Untersuchungen zur Plasmapheresetherapie bei Patienten mit thrombotisch thrombozytopenischer Purpura

Die thrombotische thrombozytopenische Purpura (TTP) ist charakterisiert durch eine Triade aus Thrombozytopenie, hämolytischer Anämie und Mikrothromben. Ursächlich für diese Mikroangiopathie ist ein Mangel der Von Willebrand Faktor (VWF)-spaltenden Protease, ADAMTS13, der durch Autoantikörper oder eine genetische Mutation bedingt sein kann. In der Folge treten hochmolekulare, prothrombotische VWF Multimere im Blut auf, die eine Plättchenadhäsion und -aggregation initiieren, die zu mikrovaskulären Thromben in den Arteriolen und Kapillaren zahlreicher Organe insbesondere im zentralen Nervensystem führt. rnMomentan ist der Goldstandard der Therapie dieser ansonsten tödlich verlaufenden Erkrankung, die Plasmapherese (PEX). Hierfür stehen mit Fresh Frozen Plasma (FFP) und solvent/detergent (s/d) Plasma zwei Präparate zur Verfügung. Die Effizienz der Therapie bei der TTP konnte in den letzten Jahrzehnten im klinischen Alltag belegt werden, dennoch geht die intensive und invasive Therapie mit vielen Risiken und Nebenwirkungen für die Patienten einher, die in dieser Arbeit herausgearbeitet werden sollten. rnIn einer deutschlandweiten Patientenstudie wurde retrospektiv, mittels Fragebögen, ein Nebenwirkungsprofil der Plasmapherese erstellt, sowie mögliche Prädispositionen für die TTP untersucht. Zudem wurden mögliche Auslöser für das Auftreten einer klinisch manifesten TTP analysiert. Die Auswertung zeigte, dass Parästhesien (64,4 %) und Schüttelfrost (61,2 %) als häufigste Nebenwirkungen der PEX bei den Patienten auftraten. Weitere Symptome waren vermehrte Kopfschmerzen (50,6 %) und Tachykardien (36,8 %). Nebenwirkungen wie schwerer Kollaps (9 %) traten selten auf. Patienten mit Allergien in der Anamnese reagierten nicht empfindlicher auf die PEX, als andere. Ein Unterschied in der Häufigkeit der Nebenwirkungen hinsichtlich der verschiedenen Plasmapräparate konnte nicht gezeigt werden, relativiert wird dies durch den sehr geringen Einsatz von Octaplas® bei der untersuchten Patientenkohorte.rnEs konnte eine deutliche Verbindung zwischen dem Auftreten der TTP und anderen Autoimmunerkrankungen gezeigt werden. Von insgesamt 87 Patienten leiden 20,8 % an einer weiteren Autoimmunerkrankung. Insbesondere die Hashimoto Thyreoiditis liegt bei den Befragten als häufige Begleiterkrankung vor. Die genetische Prädisposition hat sich in den vergangen Jahren als ein primärer Risikofaktor für die TTP herausgestellt.rnAls mögliche Trigger eines TTP Schubes konnten Infektionen (38,7 %), Medikamente (u.a. Kontrazeptiva, Chinolone, Clarithromycin) (24,3 %), und Schwangerschaft (5,4 %) ausgemacht werden.rnEin weiterer Untersuchungspunkt der Dissertation war die Beurteilung der ADAMTS13-Aktivität in den Plasmapräparaten. Hierfür wurden drei verschieden Methoden, zwei auf Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer beruhende Assays und eine turbidimetrische Messung, verwendet. In allen Methoden konnte eine physiologische ADAMTS13-Aktivität, 646 ng/ml für FFP und 634 ng/ml für Octaplas®, gemessen werden, die sich für beide Präparate nicht signifikant unterschied. Auffällig waren jedoch die höheren Schwankungen der Aktivität bei den verschiedenen Chargen bei FFP gegenüber Octaplas®. rnAufgrund des Herstellungsverfahrens bietet Octaplas® einen sichereren Schutz vor Virusübertragungen und dem Auftreten von TRALI als FFP. Jedoch kann es aufgrund der niedrigen Konzentration an Protein S prothrombotisch wirken. FFP enthält dagegen einen höheren Gehalt an Gerinnungsfaktoren. rnAbschließend ist festzuhalten, dass beide Präparate für die Therapie der TTP geeignet sind. Welches Präparat gewählt wird, sollte individuell für den zu behandelnden Patienten entschieden werden. Bei TTP-Patienten, die in der Vergangenheit bereits sensibel auf FFP reagierten, bietet sich eine Therapie mit Octaplas® an. Die schnelle Bereitstellung einer adäquaten Therapie spielt bei der thrombotisch thrombozytopenischen Purpura die entscheidende Rolle.

Lokalisation und Quantifizierung von 4-Hydroxynonenal in der Kochlea des Meerschweinchens nach Applikation von Gentamicin

Einleitung und Literaturdiskussion: Gentamicin ist ein aus Bakterien gewonnenes Aminoglykosid-Antibiotikum, das seit vielen Jahren im klinischen Alltag zur Therapie von bakteriellen Infektionen und zur Behandlung des Morbus Ménière eingesetzt wird. Ein bedeutender, jedoch noch nicht vollständig verstandener, Pathomechanismus ist dabei die Entstehung von 4-HNE durch Lipid Peroxidation und die konsekutive Schädigung durch das gebildete Aldehyd. Ziel dieser Arbeit war es, die Beeinflussung der Expression von 4-HNE in sieben verschiedenen Regionen der Kochlea (SV, SL, CO, NF, LF, IDZ und SGZ) durch Gentamicin zu beschreiben und quantitativ zu ermitteln.rnMaterial und Methoden: Die Meerschweinchen wurden in vier Gruppen unterteilt: eine unbehandelte Kontrollgruppe und je eine Gruppe 1, 2 und 7 Tage nach Gentamicin-Applikation. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Kochleae den Tieren entnommen, das Gewebe fixiert, geschnitten und auf Objektträgern aufgebracht. Die Schnitte wurden mit 4-HNE-Antikörpern behandelt und die Immunreaktion mikroskopisch lokalisiert und zelluläre quantitative Unterschiede am Computer berechnet.rnErgebnisse: Die Auswertung der Daten ergab signifikante Anstiege der Immunreaktion auf 4-HNE von der Kontrollgruppe zu allen drei Behandlungsgruppen in vier der sieben untersuchten Regionen (Stria vascularis, Spirales Ligament, Cortisches Organ und Nervenfasern). In zwei Bereichen (Fibrozyten im Limbus und Interdentalzellen) kam es zwischen Kontrollgruppe und nur einer Behandlungsgruppe D (7d) zu einer signifikanten Erhöhung. Lediglich die Spiralganglionzellen erbrachten keine signifikanten Differenzen. Der Vergleich der Einzelwindungen erbrachte für die Stria vascularis, das Spirale Ligament, das Cortische Organ und die Nervenfasern signifikante Anstiege innerhalb der drei Windungen von der Kontrollgruppe zu den drei Behandlungsgruppen. Bei der Stria vascularis zeigte sich als einzige Region eine signifikant erhöhte Immunfärbung in allen drei Einzelwindungen von der Kontrollgruppe zu allen Behandlungsgruppen. Beim Vergleich der Gesamtwindungen ließ sich ausschließlich für die Region der Stria vascularis von der ersten zur dritten Windung ein Anstieg der Braunfärbung feststellen. Zudem konnten Korrelationen der Färbeintensitäten einerseits zwischen den beiden Regionen der Lateralen Wand und andererseits zwischen zwei Zelltypen im Limbus aufgezeigt werden.rnDiskussion: Die durch Gentamicin-gesteigerte 4-HNE-Expression kann durch genomische und nicht-genomische Prozesse hervorgerufen werden.

