Modulation der Immunogenität von humanen Nierenzellkarzinomzellen durch stabilen TAP1-Gentransfer

Bei Nierenzellkarzinomen (NZK), wie auch bei vielen anderen Tumoren konnte eine reduzierte Expression der Klasse I Haupthistokompatibilitäts-Komplexe (MHC Klasse I) nachgewiesen werden, die assoziiert sein kann mit der gestörten Expression oder Funktion von Komponenten der Antigenprozessierung. Eine verminderte Erkennung solcher Tumore durch zytotoxische T-Lymphozyten und ein Zusammenhang mit einem Fortschreiten der Erkrankung führte zu der Annahme, daß es sich bei diesen Störungen um "immune escape"-Mechanismen handelt. Um die Bedeutung des heterodimeren Peptidtransporters TAP ("transporter associated with antigen processing") für die Immunogenität von Nierenzellkarzinomen zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals der stabile Gentransfer des humanen TAP1A-Gens in Nierenzellkarzinom-Zellen erfolgreich durchgeführt.
Dies konnte durch die Optimierung der Transfektionsmethode und des verwendeten Plasmid-Vektors erreicht werden. Die Transfektionen wurden mit Hilfe der Rechteck-Impuls-Elektroporation unter spezifischen, in der Arbeit etablierten Bedingungen durchgeführt. Der CMV-regulierte TAP-Expressions-Vektor wurde dahingehend verbessert, daß durch die Einführung einer IRES ("internal ribosomal entry site") Sequenz eine bicistronische m-RNS transkribiert wird, die sowohl das TAP1-Transgen als auch den Neomycin-Selektionsmarker enthält.
Es konnte nach klonaler Selektion eine stabile, aber unter den sieben getesteten Klonen heterogene Transkription der transgenen TAP1-mRNS nachgewiesen werden. In der Protein-Expression zeigten 5/7 der TAP1A-positive Klone eine mindestens zweifache Induktion der TAP1-Expression. In 2/7 dieser TAP1A-positive Klone war die TAP1-Überexpression mit einer Erhöhung der MHC Klasse I-Expression und selektiver Induktion des HLA-A2-Moleküls in der Durchflußzytometrie verbunden. Eine Quantifizierung des Peptidtransportes ergab je nach verwendetem Modellpeptid eine geringe oder gar keine Erhöhung der Transportrate in den TAP1-Transfektanden gegenüber Kontrollzellen. Ebenfalls konnte in Zytotoxizitäts-Analysen mit einer autologen T-Zellinie eine Erhöhung der spezifischen Lyse nicht gezeigt werden. Jedoch wurden im Zellkultur-Überstand dieser Zytotoxizitäts-Analysen bei einigen TAP1A-positive Transfektanden gegenüber mock transfizierten-Kontrollzellen deutlich erhöhte Werte des Tumornekrose-Faktor-alpha (TNF-alpha) gemessen, was als Maß einer T-Zell-Aktivierung gilt. Diese Ergebnisse sind konsistent mit einer ebenfalls deutlich gesteigerten T-Zell-Proliferation in Anwesenheit von TAP1A-positive Transfektanden.
Die alleinige stabile Überexpression von TAP1 in Nierenzellkarzinomzellen kann somit zu einer Modulation der MHC Klasse I-Expression und der T-Zell-Reaktivität führen. Das weist darauf hin, daß eine starke, konstitutive TAP1-Expression eine grundlegende Voraussetzung für eine effiziente Antigenprozessierung und Immunantwort darstellt und die Immuntoleranz gegenüber NZK durch stabilen TAP1-Gentransfer beinflußbar ist. Eine denkbare klinische Anwendung dieser Technik ist die Herstellung einer Tumorantigen-präsentierenden Zellvakzine, die eine T-Zell-Anergie gegenüber NZK durchbrechen könnte.
Schlüsselwörter: TAP, MHC, Antigenprozessierung, Tumorimmunologie, Gentransfer

