Einfluss subviraler Partikel des humanen Cytomegalovirus auf die Induktion der antiviralen Immunantwort

Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der insbesondere bei Patienten mit unreifem oder geschw��chtem Immunsystem schwere, teilweise lebensbedrohliche Erkrankungen verursacht. Aufgrund der klinischen Relevanz wird die Entwicklung einer Impfung gegen HCMV mit gro��em Nachdruck verfolgt. Subvirale Partikel des HCMV, sogenannte Dense Bodies (DB), stellen eine vielversprechende Impfstoff-Grundlage dar. Die innere Struktur der Partikel besteht aus viralen Proteinen, die als dominante Antigene der zellul��ren Immunantwort gegen HCMV identifiziert wurden. Die ��u��ere H��lle der Partikel entspricht der Virush��lle, sie enth��lt die viralen Oberfl��chenproteine als Zielantigene der neutralisierenden Antik��rper (NTAk)-Antwort in ihrer nat��rlichen Konformation. Die f��r ein Totantigen au��ergew��hnlich hohe Immunogenit��t der Partikel wurde bereits in Vorarbeiten dokumentiert. Ein Ziel dieser Arbeit war es, den molekularen Hintergrund f��r die herausragenden, immunogenen Eigenschaften von DB aufzukl��ren. Im ersten Teil der Arbeit wurde daher die Hypothese gepr��ft, dass DB geeignet sind, die Ausreifung und Aktivierung von dendritischen Zellen (DC) zu vermitteln und damit deren F��higkeit zur Antigenpr��sentation zu stimulieren. Derart aktivierten DC kommt eine wichtige Rolle beim Priming der T-lymphozyt��ren Immunantwort zu. In der Tat konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von unreifen dendritischen Zellen (iDC) mit DB zu verst��rkter Expression von solchen Molek��len auf der DC-Oberfl��che f��hrt, die mit Ausreifung der Zellen verkn��pft sind. Der Nachweis der verst��rkten Freisetzung proinflammatorischer Zytokine belegte die Aktivierung der Zellen im Sinne einer entz��ndlichen Reaktion. Die erfolgreiche Stimulation von CD4 und CD8 T-Lymphozyten durch DB-behandelte DC belegte schlie��lich die funktionelle Relevanz der Ergebnisse. Zusammengefasst konnten in diesem Abschnitt der Arbeit die molekularen Grundlagen der adjuvanten Wirkung von DB aufgekl��rt werden. rnIn einem zweiten Abschnitt wurde die NTAk-Antwort nach DB-Immunisierung n��her untersucht. Der humoralen Immunantwort kommt eine entscheidende Bedeutung bei der Pr��vention der HCMV-��bertragung zu. Hier galt es zu pr��fen, welchen Einfluss stammspezifische Unterschiede in der Expression viraler Oberfl��chenproteine auf die Induktion der NTAk-Antwort nach DB-Immunisierung nehmen. Im Fokus stand dabei die variable Expression des pentameren Proteinkomplexes aus den viralen Proteinen gH/gL/pUL128-UL131A. Dieser Komplex wird nur von kliniknahen HCMV-St��mmen (HCMVKlin) exprimiert und ist f��r deren breiten Zelltropismus verantwortlich. Der pentamere Komplex fehlte in allen bisherigen Analysen der DB-Immunogenit��t, die auf der Grundlage von Laborst��mmen des HCMV (HCMVLab) durchgef��hrt worden waren. Ein erster Versuchsansatz zeigte, dass die NTAk-Antwort, die durch DB von HCMVLab (DBLab) induziert wird, auch gegen die Infektion mit HCMVKlin einen gewissen Schutz vermittelt. Dies war ein ��berraschender Befund, da Antik��rpern gegen den pentameren Komplex eine entscheidende Rolle bei der Neutralisation von HCMVKlin zugeschrieben wurde. Die Ergebnisse zeigten jedoch, dass Antik��rper gegen andere Zielstrukturen zur Neutralisation von HCMVKlin beitragen. Hieraus resultierte unmittelbar die Frage, inwieweit eine Aufnahme des pentameren Komplexes in einen DB-basierten Impfstoff ��berhaupt notwendig war. Um dies zu beantworten war es notwendig, DB herzustellen, die den pentameren Komplex enthielten. Hierzu wurde ein HCMVLab durch Mutagenese des 235 kpb Genoms so modifiziert, dass von dem resultierenden Stamm der pentamere Komplex exprimiert wurde. In gereinigten DB dieses Stammes konnten die Komponenten des pentameren Komplexes nachgewiesen werden. Die Seren von Tieren, die mit DB dieses neuen Stammes immunisiert wurden, zeigten in der Tat eine deutlich gesteigerte Kapazit��t zur Neutralisation von HCMVKlin auf verschiedenen Zielzellen. Diese Ergebnisse unterstreichen schlussendlich, dass die Expression des pentameren Komplexes einen Vorteil bei der Induktion der antiviralen NTAk-Antwort erbringt. Zusammengefasst liefern die Erkenntnisse aus dieser Arbeit einen wichtigen Beitrag zum Verst��ndnis der immunogenen Wirkung von DB. Auf dieser Grundlage war es nunmehr m��glich, ein Projekt zur Austestung der DB-Vakzine in einer ersten klinischen Studie zu initiieren.

