Stratégie de détection des anomalies chromosomiques dans les leucémies aiguës pédiatriques

L’analyse des anomalies génomiques récurrentes est importante pour établir le diagnostic, le pronostic et pour orienter la thérapie des leucémies aiguës pédiatriques. L’objectif de notre étude est d’élaborer une stratégie optimale pour détecter les anomalies chromosomiques dans les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) et myéloïdes (LAM) des enfants. Pour ce faire, nous avons caractérisé au caryotype, avec des panels d’hybridation in situ en fluorescence (FISH), par RT-PCR et par l’index d’ADN 253 leucémies de novo reçues au CHU Sainte-Justine entre 2005 et 2011 (186 LAL-B, 27 LAL-T et 40 LAM). Nous avons réussi à optimiser la détection des anomalies chromosomiques dans les trois types de leucémies, avec des fréquences de 93,5% dans les LAL-B (174/186), 66,7% dans les LAL-T (18/27) et 90% dans les LAM (36/40). Nos résultats suggèrent d’utiliser plusieurs tests génétiques concomitants afin d’optimiser la détection des anomalies génomiques dans les LAL et les LAM de novo pédiatriques.

Etude du rôle de la réponse UV sur le contrôle de la réparation par excision de nucléotides (NER) des dommages à l’ADN : rôle des voies MAPK et de l’ADN polymérase eta

La réponse cellulaire aux ultra-violets (UV), ou réponse UV, est une réponse complexe et spécialisée dans l’adaptation et la tolérance des dommages aux UV. Celle-ci est initiée par un grand nombre d’évènements moléculaires et de signalisation nucléaire mais aussi au niveau de la membrane plasmique ou du cytoplasme. L’importance et l’influence exactes de ces évènements sur la réparation par excision de nucléotides (NER) des dommages UV à l’ADN sont encore mal comprises et doivent encore être méthodiquement démontrées. Dans cette thèse, grâce à l’utilisation d’une méthode sensible d’analyse de la réparation NER basée sur la cytométrie en flux, il est montré, dans un premier temps, que l’activité des voies MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases), qui sont des voies de signalisation de stress UV d’origine cytoplsamique, ne participent pas à l’efficacité de réparation NER des dommages UV dans les cellules humaines. En effet, l’abrogation de la signalisation MAPK, par inhibition pharmacologique, par utilisation de mutants dominant-négatifs ou par inhibition de leur expression endogène, ne révèlent aucun changement de la cinétique de réparation des dommages UV par excision de nucléotides. Cependant, l’utilisation de cette même méthode de réparation, mais cette fois, appliquée pour l’étude de réparation NER en fonction du cycle cellulaire, a permis de mettre en évidence la nécessité fonctionnelle de l’ADN polymérase translésionnelle eta (Pol η) dans la réparation NER des dommages UV, uniquement en phase S. Cette observation fut initialement caractérisée dans les cellules de patients affectés du syndrome variant de xérodermie pigmentaire (XP-V) puis, confirmée ensuite par l’inhibition de l’expression de Pol η endogène ou par la complémentation avec des mutants non-fonctionnels dans les cellules XP-V. Ces résultats indiquent que, contrairement à la réponse UV MAPK cytoplasmique, les évènements nucléaires comme la synthèse translésionnelle, peuvent influencer l’efficacité de réparation NER en phase S. Plus particulièrement, ces données établissent un lien possible entre la réparation NER en phase S et les niveaux de stress réplicatifs, révélé ici par la déficience fonctionnelle Pol η ou ATR. Les observations, présentées dans cette thèse, renforcent un rôle du point de contrôle S aux UV sur l’efficacité de la réparation NER et suggèrent que l’inhibition NER, observée en phase S dans les cellules XP-V, est modulée par le stress réplicatif. Un tel moyen de contrôle pourrait avoir une action plutôt protectrice pendant cette phase critique du cycle cellulaire. Mots clés: UV, translésionnelle, eta, MAPK, NER, CPD, cytométrie, phase-S, tolérance.