Immune escape durch Überexpression von HER-2/neu

In Tumoren und Onkogen-transformierten Zellen finden sich häufig Defizienzen in der Expression von Komponenten der MHC Klasse I-Antigenprozessierung, die mit einer verminderten MHC Klasse I-Oberflächenexpression und einer reduzierten Sensitivität der Zellen gegenüber einer ZTL-vermittelten Lyse gekoppelt sein können. Da in den meisten Fällen die reduzierten Expressionsmuster über Zytokine revertiert werden können, werden verschiedene Regulationsmechanismen als Ursache für die Defizienzen postuliert. Auch in Zellen, die den „human epidermal growth factor receptor 2“ (HER-2/neu) überexprimieren, wurden derartige „Immune escape“-Mechanismen identifiziert. Aufgrund der Amplifikation und/oder Überexpression dieses Onkogens in Tumoren, die mit einer schnellen Progression der Erkrankung und einer schlechten Heilungsprognose assoziiert ist, wurden zahlreiche Therapien entwickelt, die auf einer Mobilisierung des Immunsystems gegenüber HER-2/neu oder dessen Blockade durch spezifische Antikörper abzielen. Die bisher jedoch nur unzureichenden Erfolge dieser Therapien könnten ihre Ursache in einer verminderten Immunogenität der HER-2/neu+-Zellen aufgrund von Defizienzen in der MHC Klasse I-Antigenprozessierung haben, weshalb die Untersuchung der molekularen Ursachen dieser Suppression für die Therapie von HER-2/neu+-Tumoren von besonderer Bedeutung ist. In dieser Arbeit wurde anhand eines in vitro-Systems ein HER-2/neu-vermittelter „Immune escape“-Phänotyp charakterisiert und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen untersucht. Hierzu wurden murine, HER-2/neu--NIH3T3-Zellen mit HER-2/neu-transfizierten NIH3T3-Zellen verglichen. Die Untersuchung zeigte, dass die Oberflächenexpression von MHC Klasse I-Antigenen bei einer HER-2/neu-Überexpression vermindert ist. Dies ist assoziiert mit reduzierten Expressionen von LMP2, LMP10, PA28a, PA28b, ERAAP, TAP1, TAP2, und Tapasin, einem blockiertem TAP-Transport und einer fehlenden Sensitivität gegenüber einer ZTL-vermittelten Lyse. Da die analysierten Defekte durch eine Stimulation mit IFN‑g wieder revertiert werden können, wird eine transkriptionelle oder translationelle Regulation der betroffenen Gene durch HER-2/neu postuliert. Aufgrund dieser Ergebnisse ist eine T-Zell-vermittelte Therapie von HER-2/neu+-Tumoren als kritisch anzusehen. Die Untersuchung der Promotoren von TAP1/LMP2, TAP2 und Tapasin ergab geringere und durch IFN‑g-induzierbare Promotoraktivitäten in den HER-2/neu+-Zellen im Vergleich zu den HER-2/neu—-Zellen. Mittels Mutagenese-PCR und Gelretardationsanalysen konnte die Bindung eines Komplexes an zwei E2F- und einer P300-Bindungsstelle im Tapasin-Promotor identifiziert werden, die für die HER-2/neu-vermittelte Hemmung der Tapasin-Promotor­aktivität essentiell ist. Eine Inaktivierung der E2F- und P300-Motve in den TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoren hatte dagegen keinen Einfluss auf die HER-2/neu-vermittelte Blockade der Promotoraktivität. Ein Vergleich der Promotoraktivitäten der HER-2/neu+- mit Ras-transformierten Zellen ergab, dass die TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoren in beiden Zellen supprimiert werden, während der Tapasin-Promotor bei Ras-Transformation nicht beein­trächtigt ist. Der Einsatz von Inhibitoren zeigte, dass die Suppression des Tapasin-Promotors vermutlich über die PLC-g-PKC-Kaskade erfolgt. Dagegen konnte mit Inhibitoren gegen MAPK und PI3Kinase kein vergleichbarer Effekt erzielt werden. Aufgrund dieser Daten wird postuliert, dass HER-2/neu über die Signalkaskade PLC-g–PKC–E2F/P300 die Tapasin-Promotoraktivität supprimiert, wohingegen noch bisher unbekannte Signalkaskaden von HER-2/neu und Ras zu einer Hemmung der TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoraktivität führen. Da die Komplexbildung von E2F und P300 auch im Zellzyklus eine Rolle spielt, wird eine negative Korrelation zwischen Zell-Proliferation und MHC Klasse I-Antigenpräsentation postuliert, die Gegenstand künftiger Studien sein wird.

Generierung und Charakterisierung von rekombinanten Cytomegaloviren mit Punktmutationen in antigenen Peptiden

Die Kontrolle der produktiven Cytomegalovirus- (CMV) Infektion ist von der effizienten Rekonstitution antiviraler CD8 T-Zellen abhängig. Dies führt jedoch nicht zur vollständigen Eliminierung des viralen Genoms aus den Zielorganen, sondern das Virus verbleibt in einem nicht-replikativen Zustand: der Latenz. Es ist bekannt, dass während der Latenz nur ein geringer Anteil latenter mCMV-Genome in der Lunge die Major Immediate Early (MIE) Gene ie1 und ie2 exprimiert, die Latenz aber dennoch bestehen bleibt, weil das differentielle Splicing des primären IE1/3-Transkripts zum Transaktivator-Transkript IE3 nicht erfolgt. Damit war neben der Initiation der IE-Genexpression am MIE-Promotor-Enhancer das IE1/3-Splicing als zweiter molekularer Latenz-Kontrollpunkt identifiziert. Parallel zur Latenz-assoziierten IE1-Genexpression sind in der Lunge aktivierte CD62L-low CD8 T-Zellen mit Spezifität für das immundominante IE1-Peptid 168-YPHFMPTNL-176 angereichert. Dies legte die Hypothese nahe, dass neben der molekularen Kontrolle der Latenz auch eine immunologische Kontrolle, beispielsweise durch IE1-Epitop-spezifische CD8 T-Zellen besteht. Zur Evaluierung dieser Hypothese wurde in der vorliegenden Arbeit mittels BAC-Mutagenese erstmals ein rekombinantes mCMV generiert, in dem das IE1-Peptid durch Punktmutation der C-terminalen MHC-Ankeraminosäure L176A zerstört ist. Dazu musste zunächst die Technik der BAC-Mutagenese herpesviraler Genome (in Anlehnung an die publizierten Arbeiten von Messerle et al., 1997; Borst et al., 1999, 2004; Wagner et al., 1999) in der Arbeitsgruppe etabliert werden. Neben der Funktionsverlust-Mutante (mCMV-IE1-L176A) wurden zur Kontrolle zwei Revertanten (mCMV-IE1-A176L und mCMV-IE1-A176L*) generiert. In letzterer, als Wobble-Revertante bezeichnet, wird wieder die authentische MHC-Ankeraminosäure L eingesetzt, es verbleibt aber ein singulärer Nukleotidaustausch A->T in der Wobble-Position des Codons als Marker zur Unterscheidung zum WT-mCMV zurück. Der immunologische Phänotyp der Funktionsverlust-Mutante, also die funktionelle Auslöschung des antigenen IE1-Peptids im Priming einer CD8 T-Zell-Antwort, entsprach der Erwartung. Entsprechend konnte nach Infektion mit der Funktionsverlust-Mutante keine Reaktivität gegen das IE1-Peptid nachgewiesen werden. In den Revertanten hingegen war die Erkennung des IE1-Peptids wieder hergestellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen weiter, dass die Funktionsverlust-Mutante sowie die Revertanten ohne signifikante Beeinflussung in vitro in permissiven Fibroblasten und in vivo in verschiedenen Geweben replizieren. Wie aktuelle Daten nach Knochenmarktransplantation und Infektion mit der Funktionsverlust-Mutante im Vergleich zu den Revertanten zeigen, ist die Frequenz Latenz-assoziierter IE1-Transkriptionsereignisse bei der Funktionsverlust-Mutante signifikant erhöht. Damit konnte erstmalig der Beweis für eine Kontrolle der Latenz-assoziierten IE1-Genexpression durch IE1-Epitop-spezifische CD8 T-Zellen und damit für eine Präsentation des IE1-Peptids während der Latenz erbracht werden.