Expressionsunterschiede verschiedener miRNAs bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen

Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen konfrontieren unsere heutige Gesellschaft mit hohen Inzidenzraten in der westlichen Welt und zunehmend steigenden Inzidenzraten im asiatischen Raum. Die Folgen für die Patienten sind eine starke Beeinträchtigung der Lebensqualität, mit sozialen und wirtschaftlichen Folgen sowie ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung kolorektaler Karzinome. Durch die Entdeckung von 22 nt langen, regulierenden RNAs, auch genannt miRNAs, wurde ein neuer Baustein im Verständnis zellulärer Regelprozesse und der Differenzierung und Aktivierung von Antworten etwa des Immunsystems entdeckt. Somit stellt sich die Frage nach der Bedeutung von miRNAs im Rahmen von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen. Hierzu wurden in dieser Arbeit über ein miRNA-Array System 12 miRNAs als potentiell relevante Ziele identifiziert und an einem Kollektiv aus insgesamt 131 Patienten und 163 Biopsien aus dem Bereich des Darmes überprüft. Es zeigte sich hierbei, dass im Rahmen eines Morbus Crohn mit Befall des Dickdarms die miRNAs let-7d und miR-22 in gesteigerter Expression vorlagen. Da im terminalen Ileum eine gesonderte Immunsituation vorliegt, wurde dieser Bereich zusätzlich bei der Erkrankung Morbus Crohn untersucht. Es zeigten sich Expressionsveränderungen für die miRNAs miR-30e, miR-185, miR-374b und miR-424. Bei Patienten mit einer Colitis ulcerosa waren die miRNAs let-7d, miR-185 und miR-424 in ihrem Expressionsverhalten verändert. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass in Abhängigkeit vom Entzündungsgrad bei bestehender Colitis ulcerosa eine zunehmenden Überexpression der miRNAs let-7d, miR-185 und miR-424 erfolgte. Die miRNAs miR-18a und miR-185 wiesen unter Remissionsbedingungen Expressionsveränderungen auf und lassen somit den Verdacht eines protektiven Effektes aufkommen. Mit Hilfe von computerbasierten Datenbankanalysen konnten gemeinsam regulierenden miRNAs Proteine und Pathways zugeordnet werden, welche einen Zusammenhang mit bereits pathogenetisch bestätigten Signalwegen wie etwa dem nF-ĸB und MAPK-Signalweg nahelegen. Auch konnte herausgearbeitet werden, dass einige, der von diesen miRNAs regulierten Proteine, bereits in veröffentlichten Arbeiten als fehlreguliert festgestellt wurden, jedoch blieb die Ursache dieser Fehlregulation gänzlich unbekannt. Mit den in dieser Arbeit erhobenen Daten konnte gezeigt werden, dass eine Kongruenz der Befunde vorliegt, welche einen Zusammenhang der miRNA-Expression mit der Fehlregulation bestimmter Proteine nicht nur nahelegt, sondern darüber hinaus auch noch einige weitere potentielle Proteinziele für weitere Untersuchungen aufführt. Dazu ist es jedoch notwendig, die Relevanz der hier entdeckten, computerbasierten Proteine in zukünftigen Untersuchungen einer genauen Prüfung zu unterziehen.

Parahydrogen induced polarization on a clinical MRI system : polarization transfer of two spin order

Hyperpolarization techniques enhance the nuclear spin polarization and thus allow for new nuclear magnetic resonance applications like in vivo metabolic imaging. One of these techniques is Parahydrogen Induced Polarization (PHIP). It leads to a hyperpolarized 1H spin state which can be transferred to a heteronucleus like 13C by a radiofrequency (RF) pulse sequence. In this work, timing of such a sequence was analyzed and optimized for the molecule hydroxyethyl propionate. The pulse sequence was adapted for the work on a clinical magnetic resonance imaging (MRI) system which is usually equipped only with a single RF transmit channel. Optimal control theory optimizations were performed to achieve an optimized polarization transfer. A drawback of hyperpolarization is its limited lifetime due to relaxation processes. The lifetime can be increased by storing the hyperpolarization in a spin singlet state. The second part of this work therefore addresses the spin singlet state of the Cs-symmetric molecule dimethyl maleate which needs to be converted to the spin triplet state to be detectable. This conversion was realized on a clinical MRI system, both by field cycling and by two RF pulse sequences which were adapted and optimized for this purpose. Using multiple conversions enables the determination of the lifetime of the singlet state as well as the conversion efficiency of the RF pulse sequence. Both, the hyperpolarized 13C spin state and the converted singlet state were utilized for MR imaging. Careful choice of the echo time was shown to be crucial for both molecules.

Untersuchungen zur autoimmunen Genese der thrombotisch thrombozytopenischen Purpura

