32 resultados para DNA damage response
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Introduction: Au Canada, le cancer de la prostate est le cancer le plus frquemment diagnostiqu chez les hommes et le plus mortel aprs les cancers du poumon et du clon. Il y a place optimiser le traitement du cancer de la prostate de manire mettre en uvre une mdecine personnalise qui sadapte aux caractristiques de la maladie de chaque patient de faon individuelle. Dans ce mmoire, nous avons valu la rponse aux dommages de lADN (RDA) comme biomarqueur potentiel du cancer de la prostate. Les lsions potentiellement oncognes de l'ADN dclenche une cascade de signalisation favorisant la rparation de l'ADN et lactivation des points de contrle du cycle cellulaire pour prserver lintgrit du gnome. La RDA est un mcanisme central de suppression tumorale chez lhomme. La RDA joue un rle important dans larrt de la prolifration des cellules dont les gnomes sont compromis, et donc, prvient la progression du cancer en agissant comme une barrire. Cette rponse cellulaire dtermine galement comment les cellules normales et cancreuses ragissent aux agents utiliss pour endommager l'ADN lors du traitement du cancer comme la radiothrapie ou la chimiothrapie, en plus la prsence d,un certain niveau de RDA dans les cellules du cancer de la prostate peuvent galement influer sur l'issue de ces traitements. Lactivation des signaux de la RDA peut agir comme un frein au cancer dans plusieurs lsions pr-noplasiques de l'homme, y compris le cancer de la prostate. Il a t dmontr que la RDA est augmente dans les cellules de noplasie intra- pithliale (PIN) comparativement aux cellules prostatiques normales. Toutefois, le devient de la RDA entre le PIN et ladnocarcinome est encore mal document et aucune corrlation n'a t ralise avec les donnes cliniques des patients. Notre hypothse est que les niveaux dactivation de la RDA seront variables selon les diffrents grades et agressivit du cancer de la prostate. Ces niveaux pourront tre corrls et possiblement prdire les rponses cliniques aux traitements des patients et aider dfinir une stratgie plus efficace et de nouveaux biomarqueurs pour prdire les rsultats du traitement et personnaliser les traitements en consquence. Nos objectifs sont de caractriser l'activation de la RDA dans le carcinome de la prostate et corrler ses donnes avec les rsultats cliniques. Mthodes : Nous avons utilis des micro-talages de tissus (tissue microarrays- TMAs) de 300 patients ayant subi une prostatectomie radicale pour un cancer de la prostate et dtermin le niveau dexpression de protines de RDA dans le compartiment stromal et pithlial des tissus normaux et cancreux. Les niveaux dexpression de 53BP1, p-H2AX, p65 et p-CHK2 ont t quantifis par immunofluorescence (IF) et par un logiciel automatis. Ces marqueurs de RDA ont dabord t valids sur des TMAs-cellule constitus de cellules de fibroblastes normales ou irradies (pour induire une activation du RDA). Les donnes ont t quantifies l'aide de couches binaires couramment utilises pour classer les pixels d'une image pour que lanalyse se fasse de manire indpendante permettant la dtection de plusieurs rgions morphologiques tels que le noyau, l'pithlium et le stroma. Des oprations arithmtiques ont ensuite t ralises pour obtenir des valeurs correspondant l'activation de la RDA qui ont ensuite t corrles la rcidive biochimique et l'apparition de mtastases osseuses. Rsultats : De faibles niveaux d'expression de la protine p65 dans le compartiment nuclaire pithlial du tissu normal de la prostate sont associs un faible risque de rcidive biochimique. Par ailleurs, nous avons aussi observ que de faibles niveaux d'expression de la protine 53BP1 dans le compartiment nuclaire pithliale du tissu prostatique normal et cancreux ont t associs une plus faible incidence de mtastases osseuses. Conclusion: Ces rsultats confirment que p65 a une valeur pronostique chez les patients prsentant un adnocarcinome de la prostate. Ces rsultats suggrent galement que le marqueur 53BP1 peut aussi avoir une valeur pronostique chez les patients avec le cancer de la prostate. La validation d'autres marqueurs de RDA pourront galement tre corrls aux rsultats cliniques. De plus, avec un suivi des patients plus long, il se peut que ces rsultats se traduisent par une corrlation avec la survie. Les niveaux d'activit de la RDA pourront ventuellement tre utiliss en clinique dans le cadre du profil du patient comme le sont actuellement lantigne prostatique spcifique (APS) ou le Gleason afin de personnaliser le traitement.
