Adenosine A1 receptor-mediated inhibition of in vitro prolactin secretion from the rat anterior pituitary

In previous studies, we demonstrated biphasic purinergic effects on prolactin (PRL) secretion stimulated by an adenosine A₂ agonist. In the present study, we investigated the role of the activation of adenosine A₁ receptors by (R)-N6-(2-phenylisopropyl)adenosine (R-PIA) at the pituitary level in in vitro PRL secretion. Hemipituitaries (one per cuvette in five replicates) from adult male rats were incubated. Administration of R-PIA (0.001, 0.01, 0.1, 1, and 10 µM) induced a reduction of PRL secretion into the medium in a U-shaped dose-response curve. The maximal reduction was obtained with 0.1 µM R-PIA (mean ± SEM, 36.01 ± 5.53 ng/mg tissue weight (t.w.)) treatment compared to control (264.56 ± 15.46 ng/mg t.w.). R-PIA inhibition (0.01 µM = 141.97 ± 15.79 vs control = 244.77 ± 13.79 ng/mg t.w.) of PRL release was blocked by 1 µM cyclopentyltheophylline, a specific A₁ receptor antagonist (1 µM = 212.360 ± 26.560 ng/mg t.w.), whereas cyclopentyltheophylline alone (0.01, 0.1, 1 µM) had no effect. R-PIA (0.001, 0.01, 0.1, 1 µM) produced inhibition of PRL secretion stimulated by both phospholipase C (0.5 IU/mL; 977.44 ± 76.17 ng/mg t.w.) and dibutyryl cAMP (1 mM; 415.93 ± 37.66 ng/mg t.w.) with nadir established at the dose of 0.1 µM (225.55 ± 71.42 and 201.9 ± 19.08 ng/mg t.w., respectively). Similarly, R-PIA (0.01 µM) decreased (242.00 ± 24.00 ng/mg t.w.) the PRL secretion stimulated by cholera toxin (0.5 mg/mL; 1050.00 ± 70.00 ng/mg t.w.). In contrast, R-PIA had no effect (468.00 ± 34.00 ng/mg t.w.) on PRL secretion stimulation by pertussis toxin (0.5 mg/mL; 430.00 ± 26.00 ng/mg t.w.). These results suggest that inhibition of PRL secretion after A₁ receptor activation by R-PIA is mediated by a Gi protein-dependent mechanism.

Utilização do DELI-teste para avaliação da sensibilidade in vitro do Plasmodium vivax à Cloroquina em condições de campo no município de Tucuruí, Pará

O Estado do Pará é um dos responsáveis pela maioria das notificações de malária na Região Amazônica. Plasmodium vivax é a espécie mais freqüente e a avaliação da sensibilidade do mesmo à cloroquina é essencial para verificar se tal droga mantém sua eficácia. Entretanto, isso não era factível em função da não disponibilidade de metodologia de cultivo de curto prazo e da dificuldade de avaliação da maturação desse parasito. Recentemente, um sistema para cultivo de curto prazo de P. vivax foi introduzido, assim como uma metodologia de mensuração (DELIteste) da maturação/crescimento do parasito baseada na detecção da enzima Lactato Desidrogenase do parasito (pLDH), permitindo estudos de sensibilidade dessa especie plasmodial aos antimaláricos. O objetivo desse trabalho foi então avaliar o desempenho dessa metodologia para avaliar a quimiossensibilidade de P. vivax a cloroquina em condições de campo no município de Tucuruí, no Estado do Para. Foram utilizados 44 pacientes positivos para malária vivax, diagnosticados pelo exame de gota espessa, dos quais, após consentimento, foram coletados 5mL de sangue. Uma suspensão de hemácias de cada paciente, preparada em meio de cultura especial (meios RPMI e Waymouth, soro AB+, hematocrito de 1,8%), foi colocada em cultivo in vitro de curto prazo (48 horas), a 37°C e microaerofilia, frente a uma gama de concentrações (2,34-600ng/mL) de cloroquina. As placas foram então congeladas e, posteriormente, os parasitos foram lisados por congelamento e descongelamento, liberando a pLDH. A mensuração da pLDH foi feita por ELISA-sanduiche (DELI-teste), utilizando como anticorpos de captura os monoclonais 6C9 (anti-pLDH de Plasmodium) e 11D (anti-LDH de P. vivax) e como anticorpo de detecção o monoclonal 19G (anti-pLDH de Plasmodium). Os valores de densidade ótica obtidos permitiram, na maioria dos casos, traçar curvas de sensibilidade a droga e o conseqüente calculo da concentração inibitória de 50% (IC50). Do total de amostras, 53,8% apresentaram melhores curvas com o monoclonal 11D e 46,1% com o monoclonal 6C9. Das 44 amostras, 26 (59,2%) permitiram traçar curvas interpretáveis de sensibilidade a cloroquina. O rendimento de 59% pode ser considerado satisfatório em função da conhecida dificuldade de se cultivar P. vivax in vitro, e das precárias condições de infra-estrutura para realização das culturas. Doze (46,2%) dessas 26 amostras apresentaram IC50 superior ao limiar de 100nM, sendo consideradas resistentes. Esse elevado percentual de amostras com perda e sensibilidade a cloroquina é preocupante e indica que esse tipo de avaliação deve ser continuada e estendida a outras localidades para se ter uma caracterização mais clara dessa situação. O DELIteste é o único capaz de avaliar a resistência in vitro do P. vivax e sua utilização em condições de campo pode contribuir para direcionar estratégias terapêuticas para malária em nosso País.