Untersuchungen zur antitumoralen Wirkungsweise eines bispezifischen MCSP-CD3 Antik��rpers in vitro und im humanisierten Tumormausmodell

Humanes MCSP ist ein gut charakterisiertes Tumorantigen, das auf der Mehrzahl aller malignen Melanome hoch exprimiert wird, und stellt somit eine gute Zielstruktur f��r immuntherapeutische Ans��tze dar. rnInnerhalb der vorliegenden Arbeit wurden die Wirkmechanismen eines neuen bispezifischen Antik��rpers, der gegen humanes MCSP und CD3 auf T-Zellen gerichtet ist, in vitro und im humanisierten Tumormausmodell in vivo untersucht. In humanen T Zellkokulturen induzierte der bispezifische MCSP-CD3 Antik��rper in Gegenwart MCSP-positiver Melanomzellen konzentrationsabh��ngige T-Zellaktivierung, Sekretion von Zytokinen und effiziente Tumorzelllyse durch CD4- und CD8-positive T-Zellen. Die induzierte Lyse war hierbei unabh��ngig von der T-Zellrezeptorspezifit��t sowie kostimulatorischen Molek��len und allein abh��ngig von der Expression des Tumorantigens sowie CD3 auf den T-Zellen. Wie hier diskutiert, liegt es nahe, dass die Freisetzung lytischer Molek��le (Perforin und Granzym-B) durch CD8- und auch CD4 positiver T-Zellen den Hauptmechanismus in der Lyse der Melanomzellen darstellt. rnUm die Wirksamkeit in vivo testen zu k��nnen, wurde ein humanisiertes Tumormausmodell etabliert. Die Injektion humaner h��matopoetischer Stammzellen in neugeborene Rag2-/-gc-/- M��use f��hrte zur Entwicklung funktioneller T-Zellen im murinen Thymus, welche lymphatische Organe besiedelten. In vitro induzierten die T-Zellen humanisierter M��use in Anwesenheit des bispezifischen MCSP-CD3 Antik��rpers ebenfalls konzentrationsabh��ngige Lyse der Melanomzellen. Wie hier gezeigt, induzierte die Injektion humaner Melanomzellen in humanisierte M��use keine messbare Absto��ungsreaktion. Unter Behandlung mit MCSP-CD3 wurde zwar eine erh��hte Anzahl humaner T-Zellen im Tumorgewebe nachgewiesen, jedoch verf��gte die verwendete Melanomzelllinie ��ber eine geringe basale T Zellinfiltration, geringe Vaskularisierung und ein nodul��res Wachstumsverhalten. Wie innerhalb dieser Arbeit diskutiert, kann durch die Kombination mit Therapien, die eine erh��hte T-Zellinfiltration in das Tumorgewebe erm��glichen, die Wirksamkeit von bispezifischen Antik��rpern m��glicherweise gesteigert werden. rn

Untersuchungen zur Lymphozytotoxizit��t gegen Tumoren in Nierenzellkarzinom-Patienten und HLA-kompatiblen gesunden Spendern

In der vorliegenden Arbeit wurden Blutlymphozyten, die aus allogenen, serologisch HLA (humanes Leukozytenantigen)-identischen gesunden Geschwisterspendern von Nierenzellkarzinom (RCC, engl. renal cell carcinoma)-Patienten isoliert wurden, auf ihre antitumorale Reaktivit��t in vitro untersucht. Dazu war die vorangehende Generierung von stabil in vitro wachsenden Tumorzelllinien der Patienten zwingende Voraussetzung. Insgesamt wurden aus prim��rem Tumorgewebe von 65 Nierenzellkarzinom-Patienten Tumorzellen isoliert und daraus Zellkulturen angelegt. In 28 % der F��lle gelang es, eine konstant in Zellkultur wachsende Tumorzelllinie zu etablieren. Daneben wurden aus 56 Tumorpatienten auch die aus dem angrenzenden Nierengewebe gewonnenen nicht-malignen Nierenzellen ��ber wenige Zellkultur-Passagen expandiert. In vier Patienten mit stabil in vitro wachsender Tumorzelllinie war ein allogener HLA-identischer Geschwisterspender verf��gbar. In diesen Modellsystemen wurden in gemischten Lymphozyten-Tumorzell-Kulturen (MLTCs, engl. mixed lymphocyte tumor cell cultures) die Blutlymphozyten der Patienten und der gesunden Geschwisterspender mit der jeweiligen Nierenzellkarzinom-Zelllinie stimuliert und tumorreaktive CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs, engl. cytotoxic T-lymphocytes) generiert. Wenn m��glich wurden aus den so gewonnenen ���Responder���-Massenkulturen CD8+ T-Zellklone isoliert und hinsichtlich ihrer Funktionalit��t in IFN-��-ELISpot-Assays und 51Chrom-Zytotoxizit��tstests untersucht. Durch Blockade der HLA-Molek��le mit monoklonalen Antik��rpern wurden die HLA-Restriktionselemente sowie weitere an der Erkennung beteiligte Oberfl��chenmolek��le analysiert. Kreuzreaktivit��tsuntersuchungen mit einem breiten Zielzell-���Panel��� gaben Aufschluss ��ber die Reaktivit��t der CTLs gegen RCC, nicht-maligne Nierenzellen, h��matopoetische Zielzellen von Patient und Geschwisterspender und weitere Tumorzelllinien aus Nierenzellkarzinomen und anderen Tumorentit��ten. Interessanterweise zeigten die Geschwister-MLTC-���Responder���-Lymphozyten im Vergleich zu den autologen MLTC-���Responder���-Lymphozyten eine st��rkere Proliferation und Zytotoxizit��t nach Stimulation mit Tumorzellen. Die allogenen tumorreaktiven ���Responder���-Lymphozyten entstammten der CD8+ CD62L(high)+ Subpopulation, die naive Vorl��ufer- und ���central memory���-T-Zellen enth��lt. Im Gegensatz zu autologen MLTC-Lymphozyten und tumorinfiltrierenden Lymphozyten konnte aus nahezu allen allogenen MLTCs mithilfe des Grenzverd��nnungsverfahrens ein breites Spektrum an tumorreaktiven CTL-Klonen expandiert werden. Diese lysierten entweder ausschlie��lich die autologe RCC-Zelllinie oder kreuzreagierten mit autologen nicht-malignen Nierenzellen. Eine Minderheit der CTL-Klone erkannte au��erdem h��matopoetische Zellen des Patienten oder allogene Tumorzellen. Als HLA-Restriktionselemente der allogenen tumorreaktiven CD8+ CTL-Klone wurden HLA-A2, -A3, -A11, -A24 und -B7 identifiziert. Weiterhin wurden in einem Modellsystem bisher unbekannte, stark proliferierende CD3+ CD16+ CD57+ CTL-Klone mit nicht-HLA-restringierter Tumorreaktivit��t isoliert. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit erstmals, dass allogene Blutlymphozyten von HLA-identischen gesunden Geschwistern eine Vielfalt von tumorreaktiven CD8+ CTL-Klonen enthalten. Im direkten Vergleich mit autologen Blutlymphozyten der betroffenen Patienten besitzen allogene Blutlymphozyten der Geschwister eine st��rkere proliferative und zytotoxische Tumorreaktivit��t. Die Ergebnisse dieser Arbeit ermutigen weitere Bem��hungen, tumorreaktive T-Zellen aus dem Blut von HLA-identischen gesunden Geschwisterspendern in vitro zu generieren. Solche T-Zellen w��ren in zweierlei Hinsicht von Interesse: Zum einen erm��glichen sie die Identifizierung der Zielantigene, die von T-Zellen aus gesunden Individuen auf Tumoren erkannt werden und als Zielstrukturen von antigenspezifischen Immuntherapien (z. B. Vakzination) dienen k��nnten. Zum anderen k��nnten diese T-Zellen m��glicherweise f��r eine adoptive Immuntherapie der betroffenen Tumorpatienten verwendet werden.