Investigation of the structure and dynamics of the centromeric epigenetic mark

Le centromère est le site chromosomal où le kinetochore se forme, afin d’assurer une ségrégation fidèles des chromosomes et ainsi maintenir la ploïdie appropriée lors de la mitose. L’identité du centromere est héritée par un mécanisme épigénétique impliquant une variante de l’histone H3 nommée centromere protein-A (CENP-A), qui remplace l’histone H3 au niveau de la chromatine du centromère. Des erreurs de propagation de la chromatine du centromère peuvent mener à des problèmes de ségrégation des chromosomes, pouvant entraîner l’aneuploïdie, un phénomène fréquemment observé dans le cancer. De plus, une expression non-régulée de CENP-A a aussi été rapportée dans différentes tumeurs humaines. Ainsi, plusieurs études ont cherchées à élucider la structure et le rôle de la chromatine contenant CENP-A dans des cellules en prolifération. Toutefois, la nature moléculaire de CENP-A en tant que marqueur épigénétique ainsi que ces dynamiques à l'extérieur du cycle cellulaire demeurent des sujets débat. Dans cette thèse, une nouvelle méthode de comptage de molécules uniques à l'aide de la microscopie à réflexion totale interne de la fluorescence (TIRF) sera décrite, puis exploitée afin d'élucider la composition moléculaire des nucléosomes contenant CENP-A, extraits de cellules en prolifération. Nous démontrons que les nucléosomes contenant CENP-A marquent les centromères humains de façon épigénétique à travers le cycle cellulaire. De plus, nos données démontrent que la forme prénucléosomale de CENP-A, en association avec la protéine chaperon HJURP existe sous forme de monomère et de dimère, ce qui reflète une étape intermédiaire de l'assemblage de nucléosomes contenant CENP-A. Ensuite, des analyses quantitatives de centromères lors de différenciation myogénique, et dans différents tissus adultes révèlent des changements globaux qui maintiennent la marque épigénétique dans une forme inactive suite à la différentiation terminale. Ces changements incluent une réduction du nombre de points focaux de CENP-A, un réarrangement des points dans le noyau, ainsi qu'une réduction importante de la quantité de CENP-A. De plus, nous démontrons que lorsqu'une dédifférenciation cellulaire est induite puis le cycle cellulaire ré-entamé, le phénotype "différencié" décrit ci-haut est récupéré, et les centromères reprennent leur phénotype "prolifératif". En somme, cet oeuvre décrit la composition structurale sous-jacente à l'identité épigénétique des centromères de cellules humaines lors du cycle cellulaire, et met en lumière le rôle de CENP-A à l'extérieur du cycle cellulaire.

Interpretation of the centromere epigenetic mark to maintain genome stability

Le centromère est la région chromosomique où le kinétochore s'assemble en mitose. Contrairement à certaines caractéristiques géniques, la séquence centromérique n'est ni conservée entre les espèces ni suffisante à la fonction centromérique. Il est donc bien accepté dans la littérature que le centromère est régulé épigénétiquement par une variante de l'histone H3, CENP-A. KNL-2, aussi connu sous le nom de M18BP1, ainsi que ces partenaires Mis18α et Mis18β sont des protéines essentielles pour l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères. Des évidences expérimentales démontrent que KNL-2, ayant un domaine de liaison à l'ADN nommé Myb, est la protéine la plus en amont pour l'incorporation de CENP-A aux centromères en phase G1. Par contre, sa fonction dans le processus d'incorporation de CENP-A aux centromères n'est pas bien comprise et ces partenaires de liaison ne sont pas tous connus. De nouveaux partenaires de liaison de KNL-2 ont été identifiés par des expériences d'immunoprécipitation suivies d'une analyse en spectrométrie de masse. Un rôle dans l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères a été attribué à MgcRacGAP, une des 60 protéines identifiées par l'essai. MgcRacGAP ainsi que les protéines ECT-2 (GEF) et la petite GTPase Cdc42 ont été démontrées comme étant requises pour la stabilité de CENP-A incorporé aux centromères. Ces différentes observations ont mené à l'identification d'une troisième étape au niveau moléculaire pour l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé en phase G1, celle de la stabilité de CENP-A nouvellement incorporé aux centromères. Cette étape est importante pour le maintien de l'identité centromérique à chaque division cellulaire. Pour caractériser la fonction de KNL-2 lors de l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères, une technique de microscopie à haute résolution couplée à une quantification d'image a été utilisée. Les résultats générés démontrent que le recrutement de KNL-2 au centromère est rapide, environ 5 minutes après la sortie de la mitose. De plus, la structure du domaine Myb de KNL-2 provenant du nématode C. elegans a été résolue par RMN et celle-ci démontre un motif hélice-tour-hélice, une structure connue pour les domaines de liaison à l'ADN de la famille Myb. De plus, les domaines humain (HsMyb) et C. elegans (CeMyb) Myb lient l'ADN in vitro, mais aucune séquence n'est reconnue spécifiquement par ces domaines. Cependant, il a été possible de démontrer que ces deux domaines lient préférentiellement la chromatine CENP-A-YFP comparativement à la chromatine H2B-GFP par un essai modifié de SIMPull sous le microscope TIRF. Donc, le domaine Myb de KNL-2 est suffisant pour reconnaître de façon spécifique la chromatine centromérique. Finalement, l'élément reconnu par les domaines Myb in vitro a potentiellement été identifié. En effet, il a été démontré que les domaines HsMyb et CeMyb lient l'ADN simple brin in vitro. De plus, les domaines HsMyb et CeMyb ne colocalisent pas avec CENP-A lorsqu'exprimés dans les cellules HeLa, mais plutôt avec les corps nucléaires PML, des structures nucléaires composées d'ARN. Donc, en liant potentiellement les transcrits centromériques, les domaines Myb de KNL-2 pourraient spécifier l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé uniquement aux régions centromériques.