Amidverknüpfte Ferrocene - schaltbare molekulare Drähte und Sensoren

In dieser Arbeit werden Synthesen und Eigenschaften von Verbindungen mit einer oder mehreren Ferrocen- bzw. Biferroceneinheiten beschrieben, die über Amid-, Anhydrid- oder Harnstoff-Funktionen verknüpft oder mittels Amidfunktion an α-Aminosäurederivate gebunden sind. Als Zentralbausteine dienen die künstlichen Aminosäuren 1’-Aminoferrocen-1-carbonsäure (Fca) bzw. 1’-Aminobiferrocen-1-carbonsäure (Bfca). Die Ferroceneinheit agiert als redoxschaltbares Gelenk, die Amidfunktion ermöglicht die Ausbildung von Sekundärstrukturen und die Bindung von Anionen. Das redoxschaltbare „Multiwellenlängen“-Sensorpaar [Dansyl-Ala-Fca-Ala-CH2-Naphthyl]0/+ ist in der Lage, insgesamt sieben Anionen aufgrund von sechs einfach zu erhaltenden optischen Messwerten eindeutig zu diskriminieren. Die Vorzugskonformation des neutralen Rezeptors mit intramolekularen Wasserstoffbrücken wird mittels X-Ray, NMR- und DFT-Methoden im Festkörper, in Lösung und in der Gasphase bestimmt. Die oligomeren Fca-Verbindungen SG-Fcan-HN-Fc (SG = Boc, Fmoc; n = 1, 2) und SG-Fca2-OMe (SG = Boc, Fmoc) werden mittels Peptidkupplung in Lösung hergestellt, Fmoc-Fca3-Gly-OMe, Fmoc-Fcan-OMe (n = 3-5) und Fmoc-Fca4-NH2 dagegen durch ein neu entwickeltes Festphasensynthese-Protokoll. Die amidverknüpften Verbindungen bilden eine „Zick-Zack“-Struktur mit 1,2’-Konformation der Fca-Einheiten und achtgliedrigen intramolekularen Wasserstoffbrücken-Ringen, wie durch X-Ray, 2D-NMR-, DFT-Methoden und Dipolmoment-Bestimmung gezeigt wird. Elektrochemische Experimente belegen eine elektronische Wechselwirkung der Eisenzentren. Die gemischt-valenten Verbindungen zeichnen sich durch IVCT-Banden im nahen Infrarot aus. Die elektronische Kopplungskonstante beträgt Hab ≈ 145-215 cm–1 für einen einzelnen FeII/FeIII-Übergang und belegt die Zugehörigkeit der Verbindungen zur Robin-Day-Klasse II. Im Festkörper sind die Valenzen gemäß Mößbauerspektren lokalisiert. Die vollständig oxidierten Verbindungen liegen nach DFT-Rechnungen nicht mehr in einer „Zick-Zack“-Struktur, sondern in einer gestreckten Konformation vor. Als Nebenprodukte bei der Amidkupplung werden die Anhydride SG-(Fca)2O (SG = Ac, Boc, Fmoc) isoliert. Diese zählen aufgrund des Fehlens einer IVCT-Bande zur Klasse I-II. Die ferrocenyloge Bfca wird in Form der N- und C-geschützten Bfca auf zwei Wegen synthetisiert. Schlüsselschritte stellen die Cu(II)-vermittelte Homokupplung bzw. die Pd-katalysierte Stille-Kupplung dar. Bfca und die amid- und harnstoffverknüpften Bis-Bfca-Verbindungen besitzen keine nachweisbare Vorzugskonformation in Lösung. Die gemischt-valenten Bfca-Kationen zeigen eine IVCT-Bande (Hab ≈ 300-600 cm–1) und gehören eher zur Klasse II-III. Die gemischt-valenten Verbindungen des als Nebenprodukt isolierten Tetraferrocenylstannans Sn[Fn(COOMe)4] (Fn = 1,1’-Ferrocenylen) mit einatomiger σ-Brücke zwischen den Ferroceneinheiten, zeigen IVCT-Banden im NIR-Spektrum und gehören somit zur Klasse II. Die elektronischen Kopplungen in Sn[Fn(COOMe)4]+/2+ betragen Hab ≈ 145 und 220 cm–1.