Studying MHC I-dependent CD8 + T cell responses in the model of murine cutaneous leishmaniasis

Der Ausheilung von Infektionen mit Leishmania major liegt die Sekretion von IFN-��� von sowohl CD4+ als auch CD8+ T Zellen zugrunde.rnAktuell konnte in der Literatur nur ein Epitop aus dem parasit��ren LACK Protein f��r eine effektive CD4+ T Zell-vermittelte Immunantwort beschrieben werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand daher darin, m��gliche MHC I abh��ngige CD8+ T Zell Antworten zu untersuchen. rnF��r diesen Ansatz wurde als erstes der Effekt einer Vakzinierung mit LACK Protein fusioniert an die Protein-Transduktionsdom��ne des HIV-1 (TAT) analysiert. Die Effektivit��t von TAT-LACK gegen��ber CD8+ T Zellen wurde mittels in vivo Protein-Vakzinierung von resistenten C57BL/6 M��usen in Depletions-Experimenten gezeigt.rnDie Prozessierung von Proteinen vor der Pr��sentation immunogener Peptide gegen��ber T Zellen ist unbedingt erforderlich. Daher wurde in dieser Arbeit die Rolle des IFN-���-induzierbaren Immunoproteasoms bei der Prozessierung von parasit��ren Proteinen und Pr��sentation von Peptiden gebunden an MHC I Molek��le durch in vivo und in vitro Experimente untersucht. Es konnte in dieser Arbeit eine Immunoproteasom-unabh��ngige Prozessierung aufgezeigt werden.rnWeiterhin wurde Parasitenlysat (SLA) von sowohl Promastigoten als auch Amastigoten fraktioniert. In weiterf��hrenden Experimenten k��nnen diese Fraktionen auf immunodominante Proteine/Peptide hin untersucht werden. rnLetztlich wurden Epitop-Vorhersagen f��r CD8+ T Zellen mittels computergest��tzer Software von beiden parasit��ren Lebensformen durchgef��hrt. 300 dieser Epitope wurden synthetisiert und werden in weiterf��hrenden Experimenten zur Charakterisierung immunogener Eigenschaften weiter verwendet. rnIn ihrer Gesamtheit tr��gt die vorliegende Arbeit wesentlich zum Verst��ndnis ��ber die komplexen Mechanismen der Prozessierung und letztendlich zur Identifikation von m��glichen CD8+ T Zell Epitopen bei. Ein detailiertes Verst��ndnis der Prozessierung von CD8+ T Zell Epitopen von Leishmania major ��ber den MHC Klasse I Weg ist von h��chster Bedeutung. Die Charakterisierung sowie die Identifikation dieser Peptide wird einen ma��geblichen Einfluss auf die weiteren Entwicklungen von Vakzinen gegen diesen bedeutenden human-pathogenen Parasiten mit sich bringen. rn

