Etude du rôle de la réponse UV sur le contrôle de la réparation par excision de nucléotides (NER) des dommages à l’ADN : rôle des voies MAPK et de l’ADN polymérase eta

La réponse cellulaire aux ultra-violets (UV), ou réponse UV, est une réponse complexe et spécialisée dans l’adaptation et la tolérance des dommages aux UV. Celle-ci est initiée par un grand nombre d’évènements moléculaires et de signalisation nucléaire mais aussi au niveau de la membrane plasmique ou du cytoplasme. L’importance et l’influence exactes de ces évènements sur la réparation par excision de nucléotides (NER) des dommages UV à l’ADN sont encore mal comprises et doivent encore être méthodiquement démontrées. Dans cette thèse, grâce à l’utilisation d’une méthode sensible d’analyse de la réparation NER basée sur la cytométrie en flux, il est montré, dans un premier temps, que l’activité des voies MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases), qui sont des voies de signalisation de stress UV d’origine cytoplsamique, ne participent pas à l’efficacité de réparation NER des dommages UV dans les cellules humaines. En effet, l’abrogation de la signalisation MAPK, par inhibition pharmacologique, par utilisation de mutants dominant-négatifs ou par inhibition de leur expression endogène, ne révèlent aucun changement de la cinétique de réparation des dommages UV par excision de nucléotides. Cependant, l’utilisation de cette même méthode de réparation, mais cette fois, appliquée pour l’étude de réparation NER en fonction du cycle cellulaire, a permis de mettre en évidence la nécessité fonctionnelle de l’ADN polymérase translésionnelle eta (Pol η) dans la réparation NER des dommages UV, uniquement en phase S. Cette observation fut initialement caractérisée dans les cellules de patients affectés du syndrome variant de xérodermie pigmentaire (XP-V) puis, confirmée ensuite par l’inhibition de l’expression de Pol η endogène ou par la complémentation avec des mutants non-fonctionnels dans les cellules XP-V. Ces résultats indiquent que, contrairement à la réponse UV MAPK cytoplasmique, les évènements nucléaires comme la synthèse translésionnelle, peuvent influencer l’efficacité de réparation NER en phase S. Plus particulièrement, ces données établissent un lien possible entre la réparation NER en phase S et les niveaux de stress réplicatifs, révélé ici par la déficience fonctionnelle Pol η ou ATR. Les observations, présentées dans cette thèse, renforcent un rôle du point de contrôle S aux UV sur l’efficacité de la réparation NER et suggèrent que l’inhibition NER, observée en phase S dans les cellules XP-V, est modulée par le stress réplicatif. Un tel moyen de contrôle pourrait avoir une action plutôt protectrice pendant cette phase critique du cycle cellulaire. Mots clés: UV, translésionnelle, eta, MAPK, NER, CPD, cytométrie, phase-S, tolérance.

The UV-response is a complex cellular response to UV irradiation, which allows cellular adaptation and protection against deleterious effects of UV. This specialized response involves numerous molecular and signaling events from plasma membrane and from the nucleus represented, among others, by Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) pathway activation and translesion synthesis respectively. More particularly, the exact role of these events on the removal UV-induced DNA damage by nucleotide excision repair (NER) in human cells is poorly understood and documented. By using a sensitive flow cytometry based-NER assay, presented and validated in this thesis, to quantify the removal of UV-DNA damage, it was unexpectedly found that Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) signalling, originating from the the plasma membrane, does not regulate the efficiency of UV-induced DNA damage repair in human cells. Indeed, MAPK inhibition with pharmacological inhibitors, expression of short-hairpin RNA or dominant negative mutant, all together, substantiate fully the lack of effect of this signalling pathway on UV-damage removal by NER in human primaries and tumorous cells. Surprisingly, the same NER assay, applied to quantify the removal of UV-induced DNA damages as a function of the cell cycle, has shown a requirement of functional translesion synthesis polymerase eta (Pol η) for efficient UV-DNA damage repair in human cells uniquely during S-phase, where its function is required for the bypass of UV DNA damage. This observation, originally made in fibroblasts from xeroderma pigmentosum variant syndrome (XP-V) afflicted patients, was further confirmed in normal human cells, by abrogation of endogenous Pol η expression or by complementation with Pol η in XP-V cells. All together, the data presented here, indicate that MAPK signaling play no role in NER-mediated UV-damage removal, but highlight a role for UV-DNA damage tolerance response, as translesion synthesis, in regulation of NER efficiency. More particularly, these observations establish a potential link between the S-Phase Repair (SPR) of UV-DNA damages and replicative stress, revealed by a deficiency of Pol η or ATR. This SPR defects seen under acute replicative stress conditions could impact tumorogenesis or chemotherapy outcomes. Moreover, SPR defects, seen in XP-V cells could be controlled by replicative stress, and also reflect a protective coordination to reduce high risks of genetic or chromosomal aberrations that may occur during DNA replication upon UV exposure. Key Words: Translesion, UV, TLS, eta, MAPK, NER, S-phase, flow-cytometry, CPD.