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Le glioblastome multiforme (GBM) est la tumeur crbrale la plus commune et ltale chez ladulte. Malgr les avancs fulgurantes dans la dernire dcennie au niveau des thrapies contre le cancer, le pronostique reste inchang. Le manque de spcificit des traitements est la cause premire de la rcurrence de cette tumeur. Une meilleure comprhension au niveau des mcanismes molculaires et biologiques de cette tumeur est imprative. La dcouverte des cellules souches cancreuses (CD133+) au niveau du GBM offre une nouvelle opportunit thrapeutique contre cette tumeur. Effectivement, les cellules CD133+ seraient responsables de ltablissement, le maintien et la progression du GBM. De plus, elles sont galement la cause de la rsistance du GBM faces aux traitements de radiothrapies. Ces cellules reprsentent une cible de choix dans le but dradiquer le GBM. Loncogne BMI1 a t associ plusieurs types de tumeurs et est galement essentielle au maintien de diffrentes populations de cellules souches normales et cancreuses. Une forte expression de BMI1 est observe au niveau du GBM et plus prcisment, un enrichissement prfrentiel de cette protine est not au niveau des cellules CD133+. Lobjectif principal de cette thse est dvaluer le rle potentiel de BMI1 dans le maintien et la radiorsistance des cellules souches cancreuses (CSC), CD133+ du GBM. La fonction principale de BMI1 est la rgulation ngative du locus INK4A/ARF. Ce locus est impliqu dans lactivation de deux voies majeurs anti-tumorales : P53 et RB. Or, la perte de BMI1 induit in vitro une diminution des capacits prolifratives, une augmentation de la diffrentiation et de lapoptose, ainsi quune augmentation de la radiosensibilit des CSC du GBM indpendamment de la prsence du locus INK4A/ARF. Effectivement, deux tumeurs sur trois possdent une dltion de ce locus, ce qui suggre que BMI1 possde dautre(s) cible(s) transcriptionnelle(s). Parmi ces nouvelles cibles ont retrouve la protine P21, un rgulateur ngatif du cycle cellulaire. De plus, la perte de BMI1 inhibe ltablissement dune tumeur crbrale lors dtudes de xnogreffe chez la souris NOD/SCID. galement, une nouvelle fonction de BMI1 indpendante de son activit transcriptionnel a t dmontre. Effectivement, suite linduction dun bris double brin (BDB) de lADN, BMI1 est rapidement recrut au niveau de la lsion et influence le recrutement des protines de reconnaissance du dommage lADN. La perte de BMI1 mne un dfaut au niveau de la reconnaissance et la rparation de lADN, alors que sa surexpression induit plutt une augmentation de ces mcanismes et procure une radiorsistance. Ces rsultats dcrivent pour la premire fois limportance de BMI1 au niveau du maintien, de lauto-renouvellement et la radiorsistance des CSC du GBM. Ainsi, ces travaux dmontrent que la protine BMI1 reprsente une cible thrapeutique de choix dans le but dradiquer le GBM, une tumeur crbrale ltale.