HLA class II mismatch alleles as targets of the alloreactive CD4 T-cell response

In allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT), alloreactive T lymphocytes of donor origin mediate the beneficial graft-versus-leukemia effect but also induce graft-versus-host disease (GvHD). Since human leukocyte antigens (HLA) mismatch alleles represent major targets of alloreactive T lymphocytes, patient and donor are usually matched for the class I molecules A, B, C, and for the class II molecules DRB1 and DQB1, in order do reduce the risk of GvHD. The HLA-DPB1 locus, however, is still ignored in donor selection. Interestingly, clinical studies have demonstrated that disparities at HLA-DQB1 alleles as well as distinct HLA DPB1 mismatch constellations do not adversely affect the outcome of allo-HSCT. It has also been shown that HLA class II is predominantly expressed on hematopoietic cells under non-inflammatory conditions. Therefore, this PhD thesis focused on the application of CD4 T cells in adoptive immunotherapy of leukemias.rnIn the first part of this thesis we developed a rapid screening approach to detect T-cell reactivity of donors to single HLA class II mismatch alleles. Allo-HLA reactivity was measured in naive, memory, and entire CD4 T cells isolated from PBMC of healthy donors by flow cytometric cell sorting according to expression of the differentiation markers CD45RA, CD45RO, CD62L, and CCR7. T-cell populations were defined by a single marker to facilitate translation into a clinical-grade allo-depletion procedure. Alloreactivity to single HLA-DR/-DQ mismatch alleles was analyzed in short-term mixed lymphocyte reactions (MLR) in vitro. As standard antigen-presenting cells, we used the HLA-deficient cell line K562 upon electroporation with single HLA-DR/-DQ allele mRNA. We observed in IFN-�� ELISpot assays that allo-HLA-reactivity preferentially derived from subsets enriched for naive compared to memory T cells in healthy donors, irrespective of the HLA mismatch allele. This separation was most efficient if CD62L (P=0.008) or CD45RA (P=0.011) were used as marker. Median numbers of allo-HLA-reactive effector cells were 3.5-fold and 16.6-fold lower in CD62Lneg and CD45RAneg memory CD4 T cells than in entire CD4 T cells, respectively. In allele-specific analysis, alloreactivity to single HLA-DR alleles clearly exceeded that to HLA-DQ alleles. In terms of alloproliferation no significant difference could be observed between individual CD4 T-cell subsets. rnThe second part of this thesis dealed with the generation of allo-HLA-DQ/-DP specific CD4 T cells. Naive CD45RApos CD4 T cells isolated from healthy donor PBMC by flow cytometric cell sorting were stimulated in MLR against single allo-HLA-DQ/-DP alleles transfected into autologous mature monocyte-derived dendritic cells by mRNA electroporation. Rapidly expanding HLA-DQ/-DP mismatch reactive T cells significantly recognized and cytolysed primary acute myeloid leukemia (AML) blasts, fibroblasts (FB) and keratinocytes (KC) in IFN-�� ELISpot and 51chromium release assays if the targets carried the HLA DQ/ DP allele used for T cell priming. While AML blasts were recognized independent of pre-incubating them with IFN-��, recognition of FB and KC required IFN-�� pre treatment. We further investigated HLA class II expression on hematopoietic and non-hematopoietic cells by flow cytometry. HLA class II was not detected on primary FB, KC, and non-malignant kidney cells, but was expressed at significant levels on primary AML blasts and B-LCL. Up-regulation of HLA class II expression was observed on all cell types after pre-incubation with IFN-��.rnIn summary, the novel K562-HLA based MLR approach revealed that naive-depleted CD4 T-cell subsets of healthy individuals contain decreased allo-HLA reactivity in vitro. We propose the application of CD45RAneg naive-depleted CD4 T cells as memory T cell therapy, which might be beneficial for HLA-mismatched patients at high-risk of GvHD and low-risk of leukemia relapse. Memory T cells might also provide important post-transplant immune functions against infectious agents. Additionally, the screening approach could be employed as test system to detect donors which have low risks for the emergence of GvHD after allo-HSCT. In the second part of this thesis we developed a protocol for the generation of allo-HLA-DQ/-DP specific CD4 T cell lines, which could be applied in situations in which patient and donor are matched in all HLA alleles but one HLA-DQ/-DP allele with low GvHD potential. These T cells showed lytic activity to leukemia cells while presumably sparing non-hematopoietic tissues under non-inflammatory conditions. Therefore, they might be advantageous for allo-HSCT patients with advanced stage AML after reduced-intensity conditioning and T-cell depletion for the replenishment of anti-leukemic reactivity if the risk for disease relapse is high. rn

Induktion regulatorischer T-Zellen zur Inhibition allergenspezifischer Immunantworten im Mausmodell der Typ I-Allergie

Die Induktion regulatorischer T-Zellen (Treg) spielt im Zusammenhang mit der Kontrolle allergenspezifischer Reaktionen, insbesondere auch im Rahmen einer erfolgreichen Hyposensibilisierung mit hohen Allergendosen, eine zentrale Rolle. In der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen der Rekrutierung allergenspezifischer Treg daher in einem Mausmodell untersucht, in dem analog zur spezifischen Immuntherapie (SIT) die repetitive Verabreichung von hohen Antigendosen einen IgE-spezifischen Suppressionsmechanismus aktiviert, w��hrend die Injektion niedriger Antigendosen eine potente IgE-Antwort induziert. Th1-Zellen sowie konventionelle CD4+CD25+ oder CD8+CD28- Treg konnten als Vermittlerpopulationen des suppressiven Effektes in hochdosig immunisierten M��usen ausgeschlossen werden. Mittels Transferexperimenten wurden erstmals CD4-CD8- doppelt negative Treg als eine die IgE-Suppression vermittelnde Zellpopulation identifiziert. Desweiteren wurden DNA-Transferexperimente durchgef��hrt, mit dem Ziel, adaptive Treg zum Zwecke der Inhibition allergenspezifischer Immunreaktionen zu induzieren. Dazu wurden IL-10- bzw. TGF-��-kodierende Plasmide (pCMV-IL-10, pCMV-TGF-��) hergestellt und in Kombination mit einem Plasmid, welches das Modellallergen ��-Galaktosidase (��Gal) unter der Kontrolle des DC-spezifischen Fascin-Promotors (pFascin-��Gal) kodierte, M��usen mit der Genpistole appliziert. Die Expression des Modellallergens in Verbindung mit der konstitutiven Produktion von immunsuppressiven Zytokinen sollte bei den mit den transfizierten DC interagierenden antigenspezifischen T-Zellen zu einer verst��rkten Differenzierung von Treg f��hren. Die Experimente zeigten, dass die Koapplikation von IL-10-kodierenden Plasmiden eine Immunsuppression induziert, die sich in einer verminderten antigenspezifischen Antik��rperproduktion, Zytokinproduktion und CTL-Induktion zeigt, die jedoch bei nachfolgender Sensibilisierung mit ��Gal-Protein nicht aufrechterhalten werden kann. Dahingegen f��hrte die Koapplikation von TGF-��-kodierenden Plasmiden verbunden mit einer nachfolgenden Sensibilisierung zu einer leichten Inhibition der IgG1- und IgG2a-Produktion verglichen mit der Vakzinierung mit pFascin-��Gal allein. Dieser inhibitorische Effekt von pCMV-TGF-�� wurde interessanterweise nicht bereits nach der DNA-Immunisierung, sondern erst nach Sensibilisierung mit dem Protein beobachtet.