Untersuchungen zur autoimmunen Genese der thrombotisch thrombozytopenischen Purpura. rnEinführung: Die idiopathische thrombotisch thrombozytopenische Purpura (TTP) ist eine lebensbedrohliche Mikroangiopathie und wird durch ein Autoantikörper-induziertes Defizit der ADAMTS13-Protease ausgelöst. Eine Assoziation zwischen Krankheitsprädisposition und Vorliegen bestimmter humaner Leukozytenantigene (HLA) wird vermutet. Untersuchungen zu diesem Zusammenhang stellen einen Teil dieser Arbeit dar. rnAutoimmunkrankheiten tendieren zum gemeinsamen Auftreten innerhalb eines Individuums. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird untersucht, ob eine solche Kookkurrenz verschiedener Autoimmunkrankheiten auch bei Patienten mit idiopathischer TTP beobachtet werden kann.rnMethodik: Zur Untersuchung der ersten Fragestellung werden die HLA-Klasse I und II-Merkmale von 54 deutschen TTP-Patienten bestimmt. Alle Patienten weisen Autoantikörper gegen ADAMTS13 und eine Protease-Aktivität <5% vor. Die Blutproben werden mittels Sequence Specific Primer-Polymerase Chain Reaction (PCR) und Sequence Specific Oligonucleotid-PCR auf HLA-DRB1, -DRB3-5 und –DQB1 untersucht. Als Referenz dienen die Werte deutscher Knochenmark- und Blutspender, erhalten über www.allelefrequencies.net. Die statistische Auswertung erfolgt mittels zweiseitigem Binomialtest und die resultierenden p-Werte werden nach Benjamini-Hochberg korrigiert.rnZur Beantwortung der zweiten Fragestellung werden 76 deutsche TTP-Patienten anhand eines standardisierten Fragebogens nach Begleiterkrankungen befragt. Als Vergleichswerte dient die Prävalenz der jeweiligen Erkrankung in der Allgemeinbevölkerung. Die statistische Auswertung erfolgt mittels zweiseitigem Binomialtest. Da die p-Werte nicht korrigiert werden, sind die Ergebnisse nur deskriptiv zu verstehen.rnErgebnis: Der Vergleich der HLA-Frequenzen ergibt ein signifikant gehäuftes Vorkommen von HLA-DQB1*02:02 (p<0,001) und -DRB1*11 (p=0,003) innerhalb des Patientenkollektivs. 20% (DQB1*02:02) bzw. 48,1% (DRB1*11) der TTP-Patienten sind im Gegensatz zu nur 1,2% (DQB1*02:02) bzw. 23,5% (DRB1*11) innerhalb der Vergleichsgruppe für das jeweilige HLA-Merkmal positiv.rnDie Befragung der TTP-Patienten bezüglich weiterer Erkrankungen ergab im Vergleich mit der Allgemeinbevölkerung fünf auffällig häufig im Patientenkollektiv vorkommende Autoimmunkrankheiten: Hashimoto Thyreoiditis (23,5% in der Patientengruppe zu 0,7% in der Allgemeinbevölkerung; p<0,001), systemischer Lupus erythematodes (6,5% der Patienten im Gegensatz zu 0,025% in der Allgemeinbevölkerung, p<0,001), Immunthrombozytopenie (6,3% der Patienten zu 0,02% in der Allgemeinbevölkerung; p<0,001), Psoriasis (9,4% der Patienten zu 2,5% in der Allgemeinbevölkerung; p=0,005) und glutensensitive Enteropathie (3,1% der Patienten zu 0,2% in der Allgemeinbevölkerung; p=0,007). rnSchlussfolgerung: Das vermehrte Vorkommen bestimmter HLA-Merkmale im Patientenkollektiv spricht für eine prädisponierende Wirkung dieser Antigene im Krankheitsgeschehen. Eine mögliche HLA-vermittelte Assoziation zwischen TTP und den genannten Autoimmunkrankheiten wird vermutet, kann jedoch nicht in allen Fällen die beobachtete Kookkurrenz ausreichend erklären. Insgesamt bestätigt die vorliegende Arbeit die Assoziation verschiedener Autoimmunkrankheiten untereinander und spricht für eine genetische Prädisposition zur Ausbildung autoimmuner Störungen. rn

Design of cell adhesive and angiogenic titanium surfaces for cellular stimulation

Die Förderung der Zelladhäsion durch sogenannte biomimetische Oberflächen wird in der Medizin als vielversprechender Ansatz gesehen, um Komplikationen wie z. B. Fremdkörperreaktionen nach der Implantation entgegenzuwirken. Neben der Immobilisierung einzelner Biomoleküle wie z. B. dem RGD-Peptid, Proteinen und Wachstumsfaktoren auf verschiedenen Materialien, konzentriert man sich derzeit in der Forschung auf die Co-Immobilisierung zweier Moleküle gleichzeitig. Hierbei werden die funktionellen Gruppen z. B. von Kollagen unter Verwendung von nur einer Kopplungschemie verwendet, wodurch die Kopplungseffizienz der einzelnen Komponenten nur begrenzt kontrollierbar ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Immobilisierungsverfahrens, welches die unabhängige Kopplung zweier Faktoren kontrolliert ermöglicht. Dabei sollten exemplarisch das adhäsionsfördernde RGD-Peptid (Arginin-Glycin-Asparaginsäure) zusammen mit dem Wachstumsfaktor VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) auf Titan gebunden werden. In weiteren Experimenten sollten dann die pro-adhäsiven Faktoren Fibronektin, Kollagen, Laminin und Osteopontin immobilisiert und untersucht werden. rnDie Aminofunktionalisierung von Titan durch plasma polymerisierte Allylaminschichten wurde als Grundlage für die Entwicklung des nasschemischen Co-immobilisierungsverfahren verwendet. Für eine unabhängige und getrennte Anbindung der verschiedenen Biomoleküle stand in diesem Zusammenhang die Entwicklung eines geeigneten Crosslinker Systems im Vordergrund. Die Oberflächencharakterisierung der entwickelten Oberflächen erfolgte mittels Infrarot Spektroskopie, Surface Plasmon Resonance Spektroskopie (SPR), Kontaktwinkelmessungen, Step Profiling und X-Ray Photoelectron Spektroskopie (XPS). Zur Analyse der Anbindungsprozesse in Echtzeit wurden SPR-Kinetik Messungen durchgeführt. Die biologische Funktionalität der modifizierten Oberflächen wurde in vitro an Endothelzellen (HUVECs) und Osteoblasten (HOBs) und in vivo in einem Tiermodell-System an der Tibia von Kaninchen untersucht.rnDie Ergebnisse zeigen, dass alle genannten Biomoleküle sowohl einzeln auf Titan kovalent gekoppelt als auch am Bespiel von RGD und VEGF in einem getrennten Zwei-Schritt-Verfahren co-immobilisiert werden können. Des Weiteren wurde die biologische Funktionalität der gebundenen Faktoren nachgewiesen. Im Falle der RGD modifizierten Oberflächen wurde nach 7 Tagen eine geförderte Zelladhäsion von HUVECs mit einer signifikant erhöhten Zellbesiedlungsdichte von 28,5 % (p<0,05) gezeigt, wohingegen auf reinem Titan Werte von nur 13 % beobachtet wurden. Sowohl VEGF als auch RGD/VEGF modifizierte Proben wiesen im Vergleich zu Titan schon nach 24 Stunden eine geförderte Zelladhäsion und eine signifikant erhöhte Zellbesiedlungsdichte auf. Bei einer Besiedlung von 7,4 % auf Titan, zeigten VEGF modifizierte Proben mit 32,3 % (p<0,001) eine deutlichere Wirkung auf HUVECs als RGD/VEGF modifizierte Proben mit 13,2 % (p<0,01). Die pro-adhäsiven Faktoren zeigten eine deutliche Stimulation der Zelladhäsion von HUVECs und HOBs im Vergleich zu reinem Titan. Die deutlich höchsten Besiedlungsdichten von HUVECs konnten auf Fibronektin mit 44,6 % (p<0,001) und Kollagen mit 39,9 % (p<0,001) nach 24 Stunden beobachtet werden. Laminin zeigte keine und Osteopontin nur eine sehr geringe Wirkung auf HUVECs. Bei Osteoblasten konnten signifikant erhöhte Besiedlungsdichten im Falle aller pro-adhäsiven Faktoren beobachtet werden, jedoch wurden die höchsten Werte nach 7 Tagen auf Kollagen mit 90,6 % (p<0,001) und Laminin mit 86,5 % (p<0,001) im Vergleich zu Titan mit 32,3 % beobachtet. Die Auswertung der Tierexperimente ergab, dass die VEGF modifizierten Osteosyntheseplatten, im Vergleich zu den reinen Titankontrollen, eine gesteigerte Knochenneubildung auslösten. Eine solche Wirkung konnte für RGD/VEGF modifizierte Implantate nicht beobachtet werden. rnInsgesamt konnte gezeigt werden, dass mittels plasmapolymerisierten Allylamin Schichten die genannten Biomoleküle sowohl einzeln gebunden als auch getrennt und kontrolliert co-immobilisiert werden können. Des Weiteren konnte eine biologische Funktionalität für alle Faktoren nach erfolgter Kopplung in vitro gezeigt werden. Wider Erwarten konnte jedoch kein zusätzlicher biologischer Effekt durch die Co-immobilisierung von RGD und VEGF im Vergleich zu den einzeln immobilisierten Faktoren gezeigt werden. Um zu einer klinischen Anwendung zu gelangen, ist es nun notwendig, das entwickelte Verfahren in Bezug auf die immobilisierten Mengen der verschiedenen Faktoren hin zu optimieren. rn