An interferon regulatory factor element controls the major immune modulator of murine cytomegalovirus

Immune modulation by herpesviruses, such as cytomegalovirus, is critical for the establishment of acute and persistent infection confronting a vigorous antiviral immune response of the host. Therefore, the action of immune-modulatory proteins has long been the subject of research, with the final goal to identify new strategies for antiviral therapy.rnIn the case of murine cytomegalovirus (mCMV), the viral m152 protein has been identified to play a major role in targeting components of both the innate and the adaptive immune system in terms of infected host-cell recognition in the effector phase of the antiviral immune response. On the one hand, it inhibits cell surface expression of RAE-1 and thereby prevents ligation of the activating natural killer (NK)-cell receptor NKG2D. On the other hand, it decreases cell surface expression of peptide-loaded MHC class I molecules thereby preventing antigen presentation to CD8 T cells. Ultimately, the outcome of CMV infection is determined by the interplay between viral and cellular factors.rnIn this context, the work presented here has revealed a novel and intriguing connection between viral m152 and cellular interferon (IFN), a key cytokine of the immune system: rnthe m152 promoter region contains an interferon regulatory factor element (IRFE) perfectly matching the consensus sequence of cellular IRFEs.rnThe biological relevance of this regulatory element was first suggested by sequence comparisons revealing its evolutionary conservation among various established laboratory strains of mCMV and more recent low-passage wild-derived virus isolates. Moreover, search of the mCMV genome revealed only three IRFE sites in the complete sequence. Importantly, the functionality of the IRFE in the m152 promoter was confirmed with the use of a mutant virus, representing a functional deletion of the IRFE, and its corresponding revertant virus. In particular, m152 gene expression was found to be inhibited in an IRFE-dependent manner in infected cells. Essentially, this inhibition proved to have a severe impact on the immune-modulatory function of m152, first demonstrated by a restored direct antigen presentation on infected cells for CD8 T-cell activation. Even more importantly, this effect of IRFE-mediated IFN signaling was validated in vivo by showing that the protective antiviral capacity of adoptively-transferred, antigen-specific CD8 T cells is also significantly restored by the IRFE-dependent inhibition of m152. Somewhat curious and surprising, the decrease in m152 protein simultaneously prevented an enhanced activation of NK cells in acute-infected mice, apparently independent of the RAE-1/NKG2D ligand/receptor interaction but rather due to reduced ‘missing-self’ recognition.rnTaken together, this work presents a so far unknown mechanism of IFN signaling to control mCMV immune modulation in acute infection.rnrn

Präklinische Evaluierung von therapeutischer Vakzinierung zur Effizienzsteigerung der adoptiven Immuntherapie von Cytomegalovirus-Erkrankungen

Klinische Manifestationen einer Cytomegalovirus (CMV)-Infektion gefährden den therapeutischen Erfolg der hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT). Dabei stellt insbesondere die Reaktivierung von latentem CMV im HSCT-Rezipienten das häufigste Infektionsrisiko dar. Die Inzidenz der CMV-Erkrankung kann durch Rekonstitution adoptiv transferierter CMV-spezifischer CD8 T-Zellen im HSCT-Rezipienten reduziert werden. Das Modell der sogenannten adoptiven Immuntherapie wurde zunächst im murinen Modell entwickelt und bereits in klinischen Studien bestätigt. Jedoch ist der adoptive Transfer (AT) aufgrund der nur limitiert zur Verfügung stehenden therapeutisch effektiven Zellzahlen zurzeit in der klinischen Routine nicht einsetzbar.rnZiel dieser Arbeit war daher die präklinische Evaluierung einer Kombinationstherapie aus AT einer limitierten Anzahl CMV-spezifischer T-Zellen und deren in vivo Expansion durch therapeutische Vakzinierung nach HSCT. Zur Testung dieser Therapie wurde ein murines Modell auf der Grundlage von rekombinanten murinen CMV (mCMV) und rekombinanten HCMV Dense Bodies (DB) etabliert. Beide exprimieren das gut charakterisierte MHC-Klasse-I Kb-restringierte SIINFEKL-Peptid (OVA257-264) des Ovalbumins (OVA) bzw. die Funktions-verlustmutante SIINFEKA als Modellantigen. In den rekombinanten mCMV, mCMV-Δm157Luc/m164-SIINFEKL/-A (mCMV-SIINFEKL/-A), wurde mittels orthotopen Peptid-austauschs das m164257-265 Peptid des gp36,5/m164 Proteins deletiert und durch das SIINFEKL- bzw. SIINFEKA-Peptid ersetzt. Anhand von Priming-Analysen konnte gezeigt werden, dass nach Infektion von C57BL/6 Mäusen mit mCMV-SIINFEKL SIINFEKL-spezifische T-Zellen nachweisbar sind und das im CMV-Genom integrierte SIINFEKL funktional prozessiert und präsentiert wird. Parallel hierzu konnte nach Immunisierung mit DB-SIINFEKL in vivo ein SIINFEKL-spezifisches CD8 T-Zell-Priming induziert werden. In weiteren Experimenten konnte nach DB-SIINFEKL-Immunisierung im poplitealen Lymphknoten sowie in der Milz eine Proliferation von adoptiv transferierten CD8 T-Zellen beobachtet werden. Die anschließenden Challenge-Versuche zeigten, dass eine DB-SIINFEKL-Immunisierung epitopspezifisch vor einer hoch dosierten Challenge-Infektion mit mCMV-SIINFEKL schützt. Im AT-Modell konnte gezeigt werden, dass adoptiv transferierte OT-I Zellen hämatoablativ behandelte Rezipienten epitopspezifisch vor einer mCMV-SIINFEKL-Infektion schützen können, wobei der erzielte Schutz durch zusätzliche Vakzinierung mit DB-SIINFEKL deutlich verbessert werden konnte. Im Anschluss konnte im HSCT-Rezipienten erstmals eine durch zusätzliche Vakzinierung signifikante Verbesserung des protektiven Potenzials adoptiv transferierter OT-I Zellen bestätigt werden. Diese Verstärkung der Protektion ermöglicht die Reduktion der Anzahl der für den Schutz benötigten Zellzahl und erhöht damit die Effizienz der adoptiven Immuntherapie.