Misregulation of the tumour suppressor gene CYLD drives hyperactivation of T cells leading to intestinal pathology

The tumour suppressor gene cyld is mutated in familial cylindromatosis, an autosomal-dominant condition that predisposes to multiple skin tumours. The deubiquitinase CYLD acts as a negative regulator of NF-��B signaling. To analyse the function of CYLD in vivo we used the CYLDex7/8 mice, which are characterized by loss of the full-length transcript and overexpression of a short splice variant of CYLD (sCYLD). In CYLDex7/8 mice the overexpression of sCYLD results in splenomegaly and lymphadenopathy. Additionally, the B cell population in spleen and lymph nodes is increased at the expense of T cells. Analysis of CYLDex7/8 T cells showed a significant reduction of CD4 single positive (SP) and CD8 SP T cells in the thymus and in the periphery. By investigating the impact of sCYLD in TCR signaling in thymocytes, we could demonstrate that sCYLD partially inhibited the activation of Zap70 and thereby negatively regulated TCR signaling. In vitro as well as in vivo we could show that CD4+ T cells displayed a hyperactive phenotype, proliferated to a better extent than WT cells and expressed high amounts of inflammatory cytokines such as IL-6 and IL-17A. Western Blots of steady state thymocytes and peripheral CD4+ T cells were performed, showing that the noncanonical pathway was highly upregulated visualized by the expression levels of RelB and p100 leading to a hyperactive phenotype of CD4+ T cells. In order to investigate the contribution of sCYLD in positive and negative selection in the thymus in vivo, the HY-TCR transgene (HYtg) was crossed to CYLDex7/8 mice. The analysis of CYLDex7/8 HYtg males revealed an increase in CD4+CD8+ DP as well as in CD8+ SP thymocytes, suggesting a less pronounced negative selection in CYLD mutant mice compared to HYtg control mice. Interestingly, the impaired negative selection in the thymus was accompanied by a strong colitis phenotype at early ages (4 weeks). Since medullary TECs (mTECs) play an important role in the late stage of T cell development by negatively selecting autoreactive thymocytes, the levels of mTECs in the medullary compartment was investigated. Of note, low numbers of mTECs were observed, combined with decreased expression levels of the mTEC markers UEA-1, keratin-5, claudin-3 and claudin-4. The reduction of mTECs in the medullary compartment could explain the inflammatory phenotype of CD4+ T cells in CYLDex7/8 mice leading to the severe intestinal pathology observed in these mice. Taken together, these results show an important role of sCYLD in T cell development and function as well as in NF-��B signaling of T cells.

Einfluss des Treg-Aktivierungsmarkers GARP auf die Differenzierung und Funktion von T-Zellen

CD4+CD25+FoxP3+ regulatorische T-Zellen (Treg) spielen eine essentielle Rolle bei der Unterdr��ckung von sch��dlichen Immunreaktionen. Da aktivierte CD4+ T-Helferzellen auch CD25 und FoxP3 exprimieren, k��nnen diese nicht als spezifische Marker zur Identifikation von Treg verwendet werden. Die Analyse der Membranproteinexpression beider Populationen f��hrte zur Identifikation von GARP (glycoprotein A repetitions predominant) als spezifischer Marker auf aktivierten Treg. GARP bindet LAP und TGF-beta, welches f��r die Unterdr��ckung von entz��ndlichen T-Zellantworten von Bedeutung ist. Um die Funktion von GARP unabh��ngig von Treg zu untersuchen, wurde ein l��sliches GARP Protein (sGARP) synthetisiert und sein Effekt auf die Aktivierung und Differenzierung von humanen T-Zellen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass sGARP die Proliferation von naiven CD4+ T-Zellen supprimiert und zu einer Phosphorylierung von SMAD2/3 sowie zu der Induktion von FoxP3 f��hrt. Zus��tzlich inhibiert sGARP die Produktion von Effektorzytokinen wie IL-2 und IFN-gamma. Die Stimulation von naiven CD4+ T-Zellen mit sGARP induziert die Differenzierung zu Treg, welche in Kokultur die Aktivierung von T-Effektorzellen supprimieren. Die Wirkung war vergleichbar in naiven CD4+ und ruhenden CD4+CD45RA+ T-Zellen, konnte aber in differenzierten CD4+CD45RO+ T-Zellen nicht nachgewiesen werden. Die Induktion von FoxP3 und die Phosphorylierung von SMAD2/3 konnte durch eine Blockade des TGF-beta-Signalweges inhibiert werden. Dies l��sst vermuten, dass die Funktion von sGARP zumindest teilweise von TGF-beta abh��ngig ist. Zus��tzlich zu seiner passiven Rolle als TGF-beta-Transporter, induzierte sGARP die TGF-beta-Produktion in naiven T-Zellen und tr��gt so zum Mechanismus der infekti��sen Toleranz bei. Des Weiteren f��rdert die Stimulation von sGARP in Anwesenheit von IL-6 und IL-23 die Differenzierung zu Th17 Zellen. rnNeben dem Einfluss von sGARP auf die Differenzierung von CD4+ T-Zellen, supprimiert sGARP die Proliferation und Granzyme B-Expression in CD8+ T-Zellen. rnF��r die Analyse der immunmodulatorischen Funktion von sGARP in vivo wurde ein Modell einer xenogenen GvHD (graft-versus-host disease) verwendet. Der Transfer von humanen PBMC in neugeborene, immundefiziente Rag2-/-gamma-chain-/--M��use f��hrt zu einer letalen GvHD, welche durch die Applikation von humanen Treg dosisabh��ngig unterdr��ckt werden kann. In diesem Modell konnte die repetitive Gabe von sGARP, ohne zus��tzliche Zugabe von Treg, ebenfalls die GvHD unterdr��cken. Dies l��sst auf einen synergistischen Effekt von sGARP und Treg bei der Suppression inflammatorischer T-Zellantworten schlie��en. rnZusammengefasst lassen die Ergebnisse auf eine entscheidende Rolle von GARP in der Modulation der peripheren Toleranz folgern und zeigen sGARP als potentes Biological f��r die Behandlung von unerw��nschten inflammatorischen Immunantworten.