Generation of FLT3-ITD-reactive T-cell populations from different sources

Approximately 25% of acute myeloid leukemias (AMLs) carry internal tandem duplications (ITD) of various lengths within the gene encoding the FMS-like tyrosine kinase receptor 3 (FLT3). Although varying duplication sites exist, most of these length mutations affect the protein´s juxtamembrane domain. FLT3-ITDs support leukemic transformation by constitutive phosphorylation resulting in uncontrolled activation, and their presence is associated with worse prognosis. As known form previous work, they represent leukemia- and patient-specific neoantigens that can be recognized by autologous AML-reactive CD8+ T cells (Graf et al., 2007; Graf et al., unpublished). Herein, in patient FL, diagnosed with FLT3-ITD+ AML and in first complete remission after induction chemotherapy, T cells against her leukemia´s individual FLT3-ITD were detected at a frequency up to 1.7x10-3 among peripheral blood CD8+ T lymphocytes. This rather high frequency suggested, that FLT3-ITD-reactive T cells had been expanded in vivo due to the induction of an anti-leukemia response.rnrnCell material from AML patients is limited, and the patients´ anti-leukemia T-cell repertoire might be skewed, e.g. due to complex previous leukemia-host interactions and chemotherapy. Therefore, allogeneic sources, i.e. buffy coats (BCs) from health donors and umbilical cord blood (UCB) donations, were exploited for the presence and the expansion of FLT3-ITD-reactive T-cell populations. BC- and UCB-derived CD8+ T cells, were distributed at 105 cells per well on microtiter plates and, were stimulated with antigen-presenting cells (APCs) transfected with in vitro-transcribed mRNA (IVT-mRNA) encoding selected FTL3-ITDs. APCs were autologous CD8- blood mononuclear cells, monocytes or FastDCs.rnrnBuffy coat lymphocytes from 19 healthy individuals were analyzed for CD8+ T-cell reactivity against three immunogenic FLT3-ITDs previously identified in patients VE, IN and QQ and designated as VE_, IN_ and QQ_FLT3-ITD, respectively. These healthy donors carried at least one of the HLA I alleles known to present an ITD-derived peptide from one of these FLT3-ITDs. Reactivities against single ITDs were observed in 8/19 donors. In 4 donors the frequencies of ITD-reactive T cells were determined and were estimated to be in the range of 1.25x10-6 to 2.83x10-7 CD8+ T cells. These frequencies were 1,000- to 10,000-fold lower than the frequency of autologous FLT3-ITD-reactive T cells observed in patient FL. Restricting HLA I molecules were identified in two donors. In one of them, the recognition of VE_FLT3-ITD was found to be restricted by HLA-C*07:02, which is different from the HLA allele restricting the anti-ITD T cells of patient VE. In another donor, the recognition of IN_FLT3-ITD was restricted by HLA-B*35:01, which also had been observed in patient IN (Graf et al., unpublished). By gradual 3´-fragmentation of the IN_FLT3-ITD cDNA, the 10-mer peptide CPSDNEYFYV was identified as the target of allogeneic T cells against IN_FLT3-ITD. rnLymphocytes in umbilical cord blood predominantly exhibit a naïve phenotype. Seven UCB donations were analyzed for T-cell responses against the FLT3-ITDs of patients VE, IN, QQ, JC and FL irrespective of their HLA phenotype. ITD-reactive responses against all stimulatory FLT3-ITDs were observed in 5/7 UCB donations. The frequencies of T cells against single FLT3-ITDs in CD8+ lymphocytes were estimated to be in the range of 1.8x10-5 to 3.6x10-6, which is nearly 15-fold higher than the frequencies observed in BCs. Restricting HLA I molecules were identified in 4 of these 5 positive UCB donations. They were mostly different from those observed in the respective patients. But in one UCB donation T cells against the JC_FLT3-ITD had exactly the same peptide specificity and HLA restriction as seen before in patient JC (Graf et al., 2007). Analyses of UCB responder lymphocytes led to the identification of the 10-mer peptide YESDNEYFYV, encoded by FL_FLT3-ITD, that was recognized in association with the frequent allele HLA-A*02:01. This peptide was able to stimulate and enrich ITD-reactive T cells from UCB lymphocytes in vitro. Peptide responders not only recognized the peptide, but also COS-7 cells co-transfected with FL_FLT3-ITD and HLA-A*02:01.rnrnIn conclusion, T cells against AML- and individual-specific FLT3-ITDs were successfully generated not only from patient-derived blood, but also from allogeneic sources. Thereby, ITD-reactive T cells were detected more readily and at higher frequencies in umbilical cord blood than in buffy coat lymphocytes. It occurred that peptide specificity and HLA restriction of allogeneic, ITD-reactive T cells were identical to autologous patient-derived T cells. As shown herein, allogeneic, FLT3-ITD-reactive T cells can be used for the identification of FLT3-ITD-encoded peptides, e.g. for future therapeutic vaccination studies. In addition, these T cells or their receptors can be applied to adoptive transfer.