Caractérisation fonctionnelle du suppresseur de tumeurs BAP1

La déubiquitinase BAP1 (« BRCA1-Associated Protein1 ») a initialement été isolée pour sa capacité de promouvoir la fonction suppressive de tumeurs de BRCA1. BAP1 est muté de manière homozygote dans plusieurs cancers (tel que le cancer du rein, de la peau, de l’oeil et du sein) suggérant fortement que cette déubiquitinase est un suppresseur de tumeurs. Effectivement, la surexpression de BAP1 réduit la prolifération cellulaire et la croissance tumorale dans des modèles de xénogreffe de souris. Toutefois, la fonction biologique et le mécanisme d’action de cette déubiquitinase restent encore marginalement connus. Ainsi, les objectifs de cette thèse sont de caractériser la fonction biologique de BAP1 et de révéler les bases moléculaires de sa fonction suppressive de tumeurs. Pour déterminer la fonction biologique de BAP1, nous avons immuno-purifié et identifié les protéines associées à BAP1, qui s’avèrent être principalement des facteurs et co-facteurs de transcription. Ensuite, nous avons démontré que BAP1 est un régulateur de la transcription. Parallèlement, un autre groupe a montré que BAP1 chez la drosophile, Calypso, régule l’ubiquitination de H2A et la transcription génique. D’autre part, nos résultats d’analyse d’expression génique globale suggèrent que BAP1 jouerait un rôle important dans la réponse aux dommages à l’ADN. Effectivement, des expériences de gain et de perte de fonction (méthode de l’ARNi, modèle de cellules KO en BAP1 et de cellules déficientes en BAP1 re-exprimant BAP1) ont révélé que cette déubiquitinase régule la réponse aux bris double brin d’ADN par la recombinaison homologue. Nos résultats suggèrent que BAP1 exerce sa fonction suppressive de tumeurs en contrôlant la réparation sans erreur de l’ADN via la recombinaison homologue. En cas d’inactivation de BAP1, les cellules deviendront plus dépendantes du mécanisme de réparation par jonction d'extrémités non-homologues, qui est potentiellement mutagénique causant ainsi l’instabilité génomique. D’autres études seront nécessaires afin de déterminer le rôle exact de BAP1 dans la transcription et de comprendre comment la dérégulation de l’ubiquitination de H2A contribue au développement du cancer. Définir les mécanismes de suppression tumorale est de grand intérêt, non seulement pour comprendre la carcinogénèse mais également pour le développement de nouvelles thérapies contre cette maladie.