In vitro generation and characterization of acute myeloid leukemia-reactive CD8 + cytotoxic T-lymphocyte clones from healthy donors

Donor-derived CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) eliminating host leukemic cells mediate curative graft-versus-leukemia (GVL) reactions after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). The leukemia-reactive CTLs recognize hematopoiesis-restricted or broadly expressed minor histocompatibility and leukemia-associated peptide antigens that are presented by human leukocyte antigen (HLA) class I molecules on recipient cells. The development of allogeneic CTL therapy in acute myeloid leukemia (AML) is hampered by the poor efficiency of current techniques for generating leukemia-reactive CTLs from unprimed healthy donors in vitro. In this work, a novel allogeneic mini-mixed lymphocyte/leukemia culture (mini-MLLC) approach was established by stimulating CD8+ T cells isolated from peripheral blood of healthy donors at comparably low numbers (i.e. 10e4/well) with HLA class I-matched primary AML blasts in 96-well microtiter plates. Before culture, CD8+ T cells were immunomagnetically separated into CD62L(high)+ and CD62L(low)+/neg subsets enriched for naive/central memory and effector memory cells, respectively. The application of 96-well microtiter plates aimed at creating multiple different responder-stimulator cell compositions in order to provide for the growth of leukemia-reactive CTLs optimized culture conditions by chance. The culture medium was supplemented with interleukin (IL)-7, IL-12, and IL-15. On day 14, IL-12 was replaced by IL-2. In eight different related and unrelated donor/AML pairs with complete HLA class I match, numerous CTL populations were isolated that specifically lysed myeloid leukemias in association with various HLA-A, -B, or -C alleles. These CTLs recognized neither lymphoblastoid B cell lines of donor and patient origin nor primary B cell leukemias expressing the corresponding HLA restriction element. CTLs expressed T cell receptors of single V-beta chain families, indicating their clonality. The vast majority of CTL clones were obtained from mini-MLLCs initiated with CD8+ CD62L(high)+ cells. Using antigen-specific stimulation, multiple CTL populations were amplified to 10e8-10e10 cells within six to eight weeks. The capability of mini-MLLC derived AML-reactive CTL clones to inhibit the engraftment of human primary AML blasts was investigated in the immunodeficient nonobese diabetic/severe combined immune deficient IL-2 receptor common ��-chain deficient (NOD/SCID IL2R��null) mouse model. The leukemic engraftment in NOD/SCID IL2R��null was specifically prevented if inoculated AML blasts had been pre-incubated in vitro with AML-reactive CTLs, but not with anti-melanoma control CTLs. These results demonstrate that myeloid leukemia-specific CTL clones capable of preventing AML engraftment in mice can be rapidly isolated from CD8+ CD62L(high)+ T cells of healthy donors in vitro. The efficient generation and expansion of these CTLs by the newly established mini-MLLC approach opens the door for several potential applications. First, CTLs can be used within T cell-driven antigen identification strategies to extend the panel of molecularly defined AML antigens that are recognizable by T cells of healthy donors. Second, because these CTLs can be isolated from the stem cell donor by mini-MLLC prior to transplantation, they could be infused into AML patients as a part of the stem cell allograft, or early after transplantation when the leukemia burden is low. The capability of these T cells to expand and function in vivo might require the simultaneous administration of AML-reactive CD4+ T cells generated by a similar in vitro strategy or, less complex, the co-transfer of CD8-depleted donor lymphocytes. To prepare clinical testing, the mini-MLLC approach should now be translated into a protocol that is compatible with good manufacturing practice guidelines.

Nanoparticles for efficient uptake by human dendritic cells and T lymphocytes to be used in adoptive immunotherapy

Dendritic cells (DCs) are the most potent cell type for capture, processing, and presentation of antigens. They are able to activate na��ve T cells as well as to initiate memory T-cell immune responses. T lymphocytes are key elements in eliciting cellular immunity against bacteria and viruses as well as in the generation of anti-tumor and anti-leukemia immune responses. Because of their central position in the immunological network, specific manipulations of these cell types provide promising possibilities for novel immunotherapies. Nanoparticles (NP) that have just recently been investigated for use as carriers of drugs or imaging agents, are well suited for therapeutic applications in vitro and also in vivo since they can be addressed to cells with a high target specificity upon surface functionalization. As a first prerequisite, an efficient in vitro labeling of cells with NP has to be established. In this work we developed protocols allowing an effective loading of human monocyte-derived DCs and primary antigen-specific T cells with newly designed NP without affecting biological cell functions. Polystyrene NP that have been synthesized by the miniemulsion technique contained perylenmonoimide (PMI) as a fluorochrome, allowing the rapid determination of intracellular uptake by flow cytometry. To confirm intracellular localization, NP-loaded cells were analyzed by confocal laser scanning microscopy (cLSM) and transmission electron microscopy (TEM). Functional analyses of NP-loaded cells were performed by IFN-�� ELISPOT, 51Chromium-release, and 3H-thymidine proliferation assays. In the first part of this study, we observed strong labeling of DCs with amino-functionalized NP. Even after 8 days 95% of DCs had retained nanoparticles with a median fluorescence intensity of 67% compared to day 1. NP loading did not influence expression of cell surface molecules that are specific for mature DCs (mDCs) nor did it influence the immunostimulatory capacity of mDCs. This procedure did also not impair the capability of DCs for uptake, processing and presentation of viral antigens that has not been shown before for NP in DCs. In the second part of this work, the protocol was adapted to the very different conditions with T lymphocytes. We used leukemia-, tumor-, and allo-human leukocyte antigen (HLA) reactive CD8+ or CD4+ T cells as model systems. Our data showed that amino-functionalized NP were taken up very efficiently also by T lymphocytes, which usually had a lower capacity for NP incorporation compared to other cell types. In contrast to DCs, T cells released 70-90% of incorporated NP during the first 24 h, which points to the need to escape from intracellular uptake pathways before export to the outside can occur. Preliminary data with biodegradable nanocapsules (NC) revealed that encapsulated cargo molecules could, in principle, escape from the endolysosomal compartment after loading into T lymphocytes. T cell function was not influenced by NP load at low to intermediate concentrations of 25 to 150 ��g/mL. Overall, our data suggest that NP and NC are promising tools for the delivery of drugs, antigens, and other molecules into DCs and T lymphocytes.