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Quelques vidences suggrent que Bcl-xL, un membre anti-apoptotique de la famille Bcl-2, possde galement des fonctions au niveau du cycle cellulaire et de ses points-contrle. Pour tudier la rgulation et fonction de Bcl-xL au cours du cycle cellulaire, nous avons gnr et exprim dans des cellules humaines une srie de mutants de phosphorylation incluant Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser49Ala, Ser56Ala, Ser62Ala et Thr115Ala. L'analyse de cette srie de mutants rvle que les cellules exprimant Bcl-xL(Ser62Ala) sont moins stables au point-contrle G2 du cycle cellulaire compares aux cellules exprimant le type sauvage ou les autres mutants de phosphorylation incluant Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser56Ala et Thr115Ala. Les tudes de cintiques de phosphorylation et de localisation de phospho-Bcl-xL(Ser62) dans des cellules synchronises et suite l'activation du point-contrle en G2 mdi par l'toposide (VP16), nous indiquent que phospho-Bcl-xL(Ser62) migre dans les corps nuclolaires durant l'arrt en G2 dans les cellules exposes au VP16. Une srie d'expriences incluant des essais kinase in vitro, l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques et d'ARN interfrant, nous rvlent que Polo kinase 1 (PLK1) et MAPK9/JNK2 sont les protines kinase impliques dans la phosphorylation de Bcl-xL(Ser62), et pour son accumulation dans les corps nuclolaires pendant le point-contrle en G2. Nos rsultats indiquent que durant le point-contrle en G2, phospho-Bcl-xL(Ser62) se lie et se co-localise avec CDK1(CDC2), le complexe cycline-kinase qui contrle l'entre en mitose. Nos rsultats suggrent que dans les corps nuclolaires, phospho-Bcl-xL(Ser62) stabilise l'arrt en G2 en squestrant CDK1(CDC2) pour retarder l'entre en mitose. Ces rsultats soulignent galement que les dommages l'ADN influencent la composition des corps nuclolaires, structure nuclaire qui merge maintenant comme une composante importante de la rponse aux dommages l'ADN. Dans une deuxime tude, nous dcrivons que les cellules exprimant le mutant de phosphorylation Bcl-xL(Ser62Ala) sont galement plus stables au point-contrle de l'assemblage du fuseau de la chromatine (SAC) suite une exposition au taxol, compares aux cellules exprimant le type sauvage ou d'autres mutants de phosphorylation de Bcl-xL, incluant Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser56Ala. Cet effet est indpendent de la fonction anti-apoptotique de Bcl-xL. Bcl-xL(Ser62) est fortement phosphoryl par PLK1 et MAPK14/SAPKp38 la promtaphase, la mtaphase et la frontire de l'anaphase, et dphosphoryl la tlophase et la cytokinse. Phospho-Bcl-xL(Ser62) se trouve dans les centrosomes avec -tubuline, le long du fuseau mitotique avec la protine moteure dynine et dans le cytosol mitotique avec des composantes du SAC. Dans des cellules exposes au taxol, phospho-Bcl-xL(Ser62) se lie au complexe inhibiteur CDC20/MAD2/BUBR1/BUB3, alors que le mutant Bcl-xL(Ser62Ala) ne se lie pas ce complexe. Ces rsultats indiquent que durant le SAC, la phosphorylation de Bcl-xL(Ser62) acclre la rsolution du SAC et l'entre des cellules en anaphase. Des expriences bloquant l'expression de Bcl-xL rvlent galement un taux trs lev de cellules ttraplodes et binucles aprs un traitement au nocodazole, consistant avec une fonction de Bcl-xL durant la mitose et dans la stabilit gnomique. Dans la troisime tude, l'analyse fonctionnelle de cette srie de mutants de phosphorylation indique galement que les cellules exprimant Bcl-xL(Ser49Ala) sont moins stables durant le point-contrle G2 et entre en cytokinse plus lentement dans des cellules exposes aux inhibiteurs de la polymrisation/dpolymrisation des tubulines, composantes des microtubules. Ces effets de Bcl-xL(Ser49Ala) sont indpendents de sa fonction anti-apoptotique. La phosphorylation de Bcl-xL(Ser49) est dynamique au cours du cycle cellulaire. Dans des cellules synchronises, Bcl-xL(Ser49) est phosphoryl en phase S et G2, dphosphoryl la promtaphase, la mtaphase et la frontire de l'anaphase, et re-phosphoryl durant la tlophase et la cytokinse. Au cours du point-contrle G2 induit par les dommages l'ADN, un pool important de phospho-Bcl-xL(Ser49) se trouve aux centrosomes, un site important pour la rgulation de l'entre en mitose. Durant la tlophase et la cytokinse, phospho-Bcl-xL(Ser49) se trouve le long des microtubules avec la protine moteure dynine et dans le cytosol mitotique. Finalement, nos rsultats suggrent que PLK3 est responsable de la phosphorylation de Bcl-xL(Ser49), une protine kinase implique pour l'entre des cellules en mitose et pour la progression de la mitose jusqu' la division cellulaire.
