermittelte Endozytose oder auch Clathrin- und Caveolae-unabhängige Endozytose (mit möglicher Beteiligung von Flotillinen). Drei unterschiedliche Nanopartikel wurden hierbei gewählt: amorphes Silica (aSNP), Organosiloxan (AmorSil) und Poly(ethyleneimin) (PEI). Alle unterschiedlichen Materialien gewinnen zunehmend an Interesse für biomedizinische Forschungsrichtungen (drug and gene delivery). Insbesondere finden aSNPs auch in der Industrie vermehrt Anwendung, und stellen somit ein ernstzunehmendes Gesundheitsrisiko dar. Dieser wird dadurch zu einem begehrten Angriffsziel für pharmazeutische Verabreichungen von Medikamenten über Nanopartikel als Vehikel aber bietet zugleich auch eine Angriffsfläche für gesundheitsschädliche Nanomaterialien. Aus diesem Grund sollten die gesundheitsschädigenden Risiken, sowie das Schicksal von zellulär aufgenommenen NPs sorgfältig untersucht werden. In vivo Studien an der alveolaren-kapillaren Barriere sind recht umständlich. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit ein Kokulturmodel benutzt, dass die Alveolar-Kapillare Barrier in vivo nachstellt. Das Model besteht aus dem humanen Lungenepithelzelltyp (z.B. NCI H441) und einem humanen microvasculären Endothelzelltyp (z.B. ISO-HAS-1), die auf entgegengesetzten Seiten eines Transwell-Filters ausgesät werden und eine dichte Barriere ausbilden. Die NP Interaktion mit Zellen in Kokultur wurde mit denen in konventioneller Monokultur verglichen, in der Zellen 24h vor dem Experiment ausgesät werden. Diese Studie zeigt, dass nicht nur die polarisierte Eigenschaft der Zellen in Kokultur sondern auch die unmittelbare Nähe von Epithel und Endothelzelle ausschlaggebend für durch aSNPs verursachte Effekte ist. Im Hinblick auf inflammatorische Marker (sICAM, IL-6, IL8-Ausschüttung), reagiert die Kokultur auf aSNPs empfindlicher als die konventionelle Monokultur, wohingegen die Epithelzellen in der Kokultur auf zytotoxikologischer Ebene (LDH-Ausschüttung) unempfindlicher auf aSNPs reagierten als die Zellen in Monokultur. Aufnahmestudien haben gezeigt, dass die Epithelzellen in Kokultur entschieden weniger NPs aufnehmen. Somit zeigen die H441 in der Kokultur ähnliche epitheliale Eigenschaften einer schützenden Barriere, wie sie auch in vivo zu finden sind. Obwohl eine ausreichende Aufnahme von NPs in H441 in Kokultur erreicht werden konnte, konnte ein Transport von NPs durch die epitheliale Schicht und eine Aufnahme in die endotheliale Schicht mit den gewählten Inkubationszeiten nicht gezeigt werden. Eine Clathrin- oder Caveolae-vermittelte Endozytose von NPs konnte mittels Immunfluoreszenz weder in der Mono- noch in der Kokultur nachgewiesen werden. Jedoch zeigte sich eine Akkumulation von NPs in Flotillin-1 und-2 enthaltende Vesikel in Epithelzellen aus beiden Kultursystemen. Ergebnisse mit Flotillin-inhibierten (siRNA) Epithelzellen, zeigten eine deutlich geringere Aufnahme von aSNPs. Zudem zeigte sich eine eine reduzierte Viabilität (MTS) von aSNP-behandelten Zellen. Dies deutet auf eine Beteiligung von Flotillinen an unbekannten (Clathrin oder Caveolae -unabhängig) Endozytosemechanismen und (oder) endosomaler Speicherung. Zusammenfassend waren die Aufnahmemechanismen für alle untesuchten NPs in konventioneller Monokultur und Kokultur vergleichbar, obwohl sich die Barriereeigenschaften deutlich unterscheiden. Diese Arbeit zeigt deutlich, dass sich die Zellen in Kokultur anders verhalten. Die Zellen erreichen hierbei einen höheren Differenzierungsgrad und eine Zellkommunikation mit anderen relevanten Zelltypen wird ermöglicht. Durch das Einbringen eines dritten relevanten Zelltyps in die Kokultur, des Alveolarmakrophagen (Zelllinie THP-1), welcher die erste Verteidigungsfront im Alveolus bildet, wird diese Aussage weiter bekräftigt. Erste Versuche haben gezeigt, dass die Triplekultur bezüglich ihrer Barriereeigenschaften und IL-8-Ausschüttung sensitiver auf z.B. TNF- oder LPS-Stimulation reagiert als die Kokultur. Verglichen mit konventionellen Monokulturen imitieren gut ausgebildete, multizelluräre Kokulturmodelle viel präziser das zelluläre Zusammenspiel im Körper. Darum liefern Nanopartikelinteraktionen mit dem in vitro-Triplekulturmodel aufschlussreichere Ergebnisse bezüglich umweltbedingter oder pharmazeutischer NP-Exposition in der distalen Lung als es uns bisher möglich war.