Molekulare Epidemiologie von MRSA-Patienten-Isolaten

MRSA ist der wohl bekannteste nosokomiale Infektionserreger weltweit. Die aktuelle Situation ist aufgrund der schnellen Ausbreitung, vor allem von caMRSA, in einigen Ländern besorgniserregend. Für den Raum Mainz konnte innerhalb der fünf Untersuchungsjahre eine stabile Populationsstruktur nachgewiesen werden, welche hauptsächlich aus deutschlandweit bekannten Epidemiestämmen gebildet wird. Als Besonderheit ergab sich die Dominanz des spa-Typs t003 (> 70 %), sowie das Vorherrschen hoch klonaler Strukturen an UMM und KKM. Diese Umstände lassen auf eine weite Verbreitung von MRSA, speziell des spa-Typs t003, innerhalb der Bevölkerung schließen. Die Bestätigung dieser Vermutung bedarf jedoch weiterer prospektiver Forschung außerhalb der Kliniken.rnAn der UMM konnte im Untersuchungszeitraum 2004-2008 keine Zunahme von klassischen PVL-positiven caMRSA (t008, t019 und t044) festgestellt werden, womit zumindest momentan noch keine Verdrängung von haMRSA durch caMRSA belegt werden konnte.rnDie von WITTE et al. (2004) postulierte 5 % Grenze für den häufigsten detektierten Typ einer Typisierungsmethode muss dahingehend modifiziert werden, dass diese Bedingung zwar allgemein für ein Typisierungsverfahren, nicht aber für lokale Populationen gelten sollte. Im Falle des Vorherrschens klonaler Linien und Subtypen würde keine Methode ausreichend diskriminatorische Eigenschaften aufweisen.rnDie Kombination von spa-Typisierung und PFGE konnte, mit Einschränkungen für den vorherrschenden t003, als geeignet im Falle der Keimdifferenzierung während eines Ausbruchs befunden werden. Als vorteilig für die Interpretation würde sich die Einführung eines generellen MRSA-Screenings für jeden Patienten bei Aufnahme auswirken.rnDie Überprüfung der Thesen von FRÉNAY et al. 1994 ergab keinen Zusammenhang zwischen einer X-Region ≥ 8 Repeats und einem erhöhtem Virulenzpotential. Bezüglich des gesteigerten epidemischen Potentials wurde festgestellt, dass lange X-Regionen generell häufiger auftreten als kurze und somit ein begünstigender Einfluss bei der Kolonisation vermutet aber nicht bewiesen werden kann.rnFür die Detektion von klassischen caMRSA konnte ein Ablaufschema mit Interpretationsrichtlinien erarbeitet werden, welches eine korrekte Differenzierung auch ohne die Einbeziehung patientenbezogener Daten ermöglicht. Die Anlage einer lokalen PFGE-Datenbank zeigte sich dabei als unbedingt notwendig um strittige Fälle als ha- oder caMRSA einzuordnen.rn

A simple and novel method to monitor breathing and heart rate in awake and urethane-anesthetized newborn rodents

Rodents are most useful models to study physiological and pathophysiological processes in early development, because they are born in a relatively immature state. However, only few techniques are available to monitor non-invasively heart frequency and respiratory rate in neonatal rodents without restraining or hindering access to the animal. Here we describe experimental procedures that allow monitoring of heart frequency by electrocardiography (ECG) and breathing rate with a piezoelectric transducer (PZT) element without hindering access to the animal. These techniques can be easily installed and are used in the present study in unrestrained awake and anesthetized neonatal C57/Bl6 mice and Wistar rats between postnatal day 0 and 7. In line with previous reports from awake rodents we demonstrate that heart rate in rats and mice increases during the first postnatal week. Respiratory frequency did not differ between both species, but heart rate was significantly higher in mice than in rats. Further our data indicate that urethane, an agent that is widely used for anesthesia, induces a hypoventilation in neonates whilst heart rate remains unaffected at a dose of 1 g per kg body weight. Of note, hypoventilation induced by urethane was not detected in rats at postnatal 0/1. To verify the detected hypoventilation we performed blood gas analyses. We detected a respiratory acidosis reflected by a lower pH and elevated level in CO2 tension (pCO2) in both species upon urethane treatment. Furthermore we found that metabolism of urethane is different in P0/1 mice and rats and between P0/1 and P6/7 in both species. Our findings underline the usefulness of monitoring basic cardio-respiratory parameters in neonates during anesthesia. In addition our study gives information on developmental changes in heart and breathing frequency in newborn mice and rats and the effects of urethane in both species during the first postnatal week.

Leberregeneration bei fortgeschrittener Leberzirrhose : Untersuchung Albumin-exprimierender Gallengangsproliferate mittels In-situ-Hybridisierung

Die Leber besitzt das Potential nach verursachter Zellschädigung durch chemische, toxische, traumatische oder virale Einwirkung (55, 73, 79, 95) sich selbst zu regenerieren. Dies geschieht entweder durch Hyperplasie der Hepatozyten, d.h. einer Volumenzunahme durch vermehrte Zellteilung und Erhöhung der Zellzahl (73, 79). Bei massiver und chronischer Leberzellschädigung, wie z.B. alkohol-verursachter Leberzirrhose oder durch chronisch virale Hepatitis (55, 74, 81) können die Hepatozyten den entstandenen Defekt nicht kompensieren und die oval cells, Bezeichnung im Rahmen der Nagetiermodelle, werden aktiviert (98, 105). Das humane Equivalent zu den oval cells bei Nagetieren stellen die hepatischen Progenitorzellen dar (79), diese sind in den Hering-Kanälchen lokalisiert (1, 42, 49). Aufgrund ihrer bipotenten Differenzierungsfähigkeit, können aus den hepatischen Progenitorzellen sowohl Hepatozyten als auch Cholangiozyten hervorgehen (18, 45). rnFür die Untersuchungen einer positiven Albumin-mRNA-Expression in Gallengangsproliferaten bei menschlichen zirrhotischen Leberpräparaten, die im Rahmen der Leberregeneration aus hepatischen Progenitorzellen entstehen, bietet sich das bereits etablierte Verfahren der Albumin mRNA in situ Hybridisierung an. Zur Durchführung der Methode wurde ein bereits etabliertes Protokoll zur in situ Hybridiserung von mRNAs peroxisomaler Proteine verwendet (86, 87).rnDas Patientenkollektiv bestand aus insgesamt 50 Patienten (9 weiblichen und 41 männlichen), im Alter von 40 bis 69 Jahren (Median=53, 25 %-Perzentile=49, 75%-Perzentile=60). Sieben Patienten zeigten eine Leberzirrhose auf dem Boden einer Hepatitis B, 24 Patienten eine Leberzirrhose auf dem Boden einer Hepatitis C und 19 Patienten waren an einer äthyltoxisch-bedingten Leberzirrhose erkrankt. Zusätzlich wurde bei insgesamt 23 Patienten im Rahmen der histologischen Befundung ein Hepatozelluläres Karzinom (HCC) diagnostiziert. rnMikroskopisch zeigte sich in 48 von 50 Präparaten eine Gallengangsproliferation innerhalb der bindegewebigen Septen. Bei Vorliegen einer Gallengangsproliferation wurde deren Ausprägung in 4 Grade (0=keine, 1=wenig, 2=mäßig und 3=stark) eingeteilt. Ein möglicher signifikanter Unterschied, ob der Grad einer Gallengangsproliferation auf eine bestimmte Ursache der Leberzirrhose zurück zu führen ist, ließ sich mit einem p-Wert von 0,247 nicht eruieren. Ebenso wie die Gallengansproliferation wurde die Albuminexpression in Grade eingeteilt. Dabei wurde zwischen keiner (Grad 0), einer intermediären (Grad 1) und einer starken (Grad 2) Albuminexpression unterschieden. Hier waren mit einem p-Wert von 0,586 keine Unterschiede zwischen der Gradeinteilung der Albuminexpression und den 3 Gruppen zu erkennen.rnZwischen den Präparaten mit einem HCC und ohne HCC ergaben sich hinsichtlich des Grades der Gallengangsproliferation mit einem p-Wert von 0,803 keine signifikanten Unterschiede. In Bezug auf die Gradeinteilung der Albuminexpressionrnzeigte sich ebenfalls kein signifikanter Unterschied mit einem p-Wert von 0,275 zwischen Präparaten mit und ohne Nachweis eines HCCs. Ebenfalls zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen der Gallengangsproliferation (p-Wert von 0,709) und Albuminexpression (p-Wert von 0,613) zwischen Patienten jünger und älter als 60 Jahre.rnDie Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass mittels der in situ Hybridisierung ein Nachweis der Gallengangsproliferation in leberzirrhotischen Präparaten unterschiedlicher Ätiologien gelingt. Zudem kann diese Arbeit beweisen, dass die Gallengangsproliferate Albumin exprimieren und dass der Nachweis dieser Albuminexpression mittels in situ Hybridisierung möglich ist. Allerdings zeigte sich kein signifikanter Unterschied der Albumin-mRNA-Expression in den Gallengangsproliferaten zwischen den unterschiedlichen Ätiologien der Leberzirrhose und ebenfalls nicht im Vergleich von Leberzirrhosen unterschiedlicher Genese mit und ohne gleichzeitigem Nachweis eines HCCs. rn