Identification de déterminants impliqués dans la différenciation des cellules souches embryonnaires

Les cellules souches ont attiré l’attention du public ces dernières années, grâce non-seulement à leur utilisation comme thérapies visant à s’attaquer à certains types de cancers, mais aussi en relation avec leur potentiel dans le domaine de la médecine regénérative. Il est établi que le destin cellulaire des cellules souches embryonnaires (ESC) est régulé de façon intensive par un groupe de facteur clés agissant sur leur pluripotence. Il est néanmoins envisageable que certains déterminants influençant l’auto-renouvellement et la différenciation de ces cellules soient toujours inconnus. Afin de tester cette hypothèse, nous avons généré, en utilisant une méthode par infections virales, une collection de ESC contenant des délétions chromosomales chevauchantes que nous avons baptisée DelES (Deletion in ES cells). Cette librairie contient plus de 1000 clones indépendants dont les régions délétées couvrent environ 25% du génome murin. À l’aide de cette ressource, nous avons conduit un criblage de formation de corps embryoïdes (EB), démontrant que plusieurs clones délétés avaient un phénotype de différenciation anormal. Nos études de complémentation sur un groupe de clones ont par la suite permis l’identification de Rps14 - un gène codant pour une protéine ribosomale (RP) comme étant haploinsuffisant pour la formation de EB. Dans un deuxième temps, l’analyse approfondie des résultats de notre crible a permis d’identifier un groupe de gènes codants pour des RP qui semblent essentiels pour la différenciation des ESC, mais dispensables pour leur auto-renouvellement. De manière intéressante, les phénotypes anormaux de formation en EB les plus marqués sont associés à des délétions de RP qui se retrouvent au site de sortie des ARN messagers (ARNm) du ribosome, soit Rps5, Rps14 et Rps28. Étonnament, alors qu’un débalancement des RP conduit généralement à une réponse de type p53, l’haploinsuffisance de ces trois gènes ne peut être renversée par une simple réduction des niveaux d’expression de ce gène suppresseur de tumeurs. Finalement, nos études de profilage polysomal et de séquençage à haut-débit montrent une signature spécifique de gènes liés au mésoderme chez un clone hétérozygote pour Rps5, suggérant ainsi une explication au phénotype de différenciation p53-indépendant identifié chez ces ESC. Nos travaux rapportent donc la création d’une ressource intéressante de génomique fonctionnelle qui a permis de mettre à jour le rôle essentiel que jouent les RP dans le processus de formation de EB. Nos résultats permettent aussi de documenter une réponse p53-indépendante suite à un débalancement de RP dans un contexte opposant l’auto-renouvellement et la différenciation des ESC.

Environnement local des défauts structurels et ordre à moyenne portée dans le silicium amorphe

Malgré une vaste littérature concernant les propriétés structurelles, électroniques et ther- modynamiques du silicium amorphe (a-Si), la structure microscopique de ce semi-cond- ucteur covalent échappe jusqu’à ce jour à une description exacte. Plusieurs questions demeurent en suspens, concernant par exemple la façon dont le désordre est distribué à travers la matrice amorphe : uniformément ou au sein de petites régions hautement déformées ? D’autre part, comment ce matériau relaxe-t-il : par des changements homo- gènes augmentant l’ordre à moyenne portée, par l’annihilation de défauts ponctuels ou par une combinaison de ces phénomènes ? Le premier article présenté dans ce mémoire propose une caractérisation des défauts de coordination, en terme de leur arrangement spatial et de leurs énergies de formation. De plus, les corrélations spatiales entre les défauts structurels sont examinées en se ba- sant sur un paramètre qui quantifie la probabilité que deux sites défectueux partagent un lien. Les géométries typiques associées aux atomes sous et sur-coordonnés sont extraites du modèle et décrites en utilisant les distributions partielles d’angles tétraédriques. L’in- fluence de la relaxation induite par le recuit sur les défauts structurels est également analysée. Le second article porte un regard sur la relation entre l’ordre à moyenne portée et la relaxation thermique. De récentes mesures expérimentales montrent que le silicium amorphe préparé par bombardement ionique, lorsque soumis à un recuit, subit des chan- gements structuraux qui laissent une signature dans la fonction de distribution radiale, et cela jusqu’à des distances correspondant à la troisième couche de voisins.[1, 2] Il n’est pas clair si ces changements sont une répercussion d’une augmentation de l’ordre à courte portée, ou s’ils sont réellement la manifestation d’un ordonnement parmi les angles dièdres, et cette section s’appuie sur des simulations numériques d’implantation ionique et de recuit, afin de répondre à cette question. D’autre part, les corrélations entre les angles tétraédriques et dièdres sont analysées à partir du modèle de a-Si.