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Les centrosomes sont les centres organisateurs des microtubules et jouent un rle crucial dans lorganisation du fuseau bipolaire pendant la mitose. Plus rcemment, le rle des centrosomes dans la rgulation de lentre en mitose a t mis en vidence. Les centrosomes semblent galement contribuer lactivation du point de contrle en G2/M en rponse aux lsions de lADN en servant de point de rencontre pour les rgulateurs du cycle cellulaire et les gnes de rponse aux dommages lADN. Lamplification du nombre de centrosomes est une caractristique des cellules tumorales mais de faon intressante, elle constitue aussi une rponse des cellules aux dommages lADN. Les mcanismes qui rgulent lhomostasie et la dynamique des centrosomes sont encore mal compris. Pour mieux comprendre le rle des centrosomes dans la rgulation du point de contrle en G2/M en rponse aux dommages lADN, le recrutement et/ou lactivation au niveau des centrosomes des kinases impliques dans les voies de signalisation de ce point de contrle ont t tudis par immunofluorescence indirecte sur cellules HeLaS3 ou par Western blot sur des fractions enrichies en centrosomes. Nos rsultats montrent que les kinases ATM, ATR, CHK1 et CHK2 sont actives dans les centrosomes de cellules en phase G2. En rponse lactivation du point de contrle en G2/M, les formes actives de ces kinases diminuent au niveau des centrosomes. Pour identifier de nouveaux acteurs centrosomaux potentiellement impliqus dans la rgulation de ce point de contrle, une analyse comparative des protomes de centrosomes purifis a galement t ralise par spectromtrie de masse. Pour tudier plus particulirement la fonction de CHK2 au niveau des centrosomes, nous avons dvelopper des outils molculaires qui serviront dterminer le rle de la sous population de CHK2 localise aux centrosomes 1) dans la rgulation de lentre en mitose au cours dun cycle normal 2) dans lactivation et la stabilit du point de contrle en G2/M en rponse aux lsions lADN et 3) dans lhomostasie et la dynamiques des centrosomes en rponse aux dommages lADN. Cette tude permettra de mieux comprendre la fonction des centrosomes dans la rponse cellulaire au stress gnotoxiques anti-cancereux et de rvler de nouvelles fonctions potentielles pour la kinase CHK2.
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Les virus du papillome humain (VPH) sont de petits virus ADN double brin infectant les pithliums de la peau et des muqueuses. La rplication ncessaire au maintien de leur gnome dans les cellules infectes dpend des protines virales E1 et E2. Au cours de la rplication, E1 est recrute lorigine de rplication par E2 afin dtre assemble en doubles hexamres capables de drouler lADN. E1 contient un domaine C-terminal responsable de lactivit ATPase/hlicase, un domaine central de liaison lorigine et une rgion N-terminale rgulant la rplication in vivo. Cette rgion contient des signaux de localisation et dexport nuclaire qui modulent le transport intracellulaire de E1. Chez le virus du papillome bovin (VPB), il a t propos que ce transport est rgul par la sumoylation de E1. Finalement, la rgion N-terminale de E1 contient un motif de liaison aux cyclines permettant son interaction avec la cycline E/A-Cdk2. La phosphorylation de E1 par cette dernire rgule diffremment lexport nuclaire des protines E1 du VPB et du VPH. Dans la premire partie de cette tude, nous avons dmontr que bien que la protine E1 des VPH interagit avec Ubc9, lenzyme de conjugaison de la voie de sumoylation, cette voie nest pas requise pour son accumulation au noyau. Dans la seconde partie, nous avons dtermin que laccumulation nuclaire de E1 est plutt rgule pas sa phosphorylation. En fait, nous avons dmontr que lexport nuclaire de E1 est inhib par la phosphorylation de srines conserves de la rgion N-terminale de E1 par Cdk2. Puis, nous avons tabli que lexport nuclaire de E1 nest pas ncessaire lamplification du gnome dans les kratinocytes diffrencis mais quil est requis pour le maintien du gnome dans les kratinocytes non diffrencis. En particulier, nous avons dcouvert que laccumulation nuclaire de E1 inhibe la prolifration cellulaire en induisant un arrt du cycle cellulaire en phase S et que cet effet anti-prolifratif est contrecarre par lexport de E1 au cytoplasme. Dans la troisime partie de cette tude, nous avons dmontr que larrt cellulaire induit par E1 dpend de sa liaison lADN et lATP, et quil est accompagn par lactivation de la voie de rponse aux dommages lADN dpendante de ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated). Ces deux vnements semblent toutefois distincts puisque la formation dun complexe E1-E2 rduit lactivation de la voie de rponse aux dommages par E1 sans toutefois prvenir larrt de cycle cellulaire. Finalement, nous avons dmontr que la rplication transitoire de lADN viral peut avoir lieu dans des cellules arrtes en phase S, indpendamment de lactivation de la voie de rponse aux dommages lADN et de la kinase ATM. Globalement, nos rsultats dmontrent que lexport nuclaire de E1 est rgul par sa phosphorylation et non par sa sumoylation. Ils dmontrent galement que lexport nuclaire de E1 est essentiel au maintien du gnome dans les kratinocytes, possiblement parce quil prvient linhibition de la prolifration cellulaire et lactivation de la voie de rponse aux dommages lADN en limitant laccumulation de E1 au noyau.