Towards antibody-mediated targeting of dendritic cells for cancer immunotherapy with multivalent polymer-antigen conjugates

Der Fokus dieser Arbeit lag auf der definierten Synthese multifunktioneller Polymer-Konjugate zur Anwendung in der Krebs-Immunotherapie. Durch gezielte Variation der Kon-jugationsbedingungen wurde Zusammensetzung, Größe und Aggregationsverhalten in Zell-medium sowie in humanem Serum untersucht. Nach definierter physikalisch-chemischer Charakterisierung wurde dann die induzierte Antigen-Präsentation zur Aktivierung der T-Zellproliferation analysiert.rnDafür wurden zwei verschiedene polymere Carrier-Systeme gewählt, lineares Poly-L-lysin und eine Polylysinbürste (PLL-Bürste). Es wird vermutet, dass die PLL-Bürste aufgrund der anisotropen Form eine bessere Verteilung im Körper und eine verlängerte Zirkulationsdauer zeigen wird. Die zu konjugierenden biologisch aktiven Komponenten waren der antiDEC205-Antikörper (aDEC205) für die gezielte Adressierung CD8-positiver dendritischer Zellen (DC), ein Ovalbumin (OVA)-spezifisches Antigen mit der Kernsequenz SIINFEKL für die Spezifität der Immunantwort gegen Krebszellen, die dieses Antigen tragen, und ein immunaktivieren-der TLR9-Ligand, CpG1826. Die Effizienz dieses Konjugates dendritische Zellen zu aktivieren, welche wiederum eine Immunantwort gegen OVA-exprimierende Krebszellen induzieren, wurde durch die Konjugation aller Komponenten am identischen Trägermolekül deutlich höher erwartet.rnLineares Poly-L-lysin diente als Modellsystem um die Konjugationschemie zu etablieren und dann auf die zylindrische Polylysinbürste zu übertragen. Anhand dieser polymeren Träger wurde das Verhalten der verschiedenen Topologien des Knäuels und der Bürste im Hinblick auf den Einfluss struktureller Unterschiede sowohl auf Konjugationsreaktionen als auch auf das in situ und in vitro Verhalten untersucht.rnFluoreszenzmarkiertes Antigen und der CpG Aktivator konnten jeweils aufgrund einer Thiol-Modifizierung an die Thiol-reaktive Maleimidgruppe des heterobifunktionellen Linkers Sulfo-SMCC an PLL-AlexaFluor48 konjugiert werden. Anschließend wurde aDEC205-AlexaFluor647 an PLL gekoppelt, entweder durch Schiff Base-Reaktion des oxidierten Antikörpers mit PLL und anschließender Reduzierung oder durch Click-Reaktion des PEG-Azids modifizierten An-tikörpers mit Dicyclobenzylcyclooctin (DIBO)-funktionalisiertem PLL. Die Konjugation der biologisch aktiven Komponenten wurde mit Durchflusszytometrie (FACS) und konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) untersucht und die Zusammensetzung des Konjugatesrnmittels UV/Vis-Spektroskopie bestimmt. Die PLL-Bürste alleine zeigte eine hohe Zytotoxizität bei HeLa und JAWS II Zelllinien, wohingegen lineares PLL und PLL-Konjugate sowie die PLL Bürsten-Konjugate keine ausgeprägte Zytotoxizität aufwiesen. Die Polymer-Konjugate wie-sen keine Aggregation in Zellmedium oder humanem Serum auf, was mittels winkelabhängi-ger dynamischer Lichtstreuung bestimmt wurde. CLSM Aufnahmen zeigten Kolokalisation der an die einzelnen Komponenten gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe in dendritischen Zel-len, was die erfolgreiche Konjugation und Internalisierung der Konjugate in die Zellen bele-gen konnte. FACS Messungen ergaben eine geringfügig erhöhte Aufnahme des adressierten PLL-Antigen-Antikörper-Konjugates verglichen mit dem PLL-Antigen-Konjugat. Experimente mit dem „Specific Hybridization Internalization Sensor“ (SHIP) zeigten jedoch nur Aufnahme der PLL-Konjugate in CD8+ unreife DC, nicht in reife DC, die nicht mehr unspezifisch, sondern nur noch über Rezeptoren internalisieren. Dies bewies die unspezifische Aufnahme des Kon-jugates, da Antikörper-Konjugation keine Rezeptor-vermittelte Endozytose in reife DC indu-zieren konnte. T-Zell-Proliferationsassays ergaben eine Aktivierung von CD8+ T-Zellen indu-ziert durch Antigen-tragende Konjugate, wohingegen Konjugate ohne Antigen als Negativ-kontrollen dienten und keine T-Zell-Proliferation erzielten. Es konnte jedoch kein Unter-schied zwischen adressierten und nicht adressierten Konjugaten aufgrund der unspezifischen Aufnahme durch das Polymer beobachtet werden. Lösliches SIINFEKL alleine bewirkte schon bei geringeren Konzentrationen eine T-Zell-Proliferation.rnEs war somit möglich, drei biologischen Komponenten an einen polymeren Träger zu konju-gieren und diese Konjugate im Hinblick auf Zusammensetzung, Größe, Internalisierung in dendritische Zellen und Aktivierung der T-Zell-Proliferation zu untersuchen. Außerdem wur-de die Konjugationschemie erfolgreich von dem Modellsystem des linearen PLL auf die PLL-Bürste übertragen. Die Polymer-Konjugate werde unspezifisch in DC aufgenommen und in-duzieren T-Zellproliferation, die mit Antigen-Präsentationsassays nachgewiesen wird. Es konnte jedoch durch Konjugation des Antikörpers keine Rezeptor-vermittelte Aufnahme in CD8+ DC erzielt werden.rnDiese Studien stellen einen erfolgsversprechenden ersten Schritt zur Entwicklung neuer Na-nomaterialien für die Anwendung in Krebs-Immuntherapie dar.