Impacts des réarrangements génomiques chloroplastiques sur l'apparition des phénotypes de variégation chez Arabidopsis thaliana

Contrairement à la plupart des eucaryotes non-photosynthétiques, les végétaux doivent assurer la stabilité d’un génome additionnel contenu dans le plastide, un organite d’origine endosymbiotique. Malgré la taille modeste de ce génome et le faible nombre de gènes qu’il encode, celui-ci est absolument essentiel au processus de photosynthèse. Pourtant, même si ce génome est d’une importance cruciale pour le développement de la plante, les principales menaces à son intégrité, ainsi que les conséquences d’une déstabilisation généralisée de sa séquence d’ADN, demeurent largement inconnues. Dans l’objectif d’élucider les conséquences de l’instabilité génomique chloroplastique, nous avons utilisé le mutant why1why3polIb d’Arabidopsis thaliana, qui présente d’importants niveaux de réarrangements génomiques chloroplastiques, ainsi que la ciprofloxacine, un composé induisant des brisures double-brins dans l’ADN des organites. Ceci nous a permis d’établir qu’une quantité importante de réarrangements génomiques provoque une déstabilisation de la chaîne de transport des électrons photosynthétique et un grave stress oxydatif associé au processus de photosynthèse. Étonnamment, chez why1why3polIb, ces hautes concentrations d’espèces oxygénées réactives ne mènent ni à la perte de fonction des chloroplastes affectés, ni à la mort cellulaire des tissus. Bien au contraire, ce déséquilibre rédox semble être à l’origine d’une reprogrammation génique nucléaire permettant de faire face à ce stress photosynthétique et conférant une tolérance aux stress oxydatifs subséquents. Grâce à une nouvelle méthode d’analyse des données de séquençage de nouvelle génération, nous montrons également qu’un type particulier d’instabilité génomique, demeuré peu caractérisé jusqu’à maintenant, constitue une des principales menaces au maintien de l’intégrité génomique des organites, et ce, tant chez Arabidopsis que chez l’humain. Ce type d’instabilité génomique est dénommé réarrangement de type U-turn et est vraisemblablement associé au processus de réplication. Par une approche génétique, nous démontrons que les protéines chloroplastiques WHY1, WHY3 et RECA1 empêchent la formation de ce type d’instabilité génomique, probablement en favorisant la stabilisation et le redémarrage des fourches de réplication bloquées. Une forte accumulation de réarrangements de type U-turn semble d’ailleurs être à l’origine d’un sévère trouble développemental chez le mutant why1why3reca1. Ceci soulève de nombreuses questions quant à l’implication de ce type d’instabilité génomique dans de nombreux troubles et pathologies possédant une composante mitochondriale.

La génomique évolutive mitochondriale révèle des échanges génétiques et la ségrégation chez les Gloméromycètes