Regulation der Funktion dendritischer Zellen im immunologischen steady state

Dendritische Zellen sind professionelle Antigenpräsentierende Zellen und übernehmen sowohl in der Aktivierung naiver T-Zellen als auch in der Aufrechterhaltung peripherer Toleranz eine zentrale Funktion. Ruhende Dendritische Zellen im immunologischen Steady State induzieren antigenspezifisch Toleranz in autoreaktiven T-Zellen, welche bei der negativen Selektion im Thymus nicht eliminiert wurden und verhindern somit die Entstehung von Autoimmunität. Mit Hilfe eines transgenen Maus Modells, welches die induzierbare Expression transgen kodierter CD8+ T-Zell-Epitope auf ruhenden Dendritischen Zellen erlaubt, konnten wir zeigen, dass die periphere Toleranz Induktion durch Dendritische Zellen in Abwesenheit von regulatorischen T-Zellen beeinträchtigt ist. Wir konnten verdeutlichen, dass für die Suppression von steady-state Dendritischen Zellen die Erkennung von MHC Klasse II Molekülen auf Dendritischen Zellen durch den T-Zell-Rezeptor regulatorischer T-Zellen zwingend erforderlich ist. In Abwesenheit dieser suppressiven Interaktion hatten Dendritische Zellen einen aktivierten Phänotyp und lösten eine funktionale T-Zell-Antwort aus, anstatt periphere Toleranz zu induzieren. Als Folge dessen entwickelten Mäuse, in denen Dendritische Zellen nicht antigenspezifisch mit suppressiven CD4+ T-Zellen interagieren konnten, spontane Autoimmunität, welche durch CD8+ T-Zellen mediiert wurde. Wir konnten weiterhin zeigen, dass der Verlust peripherer T-Zell Toleranz durch basale Level an Typ I Interferonen mediiert wird sowie durch CD40 Signale, welche von adaptiven Immunzellen geliefert werden.

Etablierung eines humanisierten Mausmodells zur In-vivo-Analyse von DC-adressierenden Nanopartikeln