Charge generation and recombination in hybrid organic,inorganic solar cells

This thesis deals with the investigation of exciton and charge dynamics in hybrid solar cells by time-resolved optical spectroscopy. Quasi-steady-state and transient absorption spectroscopy, as well as time-resolved photoluminescence spectroscopy, were employed to study charge generation and recombination in solid-state organic dye-sensitized solar cells, where the commonly used liquid electrolyte is replaced by an organic solid hole transporter, namely 2,2′7,7′-tetrakis-(N,N-di-p-methoxyphenyl-amine)-9,9′-spirobifluorene (spiro-MeOTAD), and polymer-metal oxide bulk heterojunction solar cells, where the commonly used fullerene acceptor [6,6]-phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) is replaced by zinc oxide (ZnO) nanoparticles. By correlating the spectroscopic results with the photovoltaic performance, efficiency-limiting processes and processes leading to photocurrent generation in the investigated systems are revealed. rnIt is shown that the charge generation from several all-organic donor-π-bridge-acceptor dyes, specifically perylene monoimide derivatives, employed in solid-state dye-sensitized solar cells, is strongly dependent on the presence of a commonly used additive lithium bis(trifluoromethanesulphonyl)imide salt (Li-TFSI) at the interface. rnMoreover, it is shown that charges can not only be generated by electron injection from the excited dye into the TiO2 acceptor and subsequent regeneration of the dye cation by the hole transporter, but also by an alternative mechanism, called preceding hole transfer (or reductive quenching). Here, the excited dye is first reduced by the hole transporter and the thereby formed anion subsequently injects an electron into the titania. This additional charge generation process, which is only possible for solid hole transporters, helps to overcome injection problems. rnHowever, a severe disadvantage of solid-state dye-sensitized solar cells is re-vealed by monitoring the transient Stark effect on dye molecules at the inter-face induced by the electric field between electrons and holes. The attraction between the negative image charge present in TiO2, which is induced by the positive charge carrier in the hole transporter due to the dielectric contrast between the organic spiro-MeOTAD and inorganic titania, is sufficient to at-tract the hole back to the interface, thereby increasing recombination and suppressing the extraction of free charges.rnBy investigating the effect of different dye structures and physical properties on charge generation and recombination, design rules and guidelines for the further advancement of solid-state dye-sensitized solar cells are proposed.rnFinally, a spectroscopic study on polymer:ZnO bulk heterojunction hybrid solar cells, employing different surfactants attached to the metal oxide nanoparticles, was performed to understand the effect of surfactants upon photovoltaic behavior. By applying a parallel pool analysis on the transient absorption data, it is shown that suppressing fast recombination while simultaneously maintaining the exciton splitting efficiency by the right choice of surfactants leads to better photovoltaic performances. Suppressing the fast recombination completely, whilst maintaining the exciton splitting, could lead to a doubling of the power conversion efficiency of this type of solar cell.

Der Einfluss des Angiotensin-II-Typ-2-Agonisten Compound 21 auf den neuronalen Schaden bei der Maus nach traumatischer Hirnläsion mittels Controlled Cortical Impact

Die Beeinflussung des sekundären Hirnschadens nach SHT ist Hauptansatzpunkt der klinischen Therapie. Gleichzeitig sind die zugrunde liegenden Mechanismen zum Großteil unklar und Gegenstand aktueller Forschung. In verschiedenen Studien scheint sich das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System als Teil der Pathophysiologie bei der Entstehung des sekundären Hirnschadens und der neuronalen Inflammation nach SHT herauszukristallisieren. Der Fokus richtet sich mitunter auf den AT2- Rezeptor, dessen protektive Wirkung in verschiedensten Ischämiemodellen und Geweben gezeigt werden konnte.rnIn der vorliegenden Promotionsarbeit wurde erstmalig die Wirkung einer AT2- Stimulation auf histologische, inflammatorische und neuromotorische Parameter nach CCI untersucht. Eine neuroprotektive Wirkung der AT2-Stimulation konnte dabei nicht nachgewiesen werden. Es kam weder zu einer Beeinflussung histologischer noch neuromotorischer Parameter, allerdings scheint der AT2-Agonist C21 bei einer Dosierung von 0,03 mg/kg KG zu einer Stimulation der inflammatorischen Reaktion zu führen.

Charakterisierung der Latenz des murinen Cytomegalovirus in vivo

Die primäre, produktive Cytomegalovirus (CMV)-Infektion wird im immunkompetenten Patienten effizient durch antivirale CD8+ T-Zellen kontrolliert. Das virale Genom besitzt jedoch die Fähigkeit, in einem nicht replikativen, Latenz genannten Zustand, in gewissen Zelltypen zu persistieren, ohne dass infektiöse Nachkommenviren produziert werden. Die molekularen Mechanismen, welche der Etablierung und Aufrechterhaltung der Latenz zugrundeliegen, sind noch weitestgehend unbekannt. Es gibt Hinweise darauf, dass zelluläre Verteidigungsmechanismen die Zirkularisierung und Chromatinisierung viraler Genome hervorrufen und dadurch die virale Genexpression größtenteils verhindert wird (Marks & Spector, 1984; Reeves et al., 2006).rnAllerdings liegen die Genome nicht in einem komplett inaktiven Zustand vor. Vielmehr konnte für das murine CMV (mCMV) bereits die sporadische Transkription der Gene ie1 und ie2 während der Latenz nachgewiesen werden (Kurz et al., 1999; Grzimek et al., 2001).rnIn der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal eine umfassende in vivo Latenz-Analyse zur Charakterisierung der viralen Transkription in einer Kinetik anhand der alle drei kinetischen Klassen repräsentierenden Transkripte IE1, IE3, E1, m164, M105 und M86 vorgenommen.rnNach Latenz-Etablierung, verifiziert durch Abwesenheit von infektiösem Virus, konnten alle getesteten Transkripte in der Lunge quantifiziert werden. Interessanterweise war die transkriptionelle Aktivität zu keinem Analyse-Zeitpunkt mit der klassischen IE-E-L-Kinetik der produktiven Infektion kompatibel. Stattdessen lag eine stochastische Transkript-Expression vor, deren Aktivität mit voranschreitender Zeit immer weiter abnahm.rnWährend der Latenz exprimierte Transkripte, die für antigene Peptide kodieren, können infizierte Zellen für das Immunsystem sichtbar machen, was zu einer fortwährenden Restimulation des memory T-Zell-pools führen würde. Durch zeitgleiche Analyse der Transkript-Expression, sowie der Frequenzen Epitop-spezifischer CD8+ T-Zellen während der Latenz (IE1, m164, M105), wurde eine möglicher Zusammenhang zwischen der transkriptionellen Aktivität und der Expansion des memory T-Zell-pools untersucht. Die weitere Charakterisierung von Subpopulationen der Epitop-spezifischen CD8+ T-Zellen identifizierte die SLECs (short-lived-effector cells; CD127low CD62Llow KLRG1high) als die dominante Population in Lunge und Milz während der mCMV-Latenz.rnIn einem weiteren Teil der Arbeit sollte untersucht werden, ob IE-Genexpression zur Etablierung von Latenz notwendig ist. Mit Hilfe der Rekombinanten mCMV-Δie2-DTR, die die Gensequenz des Diphtherietoxin-Rezeptors (DTR) anstelle des Gens ie2 trägt, konnten infizierte, DTR exprimierende Zellen durch eine DT-Applikation konditional depletiert werden.rnIm latent infizierbaren Zelltyp der Leber, den LSECs (liver sinusoidal endothelial cells) wurde die virale Load durch 90-stündige DT–Applikation nach mCMV-Δie2-DTR Infektion auf das Level latent infizierter LSECs reduziert. Diese Daten sprechen für die Hypothese eines von Beginn an inaktiven Genoms, das keine IE-Genexpression zur Latenz-Etablierung benötigt. Zusätzlich stellt dieser Ansatz ein neues Tier-Modell zur Latenz-Etablierung dar. Verringerte Wartezeiten bis zur vollständigen Latenz-Etablierung, im Vergleich zum bisherigen Knochenmarktransplantations-Modell, könnten anfallende Tierhaltungskosten erheblich reduzieren und das Voranschreiten der Forschung beschleunigen.