Generierung und Charakterisierung tolerogener muriner dendritischer Zellen

Mechanismen der zentralen und der peripheren Toleranz schützen den Körper vor Immunreaktionen gegen körpereigenes Gewebe oder gegen harmlose Umweltantigene. An der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz sind tolerogene Dendritische Zellen (DC) beteiligt. Tolerogene DC können in vitro u.a. mit Hilfe von immunsuppressiven und antiinflammatorischen Substanzen, aber auch durch virale Transduktionen, die zur Denovo- oder Überexpression toleranzassoziierter Moleküle führen, generiert werden. rnDa die Wirkung einiger immunmodulatorischer Substanzen über den intrazellulären sekundären Botenstoff cAMP vermittelt wird, sollte getestet werden, welchen Einfluss eine direkte Erhöhung des intrazellulären cAMP-Niveaus mittels Dibutyryl-cyclo-Adenosin-3´,5´-Mono-Phoshat (db-cAMP) auf die phänotypischen und funktionellen Eigenschaften von BM-DC („bone marrow derived dendritic cells“) hat.rnIm Vergleich zu unbehandelten BM-DC wiesen db-cAMP-DC ein vermindertes T-Zell-Stimulierungs-potenzial auf. Dieses verminderte T-Zell-Stimulierungspotenzial wird teilweise über die Proteinkinase A, nicht aber über Cyclooxygenase-2 (Cox-2) vermittelt. rnAnhand der FACS-Analyse mit DC- und MDSC- („myeloid derived suppressor cells“) spezifischen Markern konnte gezeigt werden, dass es sich bei den db-cAMP-DC um CD11c-positive DC mit einer vergleichsweise niedrigen Expression von MHCII und kostimulatorischen Oberflächenmolekülen handelt. Des Weiteren zeigte sich, dass sie verglichen mit BM-DC eine vermehrte mRNA-Expression der koinhibitorischen Moleküle B7-H1 und LIGHT und der toleranzassoziierten Moleküle FcγRIIB, HO-1 und Cox-2 aufweisen. Mittels ELISA konnte eine gesteigerte Expression der HO-1- und eine moderat gesteigerte PGE2-Synthese beobachtet werden. PGE2 wird mit Hilfe der Cox-2 aus Arachidonsäure gebildet.rnIm Gegensatz zu BM-DC wiesen db-cAMP-DC in beiden Reifungsstadien ein verändertes Zytokinprofil auf: Auf mRNA-Ebene zeigte sich, dass db-cAMP-DC verglichen mit BM-DC vermehrt IL-1RA und IL-10 exprimieren. Dieser Unterschied konnte für IL-10 auch mittels ELISA bestätigt werden. In den Kulturüberständen der stimulierten db-cAMP-DC konnte, im Gegensatz zu denen stimulierter BM-DC, kaum bioaktives IL-12 nachgewiesen werden. rnDb-cAMP-DC induzierten des Weiteren in kokultivierten allogenen T-Zellen ein differenzielles Zytokinprofil: Sie förderten die INFγ- und IL-17-Sezernierung durch T-Zellen, während die IL-5-Sezernierung geringer war, wenn T-Zellen mit stimulierten db-cAMP-DC kokultiviert wurden. Db-cAMP-DC hatten hingegen keinen Einfluss auf die IL-10-Produktion. Außerdem führte eine Kokultur der db-cAMP-DC mit allogenen T-Zellen nicht zu einer gesteigerten Induktion von FoxP3+ Treg. rnIn einem zweiten Ansatz sollte getestet werden ob es möglich ist die murine DC-Linie SP37A3 lentiviral mit dem toleranzassoziierten Oberflächenprotein