Utilização do DELI-teste para avaliação da sensibilidade in vitro do Plasmodium vivax à Cloroquina em condições de campo no município de Tucuruí, Pará

O Estado do Pará é um dos responsáveis pela maioria das notificações de malária na Região Amazônica. Plasmodium vivax é a espécie mais freqüente e a avaliação da sensibilidade do mesmo à cloroquina é essencial para verificar se tal droga mantém sua eficácia. Entretanto, isso não era factível em função da não disponibilidade de metodologia de cultivo de curto prazo e da dificuldade de avaliação da maturação desse parasito. Recentemente, um sistema para cultivo de curto prazo de P. vivax foi introduzido, assim como uma metodologia de mensuração (DELIteste) da maturação/crescimento do parasito baseada na detecção da enzima Lactato Desidrogenase do parasito (pLDH), permitindo estudos de sensibilidade dessa especie plasmodial aos antimaláricos. O objetivo desse trabalho foi então avaliar o desempenho dessa metodologia para avaliar a quimiossensibilidade de P. vivax a cloroquina em condições de campo no município de Tucuruí, no Estado do Para. Foram utilizados 44 pacientes positivos para malária vivax, diagnosticados pelo exame de gota espessa, dos quais, após consentimento, foram coletados 5mL de sangue. Uma suspensão de hemácias de cada paciente, preparada em meio de cultura especial (meios RPMI e Waymouth, soro AB+, hematocrito de 1,8%), foi colocada em cultivo in vitro de curto prazo (48 horas), a 37°C e microaerofilia, frente a uma gama de concentrações (2,34-600ng/mL) de cloroquina. As placas foram então congeladas e, posteriormente, os parasitos foram lisados por congelamento e descongelamento, liberando a pLDH. A mensuração da pLDH foi feita por ELISA-sanduiche (DELI-teste), utilizando como anticorpos de captura os monoclonais 6C9 (anti-pLDH de Plasmodium) e 11D (anti-LDH de P. vivax) e como anticorpo de detecção o monoclonal 19G (anti-pLDH de Plasmodium). Os valores de densidade ótica obtidos permitiram, na maioria dos casos, traçar curvas de sensibilidade a droga e o conseqüente calculo da concentração inibitória de 50% (IC50). Do total de amostras, 53,8% apresentaram melhores curvas com o monoclonal 11D e 46,1% com o monoclonal 6C9. Das 44 amostras, 26 (59,2%) permitiram traçar curvas interpretáveis de sensibilidade a cloroquina. O rendimento de 59% pode ser considerado satisfatório em função da conhecida dificuldade de se cultivar P. vivax in vitro, e das precárias condições de infra-estrutura para realização das culturas. Doze (46,2%) dessas 26 amostras apresentaram IC50 superior ao limiar de 100nM, sendo consideradas resistentes. Esse elevado percentual de amostras com perda e sensibilidade a cloroquina é preocupante e indica que esse tipo de avaliação deve ser continuada e estendida a outras localidades para se ter uma caracterização mais clara dessa situação. O DELIteste é o único capaz de avaliar a resistência in vitro do P. vivax e sua utilização em condições de campo pode contribuir para direcionar estratégias terapêuticas para malária em nosso País.

ABSTRACT: The State of Para is responsible for a large amount of malaria notifications in the Brazilian Amazon region. Plasmodium vivax is the most prevalent specie and the evaluation of its in vitro sensitivity to chloroquine is essential to verify if this drug keeps its efficacy. However, this kind of evaluation was not feasible due to unavailability of methodologies for short-term in vitro culture and for evaluation of growth/maturation of this parasite. Recently, a method for shortterm in vitro culture of P. vivax was introduced, as well as a reliable methodology (DELI-test) for measurement of this parasite’s growth/maturation, based on the detection of the parasite enzyme Lactate Dehydrogenase (pLDH), allowing studies of sensitivity of this plasmodial specie to antimalarials. The aim of this study was then to evaluate the chemosensitivity of P. vivax to chloroquine under field conditions in the municipality of Tucurui, State of Para, Brazil. A total of 45 patients with vivax malaria were enrolled in the study, after microscopic diagnosis by thick smear, and 5mL of blood were withdrawn from each patient. An erythrocyte suspension was prepared for each patient’s blood, using a special culture medium (mixing of RPMI and Waymouth media, AB+ serum, 1.8% hematocrit), and put in short-term (48 hours) culture at 37°C and low tension of oxygen, under a range of concentrations (2,34-600ng/mL) of chloroquine. Plates were then frozen and, later, parasites were lysed by freezing-thawing, releasing the pLDH, which was measured by a sandwich-ELISA (DELI-test), using for capture the monoclonal antibody (MAb) 6C9 (anti-Plasmodium pLDH) e 11D (anti-P. vivax pLDH) and for detection the MAb19G (anti-Plasmodium pLDH). The optical density values allowed in most cases the drawing of curves of sensitivity to the drug and calculation of the 50% inhibitory concentration (IC50). Nearly half (53.8%) of the samples showed better curves with the MAb 11D. Out of the 44 samples, 26 (59.2%) allowed the drawing of interpretable curves of sensitivity for chloroquine. The parasite growth performance of 59% of the samples can be considered satisfactory, taking into account the known difficulty in culturing P. vivax in vitro, and the poor laboratory conditions for carrying out the cultures. Thirteen (46.2%) of the 26 interpretable samples showed an IC50 above the threshold of 100nM of chloroquine, being considered resistants. This high frequency of samples with low sensitivity to chloroquine is of concern and indicates that this kind of evaluation should be continued and extended to other localities in order to have a more clear picture of the situation. The DELI-test is currently the only able to evaluate in vitro resistance of P. vivax and its use in fild conditions can contribute for helping definitions in the malaria therapeutic strategies in Brazil.