Studio di macromolecole associate alla calcificazione in organismi marini

Lo studio riportato in questa tesi ha come scopo l’osservazione e la comprensione dei processi molecolari associati alla deposizione di CaCO3 nei polimorfi di calcite e aragonite nel mollusco gasteropode Haliotis rufescens. In particolare l’attenzione si è focalizzata sullo strato glicoproteico (green layer) che si trova inserito all’interno dell’ipostraco o strato madreperlaceo. Studi precedenti suggeriscono l’ipotesi che il green layer sia una struttura polifunzionale che svolge un ruolo attivo nell’induzione di crescita dei cristalli di carbonato di calcio nella conchiglia. All’analisi microscopica il green layer si presenta come un foglietto trilaminato. Sugli strati esterni è depositata aragonite nella forma prismatica da una parte e sferulitica dall’altra. All’interno è racchiuso un core proteico, formato da glicoproteine e ricco di chitina. Questa struttura tripartita conferisce al guscio calcareo nuove proprietà meccaniche, come la resistenza alle fratture molto maggiore rispetto al minerale naturale. Il green layer è stato trattato in ambiente alcalino, l’unico in grado di solubilizzarlo. È stato ottenuto del materiale proteico che è stato caratterizzato utilizzando SDS-PAGE, colorato con Blu Comassie e all’argento per visualizzarne la componente peptidica. Il green layer è fluorescente, sono state quindi eseguite analisi spettroscopiche sull’estratto peptidico per determinarne le proprietà chimo fisiche (dipendenza dal pH dell’intensità di fluorescenza). Sono stati eseguiti esperimenti di crescita dei cristalli di CaCO3 in ambiente saturo di CaCl2 in assenza e presenza del peptide e in assenza e presenza di Mg++. I cristalli sono stati osservati al microscopio elettronico a scansione (SEM) e al microscopio confocale. Da un punto di vista spettroscopico si osserva che, eccitando l’estratto alcalino del green layer a 280 nm e 295 nm, lunghezze d’onda caratteristiche degli aminoacidi aromatici, si ottiene uno spettro di emissione che presenta una forte banda centrata a 440 nm e una spalla a circa 350 nm, quest’ultima da ascrivere all’emissione tipica di aminoacidi aromatici. L’emissione di fluorescenza dell’estratto dal green layer dipende dal pH per tutte le bande di emissione; tale effetto è particolarmente visibile per lo spettro di emissione a 440 nm, la cui lunghezza d’onda di emissione e l’intensità dipendono dalla ionizzazione di aminoacidi acidi (pKa = 4) e dell’istidina (pKa = 6.5 L’emissione a 440 nm proviene invece da un’eccitazione il cui massimo di eccitazione è centrato a 350 nm, tipica di una struttura policiclica aromatica. Poiché nessun colorante estrinseco viene isolato dalla matrice del green layer a seguito dei vari trattamenti, tale emissione potrebbe derivare da una modificazione posttraduzionale di aminoacidi le cui proprietà spettrali suggeriscono la formazione di un prodotto di dimerizzazione della tirosina: la ditirosina. Questa struttura potrebbe essere la causa del cross-link che rende resistente il green layer alla degradazione da parte di agenti chimici ed enzimatici. La formazione di ditirosina come fenomeno post-traduzionale è stato recentemente acquisito come un fenomeno di origine perossidativa attraverso la formazione di un radicale Tyr ed è stato osservato anche in altri organismi caratterizzati da esoscheletro di tipo chitinoso, come gli insetti del genere Manduca sexta. Gli esperimenti di cristallizzazione in presenza di estratto di green layer ne hanno provato l’influenza sulla nucleazione dei cristalli. In presenza di CaCl2 avviene la precipitazione di CaCO3 nella fase calcitica, ma la conformazione romboedrica tipica della calcite viene modificata dalla presenza del peptide. Inoltre aumenta la densità dei cristalli che si aggregano a formare strutture sferiche di cristalli incastrati tra loro. Aumentando la concentrazione di peptide, le sfere a loro volta si uniscono tra loro a formare strutture geometriche sovrapposte. In presenza di Mg++, la deposizione di CaCO3 avviene in forma aragonitica. Anche in questo caso la morfologia e la densità dei cristalli dipendono dalla concentrazione dello ione e dalla presenza del peptide. È interessante osservare che, in tutti i casi nei quali si sono ottenute strutture cristalline in presenza dell’estratto alcalino del green layer, i cristalli sono fluorescenti, a significare che il peptide è incluso nella struttura cristallina e ne induce la modificazione strutturale come discusso in precedenza. Si osserva inoltre che le proprietà spettroscopiche del peptide in cristallo ed in soluzione sono molto diverse. In cristallo non si ha assorbimento alla più corta delle lunghezze d’onda disponibili in microscopia confocale (405 nm) bensì a 488 nm, con emissione estesa addirittura sino al rosso. Questa è un’indicazione, anche se preliminare, del fatto che la sua struttura in soluzione e in cristallo è diversa da quella in soluzione. In soluzione, per un peptide il cui peso molecolare è stimato tra 3500D (cut-off della membrana da dialisi) e 6500 D, la struttura è, presumibilmente, totalmente random-coil. In cristallo, attraverso l’interazione con gli ioni Ca++, Mg++ e CO3 -- la sua conformazione può cambiare portando, per esempio, ad una sovrapposizione delle strutture aromatiche, in modo da formare sistemi coniugati non covalenti (ring stacking) in grado di assorbire ed emettere luce ad energia più bassa (red shift).