Identification of preferentially targeted tumor-associated antigens in melanoma patients via mRNA stimulation of CD8+ blood lymphocytes

Until now, therapeutic vaccination of cancer patients has mainly relied on rather few T cell epitopes processed from structurally normal shared tumor antigens and presented by frequent HLA alleles. So far the design of these studies has not addressed the individuality of tumor-host interactions, which are not only determined by the antigenic tumor phenotype or the natural HLA polymorphism, but also by the individual T cell repertoire. The procedure described herein was developed to identify the preferential targets of the individual repertoire from a panel of known shared tumor-associated antigens. Lymphocytes were isolated from the peripheral blood of cancer patients or healthy donors and stimulated twice with autologous mRNA-transfected FastDC (Dauer et al., J Immunol. 170:4069, 2003). FastDC were generated from blood monocytes and separately transfected via lipofection with in vitro transcribed mRNAs encoding the panel antigens. Responder lymphocytes were tested on day 12 in a 20-hour IFN-g ELISPOT assay for recognition of 293T cells co-transfected pairwise with plasmids encoding the stimulation antigens and the respective individual���s HLA class I alleles. In a first step, stimulation parameters were optimized for the detection of anti-HCMV pp65 responses. A maximum amplification of pp65-specific CD8+ T cell responses was obtained at a rather low IL-2 concentration (25 IU/ml) and at a minimum APC-to-effector ratio of 1:10. Addition of IL-4, IL-7 or IL-15 did not substantially improve the stimulatory potential. The test was applied to the human melanoma models D05 and MZ2, in both of which multiple T cell-defined antigens had previously been identified by expression screening. Blood lymphocytes were stimulated in parallel with autologous tumor cells and with mRNA-transfected FastDC. In D05, T cell reactivities against three out of eleven epitopes induced by stimulation with tumor cells were also found after stimulation with mRNA-transfected FastDC. Two further T cell target epitopes were identified with mRNA but not with tumor cell stimulation. In MZ2, T cell responses against five distinct epitopes were detected on day 12 after stimulation with mRNA transfectants. The same responses were detectable after stimulation with tumor cells only on day 32. mRNA stimulations against 21 tumor-associated antigens in addition to HCMV pp65 were performed in four healthy individuals. In all cases, CD8+ T cells against HCMV pp65 could be expanded. Among tumor-associated antigens, only reactivity against Melan-A/MART-1 in association with HLA-A*0201 was detectable in one of the donors. The vaccination of patients with targets a priori known to be recognized by their T cell repertoire may help to improve the outcome of therapeutic vaccination.

Generation and characterisation of acute myeloid leukaemia-reactive CD4 + T cells and their potential to eliminate human leukaemia blasts in NSG mice

Acute myeloid leukaemia (AML) is a cancer of the haematopoietic system, which can in many cases only be cured by haematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and donor lymphocyte infusion (DLI) (Burnett et al., 2011). This therapy is associated with the beneficial graft-versus-leukaemia (GvL) effect mediated by transplanted donor T and NK cells that either recognise mismatch HLA molecules or polymorphic peptides, so-called minor histocompatibility antigens, leukaemia-associated or leukaemia-specific antigens in the patient and thus eliminate remaining leukaemic blasts. Nevertheless, the mature donor-derived cells often trigger graft-versus-host disease (GvHD), leading to severe damages in patients��� epithelial tissue, mainly skin, liver and intestine (Bleakley & Riddell, 2004). Therefore, approaches for the selective mediation of strong GvL effects are needed, also in order to prevent relapse after transplantation. One promising opportunity is the in vitro generation of AML-reactive CD4+ T cells for adoptive transfer. CD4+ T cells are advantageous compared to CD8+ T cells, as HLA class II molecules are under non-inflammatory conditions only expressed on haematopoietic cells; a fact that would minimise GvHD (Klein & Sato, 2000). In this study, naive CD4+ T cells were isolated from healthy donors and were successfully stimulated against primary AML blasts in mini-mixed lymphocyte/leukaemia cell cultures (mini-MLLC) in eight patient/donor pairs. After three to seven weekly restimulations, T cells were shown to produce TH1 type cytokines and to be partially of monoclonal origin according to their TCR V�� chain usage. Furthermore, they exhibited lytic activity towards AML blasts, which was mediated by the release of granzymes A and B and perforin. The patient/donor pairs used in this study were fully HLA-class I matched, except for one pair, and also matched for HLA-DR and -DQ, whereas -DP was mismatched in one or both alleles, reflecting the actual donor selection procedure in the clinic (Begovich et al., 1992). Antibody blocking experiments suggested that the generated CD4+ T cells were directed against the HLA-DP mismatches, which could be confirmed by the recognition of donor-derived lymphoblastoid cell lines (LCLs) electroporated with the mismatched DP alleles. Under non-inflammatory conditions primary fibroblasts did not express HLA-DP and were thus not recognised, supporting the idea of a safer application of CD4+ T cells regarding induction of GvHD. For the assessment of the biological significance of these T cells, they were adoptively transferred into NSG mice engrafted with human AML blasts, where they migrated to the bone marrow and lymphoid tissue and succeeded in eliminating the leukaemic burden after only one week. Therefore, AML-reactive CD4+ T cells expanded from the naive compartment by in vitro stimulation with primary leukaemia blasts appear to be a potent tool for DLI in HSCT patients and promise to mediate specific GvL effects without causing GvHD.