Les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) sont des organismes microscopiques du sol qui jouent un rôle crucial dans les écosystèmes naturels et que l’on retrouve dans tous les habitats de la planète. Ils vivent en relation symbiotique avec la vaste majorité des plantes terrestres. Ils sont des biotrophes obligatoires, c'est-à-dire qu'ils ne peuvent croître qu'en présence d'une plante hôte. Cette symbiose permet entre autres à la plante d'acquérir des nutriments supplémentaires, en particulier du phosphore et du nitrate. Malgré le fait que cette symbiose apporte des services importants aux écosystèmes, la richesse des espèces, la structure des communautés, ainsi que la diversité fonctionnelle des CMA sont mal connues et l'approfondissement des connaissances dans ces domaines dépend d’outils de diagnostic moléculaire. Cependant, la présence de polymorphisme nucléaire intra-isolat combiné à un manque de données génomiques dans différents groupes phylogénétique de ces champignons complique le développement de marqueurs moléculaires et la détermination de l'affiliation évolutive à hauts niveaux de résolution (c.a.d. entre espèces génétiquement similaires et/ou isolats de la même espèce). . Pour ces raisons, il semble une bonne alternative d’utiliser un système génétique différent en ciblant le génome mitochondrial, qui a été démontré homogène au sein d'un même isolat de CMA. Cependant, étant donné le mode de vie particulier de ces organismes, une meilleure compréhension des processus évolutifs mitochondriaux est nécessaire afin de valoriser l'utilisation de tels marqueurs dans des études de diversité et en génétique des populations. En ce sens, mon projet de doctorat consistait à investiguerétudier: i) les vecteurs de divergences inter-isolats et -espèces génétiquement rapprochéesphylogénétiquement apparentées, ii) la plasticité des génomes mitochondriaux, iii) l'héritabilité mitochondriale et les mécanismes potentiels de ségrégation, ainsi que iv) la diversité mitochondriale intra-isolat in situ. À l'aide de la génomique mitochondriale comparative, en utilisant le séquençage nouvelle génération, on a démontré la présence de variation génétique substantielle inter-isolats et -espèces, engendrées par l'invasion d'éléments mobiles dans les génomes mitochondriaux des CMA, donnant lieu à une évolution moléculaire rapide des régions intergéniques. Cette variation permettait de développer des marqueurs spécifiques à des isolats de la même espèce. Ensuite, à l'aide d'une approche analytique par réseaux de gènes sur des éléments mobiles, on a été en mesure de démontrer des évènements de recombinaisons homologues entre des haplotypes mitochondriaux distincts, menant à des réarrangements génomiques. Cela a permis d'ouvrir les perspectives sur la dynamique mitochondriale et l'hétéroplasmie dans un même isolatsuggère une coexistence de différents haplotypes mitochondriaux dans les populations naturelles et que les cultures monosporales pourraient induirent une sous-estimation de la diversité allélique mitochondriale. Cette apparente contradiction avec l'homogénéité mitochondriale intra-isolat généralement observée, a amené à investiguer étudier les échanges génétiques à l'aide de croisements d'isolats génétiquement distincts. Malgré l'observation de quelques spores filles hétéroplasmiques, l'homoplasmie était le statut par défaut dans toutes les cultures monosporales, avec un biais en faveur de l'un des haplotypes parentaux. Ces résultats suggèrent que la ségrégation opère durant la formation de la spore et/ou le développement de la coloniedu mycélium. De plus, ils supportent la présence d'une machinerie protéique de ségrégation mitochondriale chez les CMAAMF, où l'ensemble des gènes impliqués dans ce mécanisme ont été retrouvé et sont orthologues aux autres champignons. Finalement, on est revenue aux sources avecon a étudié le polymorphisme mitochondrial intra-isolat à l'aide d'une approche conventionnelle de PCR en utilisant une Taq polymérase de haute fidélité, suivie de clonage et de séquençage Sanger, sur deux isolats de R. irregularis. Cela a permis l'observation d'hétéroplasmie in situ, ainsi que la co-expression de variantes de variantes de protéines'ARNm dans une souche in vitro. Les résultats suggèrent que d'autres études basées sur le séquençage nouvelle génération aurait potentiellement ignorée cette variation, offrant ainsi plusieurs nouveaux arguments permettant de considérer les CMA comme des organismes possédant une population de génomes mitochondriaux et nucléaires distincts.

Modularisation épistatique des loci à trait quantitatif associés à la pression artérielle et identification de gènes candidats pour l’hypertension