Expressão gênica e viabilidade de folículos pré-antrais inclusos em fragmentos de córtex ovarianos cultivados in vitro de macaco-prego (Sapajus apella)

O objetivo desse trabalho foi analisar a ativação e o crescimento de folículos préantrais de Sapajus apella, submetidos a um sistema de cultivo in vitro em curto-prazo. Nesse sentido, dois experimentos foram realizados neste trabalho. Experimento I: exposição à fresco e à crioprotetores de biopsias de fragmentos do córtex ovariano. Ambos os fragmentos ovarianos foram submetidos à extração total de RNA e síntese de cDNA. Após a amplificação do cDNA por PCR em tempo-real (RT-PCR), os software GeNorm, bestkeeper e Normfinder foram usados para avaliar a estabilidade dos genes GAPDH (glyceraldehyde-2-phosphate dehydrogenase), HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1) e TBP (TATA-binding protein). Experimento II: o tecido do córtex ovariano de quatro fêmeas foi oletado e dividido em nove pedaços de 1 mm³. Um fragmento ovariano (grupo controle) foi imediatamente dividido em dois pedaços, os quais foram destinados para análise da viabilidade ou por RT-PCR. Os 8 fragmentos restantes foram individualmente cultivados in vitro em um meio constituído de TCM suplementado com 100 ng/mL EGF (T1), com adição de 10 μM de BME (T2), 100 ng/mL de BMP4 (T3), 25 IU de PMSG (T4), 10 μM de BME e 100 ng/mL de BMP4 (T5), 10 μM de BME, 25 IU de PMSG (T6), 100 ng/mL de BMP4, 25 IU de PMSG (T7) ou 10 μM de BME, 100 ng/mL de BMP4, 25 IU de PMSG (T8). Os resultados demonstraram que no tecido do córtex ovariano de S. apella, os genes HPRT1 e TBP foram os mais apropriados como genes de referência, podendo ser usados como parâmetro para normalizar dados em estudos futuros. Ao contrário, o GAPDH se apresentou como menos estável dos genes de referencia testados. Após o cultivo in vitro, todos os tratamentos alcançaram percentuais similares da viabilidade de folículos pré-antrais. O tecido ovariano cultivado na presença de GF+BME/BMP4/PMSG resultou no aumento da taxa de ativação e crescimento folicular, assim como no aumento da expressão de AMH, BMP15 e GDF9, genes conhecidos como indicadores específicos de desenvolvimento folicular. Dessa forma, o HPRT1 e TBP são os genes de referência mais estáveis, na exposição à crioprotetores, a fresco e no o cultivo de tecidos de córtex ovariano de S. apella. Os folículos pré-antrais são capazes de desenvolverem-se in vitro quando cultivados em meio suplementado com PMSG, BME e BMP4. A viabilidade folicular, entretanto, permaneceu independentemente do meio de cultivo in vitro e o uso de fatores de crescimento, como marcadores de desenvolvimento folicular, foi crucial para identificar o melhor meio de cultivo in vitro.

Avaliação da atividade antiplasmódica in vitro dos óleos de Andiroba (Carapa guianensis Aubl.) e Pimenta-de-macaco (Piper aduncum L)