Analisi chimica e mineralogica di sedimenti di fondo marino del Mar Tirreno sud-orientale

A partire dal 2010 la Commissione Europea ha compilato una lista di 20 materie prime ritenute “critiche” per importanza economica e rischio di approvvigionamento, per le quali è fondamentale la ricerca di possibili fonti alternative nel territorio europeo, poiché i maggiori produttori sono tutti paesi extra-europei. Dati questi presupposti, 20 campioni di fango marino, dragati nelle adiacenze di seamounts del Tirreno sud-orientale, sono stati analizzati per mezzo di XRF, al fine di trovare arricchimenti in elementi critici quali cromo, cobalto, gallio, niobio e alcuni elementi delle Terre Rare (lantanio, cerio, neodimio, samario, ittrio). I fanghi, talvolta con frazione sabbiosa più abbondante, sono stati dapprima divisi in base al colore in fanghi marroni e grigi e fanghi di colore bianco, rosso o arancio; presentano anche inclusi di diverso tipo, quali frammenti di conchiglie, noduli neri o bruno-arancio, croste bruno-nere o bruno-arancio. Dalle analisi chimiche è risultato che campioni più ricchi in CaO hanno un contenuto minore negli elementi ricercati, al contrario dei campioni ricchi in ossidi di Si, Ti, Al, Fe. Confrontando inoltre i campioni con i valori medi di composizione della crosta terrestre superiore, essi risultano più ricchi in REY e meno in Co, Cr, Ga, Nb, mentre sono sempre più arricchiti della composizione media dei sedimenti marini. Dalle analisi mineralogiche risulta che i fanghi contengono generalmente quarzo, calcite, feldspati in piccole quantità e fillosilicati. Infine, analisi XRD e SEM-EDS sui noduli neri hanno dimostrato che si tratta di todorokite, un ossido idrato di Mn, con tenori variabili di Na, K, Ca, Mg, dalla forma globosa con microstruttura interna fibroso-raggiata. Si ritiene quindi che fanghi ricchi in CaCO3, probabilmente bioderivato, non siano l’obiettivo più adatto per la ricerca di elementi critici, mentre potrebbero esserlo fanghi più ricchi in Si, Al, Fe, K, che hanno maggiori concentrazioni di tali elementi.

Dynamics of inorganic carbon and carbonate saturation in the Gulf of Cádiz (SW Spain)

The study of inorganic carbon chemistry of the coastal ocean is conducted in the Gulf of Cádiz (GoC). Here we describe observations obtained during 4 sampling cruises in March, June, September and November 2015. The primary data set consists of state-of-the-art measurements of the keystone parameters of the marine CO2 system: Total Alkalinity (TA), pH, dissolved inorganic carbon (DIC). We have then calculated aragonite and calcite saturation state. The distribution of inorganic carbon system parameters in the north eastern shelf of the Gulf of Cádiz showed temporal and spatial variability. River input, mixing, primary production, respiration and remineralization were factors that controlled such distributions. Data related to carbonate saturation of calcite and aragonite reveal the occurrence of a supersaturated water; in any case, both species increased with distance and decreased with depth. The carbon system parameters present a different behaviour close to the coast to offshore ad at deeper water. In this area six water masses are clearly identified by their different chemical properties: Surface Atlantic Water, North Atlantic Central Water (NACW) and Mediterranean Water (MOW). Moreover, with this work the measurement of calcium in seawater is optimize, allowing a better quantification for future work of the saturation state of CaCO3.

Effetti delle emissioni naturali gassose sugli pteropodi: uno studio pilota nel Golfo di Napoli

L’aumento della pressione parziale di anidride carbonica in atmosfera e il conseguente aumento dell’idrolisi di CO2 nell’acqua marina, noto come “acidificazione degli oceani", consiste nella diminuzione del pH e nella riduzione dello stato di saturazione delle acque (Ω) rispetto al carbonato di calcio (CaCO3). Il Golfo di Napoli è caratterizzato da elevati livelli di CO2 dovuti alla presenza di emissioni naturali di gas (vents), è perciò considerato un laboratorio naturale per prevedere gli effetti futuri sugli organismi marini dovuti all’aumento della acidificazione degli oceani. Questo lavoro di tesi valuta, per la prima volta, l’effetto dei vents sugli pteropodi Thecosomata (gasteropodi planctonici). Data la loro necessità di ioni carbonato per produrre la conchiglia, questi sono considerati “organismi sentinella” per i cambiamenti del sistema dei carbonati nell’ambiente marino. Gli pteropodi sono stati campionati e successivamente analizzati in termini di abbondanza specifica, dimensione e stato di degradazione della conchiglia. I principali risultati hanno mostrato che dalle stazioni di controllo alle zone con presenza di emissioni gassose, vi è un gradiente di diminuzione dei livelli di pH e Ωar, nonostante in nessuna stazione siano presenti livelli di sottosaturazione carbonatica. Gli pteropodi diminuiscono in termini di abbondanza e biodiversità presentando una conchiglia con livelli di dissoluzione elevata nelle stazioni adiacenti alle emissioni gassose, mentre lo stato di preservazione della conchiglia aumenta all’aumentare della distanza dalle zone di emissione, suggerendo che la variazione dello stato di saturazione nelle diverse stazioni, influenzi i processi di calcificazione dell’organismo. Gli effetti negativi delle emissione gassose sugli pteropodi potrebbero a lungo termine risultare in uno shift di popolazioni a vantaggio di organismi planctonici non calcificanti.