CD137-selektierte leukämiereaktive T-Zellen gesunder Spender zur adoptiven Immuntherapie stammzelltransplantierter Leukämiepatienten = CD137-selected leukaemia-reactive T Cells from healthy donors for adoptive immunotherapy in stem-cell-transplanted leukaemia-patients

Bei stammzelltransplantierten Patienten, die ein Rezidiv ihrer Leukämie erleiden, kann eine Donor-Lymphozyten-Infusion (DLI) dauerhafte vollständige Leukämieremissionen induzieren. T-Zellen in der DLI vermitteln sowohl den potentiell kurativen Graft-versus-Leukaemia (GVL) Effekt, als auch die potentiell lebensbedrohliche Graft-versus-Host Disease (GVHD). Hingegen könnte die Infusion von leukämiereaktiven T-Zellen einen selektiven GVL Effekt und einen Langzeitschutz vor Rezidiven durch eine spezifisch gegen die Leukämie gerichtete Immunantwort und Immunität vermitteln. Unsere Arbeitsgruppe hat Protokolle zur in vitro Generierung leukämiereaktiver T-Zellen entwickelt, die hohe zytotoxische Aktivität gegen akute myeloische Leukämie-Blasten (AML) bei minimaler Reaktion auf mögliche GVHD Zielstrukturen zeigen. Für die klinische Anwendung sind diese Protokolle jedoch zu aufwändig, wobei vor allem eine erhebliche Verkürzung der Kulturzeit auf wenige Wochen erforderlich ist. Diese Verkürzung der in vitro Kulturzeit könnte das Wachstum von T-Zellen vom central memory oder frühen effector memory Phänotyp fördern, für die eine bessere in vivo Effektorfunktion und längere Persistenz im Rezipienten verglichen mit T-Zellen aus Langzeitkultur gezeigt werden konnte. Der Aktivierungsmarker und Kostimulations-Rezeptor CD137 kann zur Erkennung und Isolation antigenspezifischer T-Zellen genutzt werden, ohne dass dafür das von den T-Zellen erkannte Peptidepitop bekannt sein muss. Eine CD137-vermittelte Anreicherung mit Hilfe von clinical grade Materialien könnte verwendet werden, um DLI-Produkte mit leukämiespezifischen T-Zellen herzustellen, die sich sowohl durch eine effizientere T-Zell Generierung durch in vitro Selektion und Kostimulation, als auch durch eine verbesserte Spezifität des T-Zell-Produkts auszeichnen. Lymphozyten-Leukämie Cokulturen (mixed lymphocyte leukaemia cultures) wurden mit CD8 T-Zellen gesunder Spender und HLA-identischen oder einzel-HLA-mismatch AML-Blasten angesetzt und wöchentlich restimuliert. Nach zwei Wochen wurden die T-Zellen 12 Stunden nach Restimulation über den Marker CD137 positiv isoliert und anschließend separat weiterkultiviert. Die isolierten Fraktionen und unseparierten Kontrollen wurden im ELISPOT-Assay und im Chrom-Freisetzungstest an Tag 5 nach der Restimulation getestet. Es wurden keine konsistent nachweisbaren Vorteile im Hinblick auf Wachstum und Funktion der isolierten CD137-positiv Fraktion im Vergleich zur unseparierten Kontrolle gefunden. Verschiedene Isolationsmethoden, Patient-Spender-Systeme, Methoden zur Restimulation, Temperaturbedingungen, Zytokinkombinationen und Methoden der Zytokinzugabe sowie zusätzliche Feeder-Zellen oder AML-Blasten konnten Wachstum, funktionelle Daten und die deutlichen Zellverluste während der Isolation nicht entscheidend beeinflussen. Vitalfärbungen zeigten, dass aktivierungsinduzierter Zelltod CD137-positiver Zellen zu diesen Ergebnissen beitragen könnte. Im Gegensatz zur Stimulation mit AML-Blasten wurden erfolgreiche CD137-Anreicherungen für peptidstimulierte T-Zellen publiziert. Unterschiedliche CD137-Expressionskinetiken, aktivierungsinduzierter Zelltod und regulatorische T-Zellen sind mögliche Faktoren aufgrund derer die CD137-Anreicherung in diesem spezifischen Kontext ungeeinet sein könnte. Der stimulatorische Effekt eines CD137-Signals auf AML-reaktive CD8 T-Zellen wurde mit Hilfe von CD3/CD28 und CD3/CD28/CD137 Antikörper-beschichteten magnetischen beads untersucht. Für Nierenzellkarzinom-reaktive T-Zellen war die Stimulation mit CD3/CD28/CD137 beads genauso effektiv wie mit Tumorzellen und effektiver als mit CD3/CD28 beads. Beide Arten von beads waren für eine Stimulation während der ersten Wochen der Zellkultur geeignet, sodass ein zusätzliches CD137-Signal für die länger anhaltende Expansion tumorreaktiver T-Zellen zur klinischen Anwendung nützlich sein könnte. Die bead-Expansion veränderte die IFN-Sekretion im ELISPOT nicht, aber verursachte eine mäßige Verschlechterung der Zytotoxizität im Chrom-Freisetzungstest. Im Gegensatz dazu zeigten bei AML-reaktiven T-Zellen beide Arten von beads einen nicht apoptosevermittelten, dosisabhängigen zellschädigenden Effekt, der zu einer raschen Abnahme der Zellzahl in Kulturen mit beads führte. Unerwünschte Effekte auf die T-Zell-Funktionalität durch bead-Stimulation sind in der Literatur beschrieben, dennoch gibt es aktuell keine Veröffentlichungen, die eine fundierte Erklärung für den Effekt auf AML-reaktive T-Zellen bieten könnten. Abgesehen von Literaturdaten, die darauf hindeuten, dass CD137 ein vielversprechendes Kandidatenmolekül für die Anreicherung und Expansion von AML-reaktiven T-Zellen sein könnte, zeigen die eigenen Daten sowohl zur CD137-Isolation als auch zur bead-Stimulation, dass für diese spezielle Anwendung CD137 ein ungeeigneter Aktivierungsmarker und Kostimulations-Ligand ist.