Na busca de novos antimaláricos, duas espécies típicas da região Amazônica e uma fração rica em limonóides foram objeto deste estudo: Carapa guianensis Aubl. (Meliaceae), conhecida popularmente como andiroba, utilizada tradicionalmente como inseticida e no combate da malária. A espécie Piper aduncum L. (Piperaceae), conhecida popularmente como pimenta-de-macaco, usada para tratar doenças inflamatórias e a fração rica em limonóides fracionada do óleo de andiroba. Tanto os óleos brutos como a fração foram submetidos a ensaios in vitro, segundo metodologia descrita por Rieckman e colaboradores (1980) modificada por Carvalho (1990) com os clones do Plasmodium falciparum W₂ e Dd₂. Estes ensaios demonstraram que os óleos apresentaram atividade antiplasmódica, sendo que na concentração de 0,82ng/mL e 8,2μg/mL do óleo de andiroba a inibição do clone W₂ foi de 100% e do Dd₂ de 71% após 72h de exposição, respectivamente. Para a fração na concentração de 3,1μg/mL o clone W₂ foi de 100% e do Dd₂ a de 82% após 72h de exposição. O óleo de pimenta-de-macaco teve na concentração de 1,30ng/mL para o clone W₂ a inibição de 100% e para o Dd₂ a de 77%, após 72h de exposição, para a concentração de 10,3μg/mL. Os resultados com o óleo de pimenta-de-macaco, na concentração de 1,30ng/mL a inibição foi de 100% para clone W₂ e para o clone Dd₂, na concentração de 10,3μg/mL, a inibição foi de 77% após 72h de exposição.

Abordagem fitoquímica, determinação da atividade antiplasmódica in vitro e avaliação preliminar da toxicidade do extrato hidroetanólico das cascas de Aspidosperma excelsum Benth (Apocynaceae)

A malária é uma doença causada por protozoários do gênero Plasmodium. O tratamento da malária está se tornando cada vez mais difícil com a expansão dos casos de parasitas resistentes aos fármacos utilizados na terapêutica. Neste contexto, produtos isolados a partir de plantas têm dado importante contribuição, representando importante fonte para a obtenção de novos fármacos antimaláricos. A atividade antiplasmódica de alcalóides de origem vegetal tem sido amplamente relatada na literatura. Plantas da família Apocynaceae, ricas em alcalóides indólicos, apresentam amplas propriedades medicinais e algumas espécies do gênero Aspidosperma já demonstraram potencial antimalárico. Assim, este trabalho teve como objetivo realizar uma abordagem fitoquímica, avaliar a atividade antiplasmódica in vitro e a toxicidade preliminar do extrato hidroetanólico concentrado das cascas de A. excelsum, nativa da Região Amazônica, onde é usada tradicionalmente para tratar várias enfermidades, inclusive malária. A atividade antiplasmódica in vitro de diferentes concentrações do extrato e frações alcaloídica e metanólica foi avaliada em culturas de P. falciparum W2 pela percentagem de inibição da parasitemia e determinação da concentração inibitória média (CI₅₀) em intervalos de 24, 48 e 72 h. O ensaio de citotoxicidade do extrato e fração alcaloídica foi realizado em fibroblastos L929 de camundongo pelo método do MTT e o teste de toxicidade aguda oral do extrato foi realizado de acordo com o Procedimento de Dose Fixa adotado pela OECD com pequenas adaptações. A prospecção fitoquímica revelou a presença de saponinas, açúcares redutores, fenóis e taninos e alcalóides e estes foram confirmados em quantidades significativas na fração alcaloídica extraída com clorofórmio (C2). Através de cromatografia em camada delgada e cromatografia líquida de alta eficiência do extrato, foi caracterizada a presença do alcalóide indólico ioimbina. O extrato e as frações apresentaram atividade antiplasmódica in vitro. O extrato apresentou a melhor atividade em 24 h (CI₅₀= 5,2 ± 4,1 μg/mL), indicando uma boa atividade esquizonticida. Apenas a fração alcaloídica C2 apresentou uma pequena, porém significativa citotoxicidade (concentrações superiores a800 μg/mL). O extrato não só não apresentou citotoxicidade como também nenhum sinal evidente de toxicidade aguda oral na dose de 5000 mg/mL. Os resultados obtidos indicam que o extrato de Aspidosperma excelsum Benth apresenta promissor potencial antimalárico, merecendo estudos mais detalhados sobre sua atividade antiplasmódica, com vistas no isolamento de compostos ativos e elucidação de seu(s) mecanismo(s) de ação.

Leishmania (L.) amazonensis inibe a maturação e a função ativadora das células de Langerhans da pele tratadas com TNF-α e anti-CD40 in vitro