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Les mcanismes cellulaires anti-prolifratifs, lesquels comprennent lapoptose, aussi appele la mort cellulaire programme, larrt transitoire du cycle cellulaire et la snescence, permettent la cellule de prvenir, en rponse diffrents stress, laccumulation de mutations pouvant conduire une prolifration incontrle et, ventuellement, au dveloppement dune tumeur. La rgulation de ces diffrents mcanismes requiert lactivation de protines appeles des suppresseurs de tumeur, dont le principal est p53. p53 est un facteur de transcription dont la stabilisation et lactivation conduit une hausse de lexpression de gnes directement impliqus dans larrt de la prolifration. Au cours des dernires annes, lensemble des travaux sur p53 ont permis de mettre en vidence la complexit de sa fonction, de mme que la multitude de voies de signalisation et de protines avec lesquelles il coopre pour maintenir lintgrit du gnome. De ce fait, ltude des mcanismes dactivation de p53 est de mise pour la comprhension de sa rgulation et, ventuellement, pour la prvention et llaboration de nouvelles stratgies de traitement contre le cancer. Lobjet de cette thse est la mise en vidence dun mcanisme dactivation de p53 et de la snescence par la protine SOCS1, un suppresseur de la signalisation par les cytokines. Ce mcanisme implique une interaction directe entre les deux protines, plus prcisment entre le domaine SH2 de SOCS1 et le domaine de transactivation de p53. SOCS1 interagit galement, au niveau de son SOCS Box, avec les kinases ATM et ATR de la voie du dommage lADN de faon faciliter la phosphorylation de p53 en srine 15. Ainsi, en interagissant la fois avec p53 et ATM/ATR, SOCS1 contribue la stabilisation et lactivation de p53. En accord avec ce modle, linhibition de SOCS1 dans des fibroblastes humains normaux tend diminuer le nombre de cellules snescentes suite lexpression de loncogne ca-STAT5A et rduire laccumulation nuclaire de p53 dans ces cellules. De la mme faon, les lymphocytes T provenant de souris Socs1-/-Ifn-/- sont moins susceptibles dentrer en apoptose que les lymphocytes provenant de souris Socs1+/+Ifn+/+, suite une exposition des radiations. Dans les deux contextes, on observe une baisse de lexpression des gnes cibles de p53, ce qui dmontre que SOCS1 est implique dans lactivation de p53 in vivo. Cette thse a galement pour but de mettre en vidence limplication de SOCS1 dans lactivation dautres facteurs de transcription et, par le fait mme, de dmontrer quelle peut agir comme un rgulateur plus gnral de la transcription. Une tude approfondie de linteraction entre SOCS1 et p53 a permis de dmontrer que le domaine de transactivation II de p53 (acides amins 36-67) est suffisant pour linteraction. Plus prcisment, il semble que le tryptophane 53 (W53) et la phnylalanine 54 (F54) sont les principaux rsidus impliqus. Une analyse structurale de ce domaine de p53 a conduit lidentification dun motif conserv dans plusieurs autres facteurs de transcription pourvus dun domaine de transactivation acide, dont p63, p73 et E2F1. En accord avec ces rsultats, SOCS1 est en mesure dinteragir avec chacune des deux protines. Ainsi, la capacit de SOCS1 dinteragir et de rguler lactivit de p53 peut stendre dautres facteurs de transcription. En terminant, le mcanisme prsent dans cette thse contribue la comprhension de la rgulation de p53, le principal suppresseur de tumeur de la cellule. De plus, il met en vidence une nouvelle fonction de SOCS1, laquelle tait jusqualors essentiellement connue pour inhiber la voie de signalisation JAK/STAT. Ce nouveau rle pour SOCS1 permet dexpliquer de quelle manire une activation aberrante de la signalisation par les cytokines peut dclencher la snescence ou lapoptose. Enfin, le fait que SOCS1 puisse rguler diffrents facteurs de transcription permet de la qualifier de rgulateur gnral des facteurs de transcription composs dun domaine de transactivation acide.