In dieser Arbeit wurde zunächst ein humanisiertes Mausmodell entwickelt für die Analyse von humanen DCs in vivo. Darüber hinaus wurden erste Versuche mit Nanopartikelbeladenen DCs durchgeführt, mit der Intention, durch diese Kombination humane DCs zu untersuchen. Es wurden immunsupprimierte NOD/LtSz-scid IL2R (NSG) Mäuse verwendet und mit humanen CD34+ PBSCs transplantiert. Es wurden insgesamt 14 Modelle getestet, mit einer durchschnittlichen Humanisierungsrate von 76 %. In allen Modellen konnten ab Woche sechs nach Transplantation humane CD45+ Zellen sowie humane Bund NK-Zellen und CD14+ Monozyten gefunden werden. Darüber hinaus waren myeloide DC-Vorläuferzellen, konventionelle HLA DR CD11c DCs (cDCs) und plasmazytoide DCs (pDCs) vorhanden. Humane T-Zellen konnten nicht vor Woche 18 nach Transplantation beobachtet werden. Neben der Rekonstitution humaner DCs in peripheren Organen, wurde ebenfalls nach gewebsständigen DCs, insbesondere den Langerhans Zellen (LCs) der Epidermis geschaut. Waren humane LC vorhanden, konnten diese ab Woche zwölf nach Transplantation in der murinen Epidermis detektiert werden. Diese waren konstant bis in Woche 30 nach Transplantation nachweisbar. In Hinblick auf die Etablierung der DCs in diesem humanisierten Mausmodells wurden verschiedene Einflussgrößen getestet. IL-7 führte zu keiner veränderten Hämatopoese, wohingegen Flt3L zu einer Zunahme von CD14+ Monozyten und cDCs führte. Darüber hinaus konnte eine drastische Abnahmernhumaner B-Zellen beobachtet werden. Es zeigte sich, dass der Zeitpunkt der Flt3LrnApplikation einen entscheidenen Faktor für den Effekt von Flt3L auf die Rekonstitution humaner Zellen darstellt. Für die in dieser Arbeit durchgeführten funktionellen in vivo Studien, wurden humanisierten Mäusen alloreaktive CD8+ T-Zellen appliziert. Somit sollte die Funktionalität der rekonstituierten humanen APCs getestet werden. Es wurde deutlich, dass Monozyten und DCs ihre Funktionalität erst ab Woche 14 nach Transplantation zu entwickeln schienen,rnwohingegen B-Zellen bereits zu früheren Zeitpunkten als Zielzellen für die alloreaktiven T-Zellen dienten. Dies wurde durch den Rückgang der jeweiligen Zellen nach Applikation der T-Zellen sichtbar. Zu erwähnen ist, dass das Anwachsen einer humanen Hämatopoese stark spenderabhängig ist und somit keine allgemeingültigen Aussagen hinsichtlich der in vivo Funktion getroffen werden können. Um im Gewebe verbliebende APCs zu manipulieren gibt es verschiedene Möglichkeiten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf Polystyren-basierende Nanopartikel getestet. Die verwendeten Partikel hatten eine Größe von 80 bis 160 nm und waren unfunktionalisiert oder mit Amino- bzw. Carboxy-Gruppen versehen. Zusätzlich wurden die Partikel mit BODIPY (Durchflusszytometrie und kLSM-Messungen), einem Infrarotnahem Farbstoff IR 780 (BFI-Messungen) und Platin (in vivo Messungen) beladen. Der Carboxy-funktionalisierte Partikel zeigte den geringsten Einfluss auf die Vitalität von humanen DCs, wohingegen der Amino-funktionalisierte Partikel bei steigender Konzentration toxisch wirkte. Bei unfunktionalisierten Partikeln stieg die Toxizität bei zunehmender Konzentration. Hinsichtlich der Expression diverser DC spezifischer Oberflächenmoleküle nach Beladung mit Nanopartikeln zeigte sich, dass allein der unfunktionalisierte, mit Lutensol AT50 hergestellte Partikel zu einer leichten Hochregulation von MHC-Klasse-II Molekülen führte. Die Expression von CD86 wurde im Gegenzug nur durch die Beladung mit den Amino-, bzw. Carboxy funktionalisierten Partikeln und dem unfunktionalisierten, mit SDS hergestellten Partikel leicht gesteigert. Trotz der teilweise leicht veränderten Expression von Oberflächenmarkern, konnte mit Hilfe von IFN-g ELISpots keine Beeinflussungrnder Funktion als APCs von Nanopartikel-beladenen DCs beobachtet werden. In den in vivo Untersuchungen zeigten alle vier Partikel eine konstante Zirkulation imrnOrganismus und konnten bis 96 h nach Applikation nachgewiesen werden. Alle Partikel konnten primär in der Leber detektiert werden, wobei der unfunktionalisierte, mit Lutensol AT50 hergestelle Partikel das weiteste Verbreitungsmuster zeigte. Erste Versuche im humanisierten Mausmodell zeigten keine Beeinflussung der Verteilung und Kinetik von Nanopartikeln durch die humane Hämatopoese. Mit dem in dieser Arbeit etablierten humanisierten Mausmodell ist es möglich, die Entwicklung, Differenzierung, Aktivierung und Funktionalität humaner DCs in vivo zu untersuchen. Darüber hinaus kann das gezielte Adressieren von DCs in vivo analysiert werden, was sowohl die Möglichkeit der Manipulation von DCs zur Vermeidung einer akuten GvHD bietet als auch Verwendung in anderen DC-vermittelten Therapien (z.B.Vakzinationsstudien) findet.

Molekulare Grundlagen der Immunkontrolle des murinen Cytomegalovirus in Gegenwart viruskodierter Immunevasine