Problématique: L’hypertension artérielle essentielle, facteur de risque majeur dans le développement des maladies cardiovasculaires, est un trait multigénique complexe dont les connaissances sur le déterminisme génétique nécessitent d’être approfondies. De nombreux loci à trait quantitatif (QTLs); soit des gènes responsables de faire varier la pression artérielle (PA), ont été identifiés chez l’humain et le modèle animal. Cependant, le mystère plane encore sur la façon dont ces gènes fonctionnent ensemble pour réguler la PA. Hypothèse et objectif: Plutôt qu’une addition de QTLs ayant chacun une action infinitésimale sur la PA, une interaction épistatique entre les gènes serait responsable du phénotype hypertendu. Ainsi, l’étude de cette épistasie entre les gènes impliqués, directement ou indirectement, dans l’homéostasie de la PA nous permettrait d’explorer de nouvelles voies de régulation moléculaire en cause dans cette maladie. Méthodes: Via la réalisation de souches congéniques de rats, où un segment chromosomique provenant d’une souche receveuse hypertendue (Dahl Salt Sensitive, SS/Jr) est remplacé par son homologue provenant d’une souche donneuse normotendue (Lewis, LEW), des QTLs peuvent être mis en évidence. Dans ce contexte, la combinaison de QTLs via la création de doubles ou multiples congéniques constitue la première démonstration fonctionnelle des interactions intergéniques. Résultats: Vingt-sept combinaisons au total nous ont menés à l’appréciation d’une modularisation des QTLs. Ces derniers ont été catégorisés selon deux principaux modules épistatiques (EMs) où les QTLs appartenant à un même EM sont épistatiques entre eux et participent à une même voie régulatrice. Les EMs/cascades agissent alors en parallèle pour réguler la PA. Grâce à l’existence de QTLs ayant des effets opposés sur la PA, nous avons pu établir l’ordre hiérarchique entre trois paires de QTLs. Cependant, lorsque cette suite régulatrice ne peut être déterminée, d’autres approches sont nécessaires. Nos travaux nous ont mené à l’identification d’un QTL situé sur le chromosome 16 du rat (C16QTL), appartenant au EM1 et qui révélerait une nouvelle voie de l’homéostasie de la PA. Le gène retinoblastoma-associated protein 140 (Rap140)/family with sequence similarity 208 member A (Fam208a), présentant une mutation non synonyme entre SS/Jr et LEW est le gène candidat le plus plausible pour représenter C16QTL. Celui-ci code pour un facteur de transcription et semblerait influencer l’expression de Solute carrier family 7 (cationic amino acid transporter, y+ system) member 12 (Slc7a12), spécifiquement et significativement sous exprimé dans les reins de la souche congénique portant C16QTL par rapport à la souche SS/Jr. Rap140/Fam208a agirait comme un inhibiteur de la transcription de Slc7a12 menant à une diminution de la pression chez Lewis. Conclusions: L’architecture complexe de la régulation de la PA se dévoile mettant en scène de nouveaux acteurs, pour la plupart inconnus pour leur implication dans la PA. L’étude de la nouvelle voie de signalisation Rap140/Fam208a - Slc7a12 nous permettra d’approfondir nos connaissances quant à l’homéostasie de la pression artérielle et de l’hypertension chez SS/Jr. À long terme, de nouveaux traitements anti-hypertenseurs, ciblant plus d’une voie de régulation à la fois, pourraient voir le jour.

Establishing a Robust In Vitro Embryonic Stem Cell Differentiation Assay to Monitor the Hematopoietic Potential of DELES Clones

Afin d’effectuer des études fonctionnelles sur le génome de la souris, notre laboratoire a généré une bibliothèque de clones de cellules souches embryonnaires (ESC) présentant des suppressions chromosomiques chevauchantes aléatoires – la bibliothèque DELES. Cette bibliothèque contient des délétions couvrant environ 25% du génome murin. Dans le laboratoire, nous comptons identifier de nouveaux déterminants du destin des cellules hématopoïétiques en utilisant cet outil. Un crible primaire utilisant la benzidine pour démontrer la présence d'hémoglobine dans des corps embryoïdes (EBS) a permis d’identifier plusieurs clones délétés présentant un phénotype hématopoïétique anormal. Comme cet essai ne vérifie que la présence d'hémoglobine, le but de mon projet est d'établir un essai in vitro de différenciation des ESC permettant de mesurer le potentiel hématopoïétique de clones DELES. Mon hypothèse est que l’essai de différenciation hématopoïétique publié par le Dr Keller peut être importé dans notre laboratoire et utilisé pour étudier l'engagement hématopoïétique des clones DELES. À l’aide d’essais de RT-QPCR et de FACS, j’ai pu contrôler la cinétique de différenciation hématopoïétique en suivant l’expression des gènes hématopoïétiques et des marqueurs de surface comme CD41, c-kit, RUNX1, GATA2, CD45, β-globine 1 et TER-119. Cet essai sera utilisé pour valider le potentiel hématopoïétique des clones DELES candidats identifiés dans le crible principal. Mon projet secondaire vise à utiliser la même stratégie rétro-virale a base de Cre-loxP utilisée pour générer la bibliothèque DELES pour générer une bibliothèque de cellules KBM-7 contenant des suppressions chromosomiques chevauchantes. Mon but ici est de tester si la lignée cellulaire leuémique humaine presque haploïde KBM-7 peut être exploitée en utilisant l'approche DELES pour créer cette bibliothèque. La bibliothèque de clones KBM-7 servira à définir les activités moléculaires de drogues anti-leucémiques potentielless que nous avons identifiées dans le laboratoire parce qu’elles inhibent la croissance cellulaire dans plusieurs échantillons de leucémie myéloïde aiguë dérivés de patients. Elle me permettra également d'identifier les voies de signalisation moléculaires qui, lorsque génétiquement perturbées, peuvent conférer une résistance à ces drogues.