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L'ADN de chaque cellule est constamment soumis des stress pouvant compromettre son intgrit. Les bris double-brins sont probablement les dommages les plus nocifs pour la cellule et peuvent tre des sources de rarrangements chromosomiques majeurs et mener au cancer sils sont mal rpars. La recombinaison homologue et la jonction dextrmits non-homologues (JENH) sont deux voies fondamentalement diffrentes utilises pour rparer ce type de dommage. Or, les mcanismes rgulant le choix entre ces deux voies pour la rparation des bris double-brins demeurent nbuleux. Le complexe Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX) est le premier acteur tre recrut ce type de bris o il contribue la rparation par recombinaison homologue ou JENH. lintersection de ces deux voies, il est donc idalement plac pour orienter le choix de rparation. Ce mmoire met en lumire deux systmes distincts de phosphorylation du complexe MRX rgulant spcifiquement le JENH. Lun dpend de la progression du cycle cellulaire et inhibe le JENH, tandis que lautre requiert la prsence de dommages lADN et est ncessaire au JENH. Ensembles, nos rsultats suggrent que le complexe MRX intgre diffrents phospho-stimuli pour rguler le choix de la voie de rparation.
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La rtine est constitue de plusieurs types de neurones incluant les cellules amacrines, ganglionnaires, bipolaires et les photorcepteurs. Les photorcepteurs, qui englobent les cnes et les btonnets, sont des neurones sensoriels hautement spcialiss qui permettent la conversion de la lumire en signaux lectriques par le mcanisme de phototransduction. Les mcanismes molculaires par lesquels les progniteurs rtiniens (RPCs) se diffrencient en diffrents neurones spcialiss comme les photorcepteurs sont encore peu connus. Le gne Polycomb Bmi1 appartient la famille des gnes Polycomb qui forment des complexes multimriques impliqus dans la rpression de lexpression gnique via le remodelage de la chromatine. Au niveau biologique, le gne Bmi1 rgule, entre autre, le contrle de la prolifration cellulaire, le mtabolisme des radicaux libres, et la rparation de lADN. Rcemment, il a t dmontr que Bmi1 joue un rle critique dans la prolifration et lauto-renouvellement dun groupe de RPCs immatures. De plus, Bmi1 est essentiel au dveloppement post-natal de la rtine. L'objectif de cette tude est d'analyser le rle de Bmi1 dans le dveloppement et la survie des photorcepteurs chez la souris. Nos rsultats rvlent un phnotype de dgnrescence des photorcepteurs de types cnes chez notre modle de souris dficiente pour Bmi1. Les btonnets sont insensibles la mutation. De plus, Bmi1 est exprim de faon prdominante dans les cnes. Nos expriences de culture de cellules rtiniennes suggrent que le phnotype est cellule-autonome. Par ailleurs, la co-dltion du gne Chk2, membre de la rponse aux dommages l'ADN, permet de ralentir la progression du phnotype. Les rtines Bmi1-/- et Bmi1-/-Chk2-/- prsentent une augmentation importante des dommages oxydatifs l'ADN. Ces rsultats suggrent que le stress oxydatif pourrait jouer un rle important dans la survie des cnes. L'tude du rle du gne Polycomb Bmi1 dans les photorcepteurs est importante pour une meilleure comprhension des mcanismes contribuant la survie des cnes et pourrait mener la dcouverte de nouveaux traitements des maladies dgnratives des cnes.