Die Kontrolle der Infektion mit dem humanen Cytomegalovirus (HCMV) wird primär durch antivirale CD8 T-Zellen vermittelt. Während der Koevolution zwischen Virus und Wirt wurden Immunevasionsmechanismen entwickelt, die direkt die Expression der Peptid-MHC-Klasse-I-Komplexe an der Zelloberfläche beeinflussen und es dem Virus ermöglichen, der Immunkontrolle des Wirtes zu entkommen. Da HCMV und das murine CMV (mCMV) zum Teil analoge Strategien zur Modulation des MHC-Klasse-I-Antigen-Präsentationswegs entwickelt haben, wurde in der vorliegenden Arbeit auf das experimentelle Modell mit mCMV zurückgegriffen. Die für die Immunevasion verantwortlichen Genprodukte m04/gp34, m06/gp48 und m152/gp40 werden aufgrund ihres regulatorischen Einflusses auf die Antigenpräsentation als vRAPs (viral regulators of antigen presentation) bezeichnet. Diese interferieren mit dem Transport Peptid-beladener MHC-Klasse-I-Moleküle und reduzieren in ihrer konzertierten Wirkung die Präsentation viraler Peptide an der Zelloberfläche.rnDie Transplantation hämatopoietischer Zellen nach Immunoablation stellt eine etablierte Therapieform bei malignen hämatologischen Erkrankungen dar. Zwischen Immunoablation und der Rekonstitution des Immunsystems sind die Empfänger der transferierten Zellen stark immunsupprimiert und anfällig für eine CMV-Erkrankung bei Reaktivierung des Virus. Neben der Gabe antiviraler Medikamente ist der adoptive Transfer antiviraler CD8 T-Zellen eine vielversprechende Therapiemöglichkeit, um reaktivierende CMV zu kontrollieren, bis das körpereigene Immunsystem wieder funktionsfähig ist. Obwohl im murinen Modell sehr wohl etabliert, stellen im humanen System die eingeschränkte Wirkung und die Notwendigkeit der konsequenten Gabe hoher Zellzahlen gewisse logistische Schwierigkeiten dar, welche die Methode bisher von der klinischen Routine ausschließen.rnDas murine Modell sagte eine Rolle von IFN-γ voraus, da Depletion dieses Zytokins zu einer verminderten Schutzwirkung gegen die mCMV-Infektion führt.rnIm ersten Teil dieser Arbeit sollte ein möglicher inhibitorischer Effekt von m04 auf m152 untersucht werden, der bei der Rekombinanten Δm06W beobachtet wurde. Mit neu generierten Viren (Δm06L1+2) konnte dieser Effekt allerdings nicht bestätigt werden. Bei Δm06W fehlte jedoch eine höher N-glykosylierte Isoform des m152-Proteins. Um zu untersuchen, ob die N-Glykosylierung von m152 für seine Funktion notwendig ist, wurde ein rekombinantes Virus generiert, das in Folge einer Deletion aller 3 N-Glykosylierungssequenzen nur eine nicht-glykosylierte Isoform des m152-Proteins bilden kann. In Übereinstimmung mit der zwischenzeitlich publizierten Kristallstruktur das Komplexes von m152 und dem Liganden RAE-1 des aktivierenden NK-Zellrezeptors NKG2D konnte erstmals gezeigt werden, dass die Funktionen von m152 in der adaptiven und in der angeborenen Immunität auch von der nicht N-glykosylierten Isoform wahrgenommen werden können.rnIm zweiten Teil der Arbeit sollte mit Hilfe eines Sets an vRAP Deletionsmutanten der Einfluss von IFN γ auf die einzeln oder in Kombination exprimierten vRAPs untersucht werden. Es zeigte sich, dass Vorbehandlung der Zellen mit IFN-γ die Antigenprozessierung nach Infektion stark erhöht und die vRAPs dann nicht mehr in der Lage sind, die Präsentation aller Peptid-beladener MHC-Klasse-I-Komplexe zu verhindern. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass vorher nicht-schützende CD8 T-Zellen Schutz vermitteln können, wenn das Gewebe der Rezipienten konstitutiv mit IFN-γ versorgt wird. Die zusätzliche Gabe von IFN-γ stellt daher eine vielversprechende Möglichkeit dar, den adoptiven Transfer als Therapie in der klinischen Routine einzusetzen.

Generation and characterisation of acute myeloid leukaemia-reactive CD4 + T cells and their potential to eliminate human leukaemia blasts in NSG mice

Acute myeloid leukaemia (AML) is a cancer of the haematopoietic system, which can in many cases only be cured by haematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and donor lymphocyte infusion (DLI) (Burnett et al., 2011). This therapy is associated with the beneficial graft-versus-leukaemia (GvL) effect mediated by transplanted donor T and NK cells that either recognise mismatch HLA molecules or polymorphic peptides, so-called minor histocompatibility antigens, leukaemia-associated or leukaemia-specific antigens in the patient and thus eliminate remaining leukaemic blasts. Nevertheless, the mature donor-derived cells often trigger graft-versus-host disease (GvHD), leading to severe damages in patients’ epithelial tissue, mainly skin, liver and intestine (Bleakley & Riddell, 2004). Therefore, approaches for the selective mediation of strong GvL effects are needed, also in order to prevent relapse after transplantation. One promising opportunity is the in vitro generation of AML-reactive CD4+ T cells for adoptive transfer. CD4+ T cells are advantageous compared to CD8+ T cells, as HLA class II molecules are under non-inflammatory conditions only expressed on haematopoietic cells; a fact that would minimise GvHD (Klein & Sato, 2000). In this study, naive CD4+ T cells were isolated from healthy donors and were successfully stimulated against primary AML blasts in mini-mixed lymphocyte/leukaemia cell cultures (mini-MLLC) in eight patient/donor pairs. After three to seven weekly restimulations, T cells were shown to produce TH1 type cytokines and to be partially of monoclonal origin according to their TCR Vβ chain usage. Furthermore, they exhibited lytic activity towards AML blasts, which was mediated by the release of granzymes A and B and perforin. The patient/donor pairs used in this study were fully HLA-class I matched, except for one pair, and also matched for HLA-DR and -DQ, whereas -DP was mismatched in one or both alleles, reflecting the actual donor selection procedure in the clinic (Begovich et al., 1992). Antibody blocking experiments suggested that the generated CD4+ T cells were directed against the HLA-DP mismatches, which could be confirmed by the recognition of donor-derived lymphoblastoid cell lines (LCLs) electroporated with the mismatched DP alleles. Under non-inflammatory conditions primary fibroblasts did not express HLA-DP and were thus not recognised, supporting the idea of a safer application of CD4+ T cells regarding induction of GvHD. For the assessment of the biological significance of these T cells, they were adoptively transferred into NSG mice engrafted with human AML blasts, where they migrated to the bone marrow and lymphoid tissue and succeeded in eliminating the leukaemic burden after only one week. Therefore, AML-reactive CD4+ T cells expanded from the naive compartment by in vitro stimulation with primary leukaemia blasts appear to be a potent tool for DLI in HSCT patients and promise to mediate specific GvL effects without causing GvHD.