B7-H3 zu transduzieren. Dies ist von Interesse, da die SP37A3-Zellen einige Vorteile gegenüber BM-DC aufweisen, wie z.B. ihren homogeneren Phänotyp und die Möglichkeit sie in einer Expansionskultur zu halten.rnEs konnte gezeigt werden, dass SP37A3-Zellen als Modell für myeloide DC für die Transduktion mit lentiviralen Partikeln geeignet sind. Hierbei zeigte es sich aber, dass darauf geachtet werden muss, mit konzentriertem Virus zu arbeiten und dass die Reportergen-Expression der Zielzellen über mehr als 3 Tage (mindestens 7 Tage) untersucht werden muss. Nur so kann eine eventuell auftretende Pseudotransduktion erkannt und verhindert werden. Ab einer MOI („multiplicity of infection“) von 50 konnte in SP37A3-Zellen eine Transgen-Expression nachgewiesen werden.rn

Ortsgerichtete Modifikationen von Somatostatin-14 zur Darstellung von maßgeschneiderten Biohybridkonjugaten

Die hochspezifische Funktionalisierung von Proteinen und Peptiden kann durch milde reduktive Spaltung der lösungsmittelzugänglichen Disulfidbrücken und anschließende Rückverbrückung durch den Einbau sogenannter Linkermoleküle über einen konsekutiven Eliminierungs-Additionsprozess verwirklicht werden. Die Erweiterung des Linkerportfolios stellte in erster Instanz die Entwicklung von verschieden funktionalisierten Systemen dar, welche als hochflexible Kernbausteine für den Aufbau komplexer Architekturen dienten. Das Verständnis für die Reaktivität und Reversibilität der Thioladdition an die Mono-und Bissulfone in Abhängigkeit des Substituenten in p-Position konnte durch Variation von Parametern wie Lösungsmittel oder pH-Wert für intelligentes Produktdesign genutzt werden. Heterokonjugate zweier Biomoleküle mit ungepaartem Cystein wurden durch die Kombination von Maleinimid- und Bissulfonchemie innerhalb eines Linkermoleküls realisiert. Polymer-Peptid-Konjugate wurden einerseits über die grafting to Methode durch Modifizierung von Somatostatin mit PEGbissulfonen und anderseits durch grafting from unter Verwendung eines zuvor synthetisierten ATRP-Makroinitiators dargestellt. Multivalente Konjugate konnten durch die Synthese von hochsymmetrischen Tetra- sowie Hexasulfonen und anschließende Umsetzung mit Somatostatin erhalten werden. Die Polyinterkalatorpolymere, die durch lebende radikalische Polymerisation eines Bissulfidmonomers generiert wurden, wurden mit Glutathion umgesetzt. Durch die Interkalation von p-Ethinyl sowie p-Iodmonosulfon in die Disulfidbrücke von Somatostatin konnte erfolgreich gezeigt werden, dass die Rückverbrückung unter Rezyklisierung gelang. Die biologische Integrität wurde durch die Modifikation nicht beeinträchtigt und die erfolgreiche Aufnahme wurde nur bei den rezeptorpositiven Zellen (CAPAN-2) beobachtet. Das artifizielle Iodderivat im Vergleich zum nativen Somatostatin ein erhöhtes Potential zur Apoptoseinduktion. Die Somatostatinderivate präsentierten sich somit als attraktive potentielle Therapeutika.