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Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l'actylation de l'histone H3 sur la lysine 56 (H3K56ac) est prsente sur les histones no-synthtises dposes derrire les fourches de rplication et est essentielle pour prserver la viabilit cellulaire en rponse au dommage l'ADN. La dsactylation d'H3K56 sur l'ensemble du gnome catalyse par Hst3 et Hst4 et a lieu en phase G2 ou M. H3K56ac est une lame double tranchant. L'absence d'H3K56ac rend les cellules sensibles aux dommages l'ADN. En revanche, un excs d'actylation d'H3K56 dans un mutant hst3 hst4 a des consquences encore plus svres tels que la thermo-sensibilit, l'hypersensibilit aux agents gnotoxiques, l'instabilit gnomique ainsi qu'une courte dure de vie rplicative. Les dsactylases Hst3 et Hst4 sont troitement rgules au cours du cycle cellulaire afin de permettre l'H3K56ac d'exercer son rle en rponse aux dommages l'ADN tout en vitant les consquences nfastes de l'hyperactylation d'H3K56. Dans cette thse, nous avons identifi la machinerie molculaire responsable de la dgradation de Hst3. De plus, nous avons explor les raisons pour lesquelles l'absence de dsactylation donne lieu aux phnotypes du mutant hst3 hst4. Au chapitre 2, nous dmontrons que la dgradation d'Hst3 peut tre complte avant l'anaphase. Ceci suggre que la dsactylation de H3K56 a lieu durant une courte fentre du cycle cellulaire se situant entre la compltion de la phase S et la mtaphase. De plus, nous avons identifi deux sites de phosphorylation d'Hst3 par la kinase cycline-dpendante 1 (Cdk1) et dmontr que ces vnements de phosphorylation conduisent la dgradation d'Hst3 in vivo. Nous avons aussi dmontr que l'ubiquityltransfrase Cdc34 et l'ubiquitine ligase SCFCdc4 sont requises pour la dgradation d'Hst3. Finalement, nous avons montr que la phosphorylation d'Hst3 par la kinase mitotique Clb2-Cdk1 peut directement entraner l'ubiquitylation d'Hst3 par SCFCdc4 in vitro. Au chapitre 3, nous avons tudi les mcanismes molculaires sous-jacents la sensibilit extrme du mutant hst3 hst4 aux agents qui endommagent l'ADN. Nous avons tabli qu'en raison de la prsence anormale d'H3K56ac devant les fourches de rplication, le mutant hst3 hst4 exhibe une forte perte de viabilit lorsqu'expos au mthyl mthanesulfonate (MMS) durant un seul passage travers la phase S. Nous avons aussi dcouvert que, malgr le fait que le point de contrle de rponse aux dommages l'ADN est activ normalement dans le mutant hst3 hst4, ce mutant est incapable de complter la rplication de l'ADN et d'inactiver le point de contrle pour une longue priode de temps aprs exposition transitoire au MMS. L'ensemble de nos rsultats suggre que les lsions l'ADN induites par le MMS dans le mutant hst3 hst4 causent une forte perte de viabilit parce que ce mutant est incapable de complter la rplication de l'ADN aprs une exposition transitoire au MMS. Dans la deuxime section du chapitre 3, nous avons employ une approche gntique afin d'identifier de nouveaux mcanismes de suppression de deux phnotypes prononcs du mutant hst3 hst4. Nous avons dcouvert que la dltion de plusieurs gnes impliqus dans la formation de frontires entre l'htrochromatine et de l'euchromatine attnue les phnotypes du mutant hst3 hst4 sans rduire l'hyperactylation d'H3K56. Nos rsultats indiquent aussi que l'abondante actylation de l'histone H4 sur la lysine 16 (H4K16ac) est nfaste au mutant hst3 hst4. Ce rsultat suggre un lien gntique intriguant entre l'actylation d'H3K56 et celle d'H4K16. L'existence de ce lien tait jusqu' prsent inconnu. Nous avons identifi un groupe de suppresseurs spontans o H3K56ac est indtectable, mais la majorit de nos suppresseurs ne montrent aucune rduction flagrante d'H3K56ac ou d'H4 K16ac par rapport aux niveaux observs dans le mutant hst3 hst4. Une tude plus approfondie de ce groupe de suppresseurs est susceptible de mener la dcouverte de nouveaux mcanismes gntiques ou pigntiques permettant d'viter les consquences catastrophiques de l'hyperactylation d'H3K56 chez le mutant hst3 hst4. En rsum, cette thse identifie la machinerie molculaire responsable de la dgradation d'Hst3 (une dsactylase d'H3K56) durant une fentre de temps situes entre la fin de la phase S et la mtaphase. Nos rsultats permettent aussi d'expliquer pourquoi la dgradation d'Hst3 prcde le dbut de la phase S durant laquelle l'actylation d'H3K56 s'accumule derrire les fourches de rplication afin d'exercer son rle de mcanisme de dfense contre le dommage l'ADN. De plus, nous avons identifi plusieurs suppresseurs qui permettent de contourner le rle important d'Hst3 et Hst4 en rponse au dommage l'ADN. Plusieurs suppresseurs rvlent un lien gntique inattendu entre deux formes abondantes d'actylation des histones chez Saccharomyces cerevisiae, soit H3K56ac et H4K16ac.