FaSSIF-C, a Cholesterol containing biorelevant intestinal model medium for development and test of oral drug formulations

Biorelevante Medien sind entwickelt worden, um die Bedingungen im Magen-Darm-Trakt vor und nach der Mahlzeit zu imitieren. Mit FaSSIF und FeSSIF wurden Medien eingeführt, die nicht nur die pH- und Puffer-Kapazität des Dünndarms widerspiegeln, sondern auch Lipid und physiologische Tensid-Arten enthalten. Diese Medien (FaSSIF-V2 und FaSSlFmod6.5) wurden für Bioverfügbarkeitstudien in der Medikamentenentwicklung im Laufe der Jahre kontinuierlich weiterentwickelt. Dennoch sind die auf dem Markt verfügbaren Medien immer noch nicht in der Lage, die realen physiologischen Bedingungen zu simulieren. In der jetzigen Zusammensetzung sind nicht alle Kompetenten enthalten, welche natürlicher Weise im Duodenum vorkommen. Darüber hinaus wird nur eine 1:5 Verdünnung von FeSSIF zu FaSSIF angenommen, die individuelle Wasserzufuhr bei Medikamentengabe wird hierdurch jedoch nur eingeschränkt simuliert, obwohl diese von Patient zu Patient schwanken kann. rnZiel dieser Dissertation war die Verbesserung der Vorhersage der Auflösung und Absorption lipophiler Arzneistoffe durch Simulation der Bedingungen im zweiten Teil des Zwölffingerdarms mit neuen biorelevanten Medien, sowie unter Einwirkung zusätzlicher Detergention als Wirkstoffträger. rnUm den Effekt der Verdünnungsrate und Zeit im Dünndarm zu untersuchen, wurde die Entwicklung der Nanopartikel in der Magen-Darm-Flüssigkeit FaSSIFmod6.5 zu verschiedenen Zeitpunkten und Wassergehalten untersucht. Dafür wurden kinetische Studien an verschieden konzentrierten Modellmedien nach Verdünnungssprung untersucht. Das Modell entspricht der Vermischung der Gallenflüssigkeit mit dem Darminhalt bei variablem Volumen. Die Ergebnisse zeigen, dass Art und Größe der Nanopartikel stark von Verdünnung und Einirkungszeit abhängen. rnrnDie menschliche Darmflüssigkeit enthält Cholesterin, welches in allen früheren Modellmedien fehlt. Daher wurden biokompatible und physiologische Modellflüssigkeiten, FaSSIF-C, entwickelt. Der Cholesteringehalt von FaSSIF - 7C entspricht der Gallenflüssigkeit einer gesunden Frau, FaSSIF - 10C der einer gesunden männlichen Person und FaSSIF - 13C der in einigen Krankheitszuständen. Die intestinale Teilchen-Struktur-Untersuchung mit dynamische Lichtstreuung (DLS) und Neutronen-Kleinwinkelstreuung (SANS) ergab, dass die Korngröße von Vesikeln mit zunehmender Cholesterin-Konzentration abnahm. Zu hohe Cholesterin-Konzentration bewirkte zusätzlich sehr große Partikel, welche vermutlich aus Cholesterin-reichen “Disks“ bestehen. Die Löslichkeiten einiger BCS Klasse II Wirkstoffe (Fenofibrat, Griseofulvin, Carbamazepin, Danazol) in diesen neuen Medien zeigten, dass die Löslichkeit in unterschiedlicher Weise mit der Cholesteringehalt zusammen hing und dieser Effekt selektiv für die Droge war. rnDarüber hinaus wurde die Wirkung von einigen Tensiden auf die kolloidale Struktur und Löslichkeit von Fenofibrat in FaSSIFmod6.5 und FaSSIF -7C untersucht. Struktur und Löslichkeit waren Tensid- und Konzentrations-abhängig. Im Falle von FaSSIFmod6.5 zeigten die Ergebnisse eine dreifache Verzweigung der Lösungswege. Im Bereich mittlerer Tensidkonzentration wurde eine Löslichkeitslücke der Droge zwischen der Zerstörung der Galle-Liposomen und der Bildung von Tensid-reichen Mizellen beobachtet. In FaSSIF - 7C, zerstörten Tenside in höherer Konzentration die Liposomenstruktur trotz der allgemeinen Stabilisierung der Membranen durch Cholesterin. rnDie in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse ergeben, dass die Anwesenheit von Cholesterin als eine fehlende Komponente der menschlichen Darmflüssigkeit in biorelevanten Medien wichtig ist und dazu beitragen kann, das in vivo Verhalten schwerlöslicher Arzneistoffe im Körper besser vorhersagen zu können. Der Verdünnungsgrad hat einen Einfluss auf die Nanopartikel-Struktur und Tenside beeinflussen die Löslichkeit von Medikamenten in biorelevanten Medien: Dieser Effekt ist sowohl von der Konzentration das Tensids abhängig, als auch dessen Typ.rnrn