Tolerance and immunity to human tumor-associated antigens

Tumor-assoziierte Antigene (TAA) repr��sentieren wichtige Zielstrukturen in zytotoxischen T-Zell (ZTL)-basierten Immuntherapien zur Behandlung maligner Erkrankungen. Die Tatsache, dass TAA nicht spezifisch nur in Tumoren sondern auch in nicht-transformierten Zellen vorhanden sind, kann infolge verschiedener Toleranz-Mechanismen zur Eliminierung von ZTL f��hren, deren T-Zell-Rezeptoren eine hohe Affinit��t f��r TAA besitzen. Entsprechend erfordert die Entwicklung effektiver Immuntherapeutika die genaue Analyse des verf��gbaren T-Zell-Repertoires mit Spezifit��t f��r ein gegebenes TAA.Die Arbeit fokusierte das Tyrosinase (369-377) ZTL-Epitop, das im Komplex mit HLA-A*0201 (A2.1) auf der Zell-Oberfl��che von malignen Melanomen und verschiedenen nicht-transformierten Zellen pr��sentiert wird. Es wurde gefunden, dass sowohl das humane als auch das murine Tyrosinase (369-377)-spezifische ZTL-Repertoire durch Selbst-Toleranz kompromittiert ist und dass diese Toleranz weder durch Verwendung einer bestimmten Peptid-Variante noch durch Interferenz mit CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen oder CTLA-4 umgangen werden kann. Diese Ergebnisse wurden anschlie��end auf ein anderes Krankheitsmodell, das Multiple Myelom (MM), adaptiert. Unter Umgehung von Selbst-Toleranz in A2.1-transgenen M��usen wurde gezeigt, dass Transkriptionsfaktoren, die die terminale Differenzierung von B-Zellen in maligne und nicht-maligne Plasmazellen diktieren, als MM-assoziierte ZTL-Epitope dienen k��nnen.Diese Arbeit bietet einen bedeutenden und innovativen Beitrag zur Gestaltung von Tyrosinase-basierten Melanom- und MM-reaktiven Immuntherapien.

Rolle von NFATc2 in einem murinen Asthmamodell

Nuclear factor of activated T cells (NFAT) ist eine Familie der Transkriptionsfaktoren, welche eine wichtige Rolle bei der Regulation der T-Zellvermittelten Signalkaskade in der Lymphozytenpopulation spielt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Nuclear Factor of Activated T cells-2 (NFATc2) defiziente M��use einen erh��hten Atemwegswiderstand, einen pathologische Ver��nderung der Lunge und einen erh��hten IgE Spiegel im Vergleich zu den Wildtypen vorweisen. Die NFATc2 Defizienz konnte ebenfalls sowohl mit einer erh��hten Anzahl an Th2 und Th17 Zellen, die eine erh��hte Proliferation vorweisen, als auch einer erniedrigten Anzahl an CD8+ CD122- T-Zellen, die geringere Mengen an IFN-g produzieren, in Verbindung gebracht werden. Die aus den NFATc2(-/-) M��usen isolierten CD4+ T-Zellen zeigen im Vergleich zu denen der Wildtypen neben der erh��hten Proliferation einen vermehrte Aktivierung (CD4higCD44highCD69high). Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass in Anwesenheit eines Allergens, die NFATc2(-/-) M��use eine erh��hte Anzahl an regulatorischen T-Zellen (CD4+CD25+Foxp3+GITR++) in der Lunge vorweisen, die wiederum die Effektorzellen in diesen hemmen. Ein Grund f��r die geringere Freisetzung an IFN-g durch die CD8+ T-Zellen in den NFATc2 defizienten M��usen ist eine erh��hte Subpopulation von CD8+CD122+ (IL-2Rb Kette) CD127hi (IL-7Ra Kette) ���long-lived memory Zellen��� in den NFATc2(-/-) M��usen. Diese besitzen einen regulatorischen Effekt, so dass immundefiziente SCID M��use, die in einem adoptiven Transfer mit OVA-spezifischen CD8+ und CD4+ T-Zellen, welchen aus NFATc2(-/-) M��use isoliert werden, behandelt wurden, eine erh��hten Atemwegswiderstand, eine erh��hte IL-17 und eine erniedrigte IFN-g Produktion vorweisen. Eine Depletion der memory CD8+CD122+IL-7Rhigh T-Zellen hebt dagegen die verringerte IFN-g Produktion der CD8+CD122- T-Zellen auf und f��hrt zu einer Erniedrigung des Atemwegswiderstandes in einem SCID Model Zusammenfassend zeigen unsere Untersuchungen, dass sowohl die IFN-g Produktion der CD8+ Effektor T-Zellen als auch die Anzahl an CD4+CD25+Foxp3+GITR++ regulatorischen T-Zellen die Entwicklung der Th2 und Th17 als auch die H��he des Atemwegswiderstandes unterdr��ckt.

Die Rolle CD4 + CD25 + regulatorischer T-Zellen in der Niedrigzonentoleranz gegen��ber Kontaktallergenen

Die allergische Kontaktdermatitis ist eine der h��ufigsten Berufserkrankungen, die durch die Exposition mit hohen Mengen eines Kontaktallergens ausgel��st wird. In Mausmodellen sehen wir, dass mittels einer Niedrigzonentoleranz (NZT) die Bildung einer Kontaktsensibilisierung unterdr��ckt werden kann. Bei der NZT f��hrt die epikutane Applikation von subimmunogenen Dosen zu einer systemischen Toleranzentwicklung, die durch CD8+ Suppressor-T-Zellen Hapten-spezifisch vermittelt wird. F��r die Generierung dieser CD8+ Suppressor-T-Zellen sind IL-10-sezernierende CD4+ regulatorischen T-Zellen (Tregs) notwendig. Aufbauend auf diesen Ergebnissen sollte in dieser Arbeit ��berpr��ft werden, ob nat��rlichen Tregs (nTregs) bei der NZT eine Rolle spielen und die Funktion und Aufgaben dieser Zellen w��hrend der NZT untersucht werden. rnWir konnten keine erh��hte Anzahl von nTregs w��hrend der Niedrigzonentoleranz gegen��ber Kontaktallergenen im Vergleich zur CHS charakterisieren. Weiterhin haben wir gezeigt, dass eine Reduktion der nTregs durch Depletion mittels anti-CD25-Anik��rper oder durch Cyclophosphamid-Gabe die Entstehung der CD8+ Suppressor-T-Zellen der NZT unterdr��ckt und damit die Entwicklung der Toleranzreaktion verhindert wird. Ferner wurde beobachtet, dass eine epikutane NZT Hapten-spezifisch durch CD8+ T-Zellen ��bertragen werden kann, w��hrend CD4+CD25+ T-Zellen eine Hapten-unspezifische Wirkung zeigten.rn