Leishmania amazonensis é um dos principais agentes etiológicos em um amplo espectro de formas clínicas da Leishmaniose Tegumentar Americana. De modo geral, a resistência frente às leishmanioses decorre do desenvolvimento de uma resposta imune celular eficiente, porém muitos estudos têm demonstrado que citocinas específicas ou combinações de citocinas podem ser fatores de resistência ou suscetibilidade à infecção por L. amazonensis. Estudos recentes sugerem a participação das células de Langerhans (LCs) nas resposta anti-Leishmania, porém os mecanismos envolvidos durante esta interação são ainda pouco estudados. Objetivos: Estudar o papel do TNF-α e anti-CD40 nas interações in vitro entre as LCs e L. amazonensis, observando o perfil de citocinas produzidas e a expressão de moléculas de superfície, bem como verificar a capacidade destas células em ativar a produção de IFN-γ e IL-4 por células do linfonodo. Metodologia: As LCs foram isoladas da epiderme de camundongos BALB/c e incubadas com promastigotas de L. amazonensis, TNF-α e/ou anti- CD40. Após 24h, as LCs foram co-cultivadas com células obtidas de linfonodos por 72h. As citocinas IL-6, IL-12, IFN-γ e IL-4 foram dosadas por ensaio imunoenzimático (ELISA) e as moléculas de superfície foram analisadas por citometria de fluxo. Resultados: Os níveis de IL- 6 e IL-12p70 produzidos pela LCs foram significativamente reduzidos após interação com L. amazonensis, mesmo após o tratamento das LCs com TNF-α ou anti-CD40. Em relação às moléculas de superfície, não houve diferença na expressão de CD207 em nenhum dos grupos, porém a presença de L. amazonensis promoveu uma redução significativa na expressão de CD40 nas LCs tratadas com TNF-α ou anti-CD40, e aumentou a expressão de CD86 em todos os grupos. Na presença de L. amazonensis, as células do linfonodo apresentaram uma produção diminuída de IFN-γ e não houve alteração na produção de IL-4. Quando cocultivadas com LCs estimuladas previamente com L. amazonensis, a produção de IFN-γ também foi reduzida, mesmo na presença dos estímulos TNF-α e/ou anti-CD40. Não foram observadas alterações significativas na produção de IL-4 pelas células do linfonodo cocultivadas nas mesmas condições experimentais. Conclusão: L. (L.) amazonensis exerce um efeito imunomodulador sobre a resposta imune mediada por LCs, inibindo a produção de IL-6 e IL-12p70 e expressão de CD40, além de impedir a ativação da produção de IFN-γ por células do linfonodo co-cultivadas com LCs, mesmo após tratamento com TNF-α e anticorpo anti-CD40.

Toxicidade in vitro e in vivo do ortobenzamol, análogo do paracetamol

O paracetamol (PAR) é um dos medicamentos de venda livre mais utilizado em todo o mundo. Entretanto, doses elevadas do PAR produzem toxicidade hepática e/ou renal. No intuito de minimizar a toxicidade do PAR e obter melhor atividade analgésica e anti-inflamatória, um estudo prévio realizou modificações na estrutura química do PAR por modelagem molecular, dando origem ao ortobenzamol (OBZ) – análogo do PAR. Assim, o OBZ foi sintetizado e avaliado em modelos de nocicepção e inflamação em animais. O estudo demonstrou atividade analgésica central do OBZ, com potência superior ao PAR. Além disso, nos testes de inflamação, essa droga apresentou inibição significativa no processo inflamatório. Entretanto, para que o OBZ possa ser considerado uma alternativa terapêutica nova e importante para o tratamento da dor e/ou da inflamação é necessário determinar sua toxicidade. Assim, este estudo objetivou avaliar a toxicidade in vitro e in vivo do OBZ e, compará-la com a do PAR. Para isso, a neurotoxicidade foi avaliada in vitro em culturas primárias de neurônios corticais, através de ensaios de viabilidade celular, determinação dos níveis de glutationa total e reduzida, assim como a possível capacidade neuroprotetora frente ao estresse oxidativo. Foram realizados estudos in vivo em camundongos, iniciados pela determinação da dose efetiva mediana (DE₅₀) do PAR, a fim de compará-la com a do OBZ nos modelos de toxicidade estudados. Determinou-se o estresse oxidativo hepático e cerebral pela análise dos níveis de peroxidação lipídica e nitritos. A possível disfunção hepática e renal foi determinada, por meio da análise dos níveis plasmáticos das enzimas aspartato aminotransferase (AST), de alanina aminotransferase (ALT), gama glutamiltransferase (GGT) e, da creatinina no sangue. Avaliaram-se alterações nos parâmetros clínicos através do hemograma, leucograma e plaquetograma e, realizou-se a determinação da toxicidade aguda. Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que o ortobenzamol é mais seguro que o paracetamol. Registrou-se ao ortobenzamol ausência de neurotoxicidade, menor potencial hepatotóxico e hematotóxico, ausência de nefrotoxicidade e, ainda, foi classificado como um xenobiótico de baixa toxicidade após a avaliação da toxicidade aguda. Portanto, o ortobenzamol pode ser considerado como uma futura alternativa terapêutica segura ao paracetamol, no tratamento da dor e inflamação.