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La dmence d'Alzheimer est une maladie neurodgnrative caractrise par une perte progressive et irreversible des fonctions cognitives et des comptences intellectuelles. La maladie dAlzheimer se prsente sous deux formes: la forme familiale ou prcoce (EOAD) qui reprsente 5% des cas et elle est lie des mutations gntiques affectant le mtabolisme des peptides amylode; et la forme tardive ou sporadique (LOAD) qui reprsente 95% des cas mais son tiologie est encore mal dfinie. Cependant, le vieillissement reste le principal facteur de risque pour dvelopper LOAD. Les changements pigntiques impliquant des modifications des histones jouent un rle crucial dans les maladies neurodgnratives et le vieillissement li l'ge. Des donnes rcentes ont dcrit LOAD comme un dsordre de l'pignome et ont associ ce trouble l'instabilit gnomique. Les protines Polycomb sont des modificateurs pigntiques qui induisent le remodelage de la chromatine et la rpression des gnes l'htrochromatine facultative. Nous rapportons que les souris htrozygotes pour une protine Polycomb dveloppent avec l'ge un trouble neurologique ressemblant LOAD caractris par laltration des fonctions cognitives, la phosphorylation de la protine tau, l'accumulation des peptides amylode, et le dysfonctionnement synaptique. Ce phnotype pathologique est prcd par la dcondensation de lhtrochromatine neuronale et l'activation de la rponse aux dommages l'ADN. Paralllement, une rduction dexpression de polycomb, malformations de l'htrochromatine neuronale, et l'accumulation de dommages l'ADN taient galement prsents dans les cerveaux de patients LOAD. Remarquablement, les dommages de l'ADN ne sont pas distribus de faon alatoire sur le gnome mais sont enrichis au niveau des squences rptitives. Les conclusions prsentes dans cette thse ont identifi des modifications pigntiques spcifiques qui conduisent une instabilit gnomique aberrante menant la formation de LOAD. Ces rsultats vont aider au dveloppement de nouveaux traitements qui peuvent potentiellement ralentir la neurodgnrescence.
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Les diffrents mcanismes de rgulation posttranscriptionnelle de lexpression des gnes sont de plus en plus reconnus comme des processus essentiels dans divers phnomnes physiologiques importants, comme la prolifration cellulaire et la rponse aux dommages lADN. Deux des protines impliques dans ce type de rgulation sont Staufen1 (Stau1) et Staufen2 (Stau2). Elles sont des protines de liaison lARN double brin qui contribuent au transport de lARN messager (ARNm), au contrle de la traduction, lpissage alternatif et sont responsables de la dgradation de certains ARNm spcifiques. Les protines Staufen peuvent en effet sassocier des ARNm bien prcis, dautant plus que, majoritairement, Stau1 et Stau2 ne se retrouvent pas en complexe avec les mmes cibles. De nombreuses vidences rcentes montrent limplication de divers mcanismes de rgulation posttranscriptionnelle dans la rponse aux dommages lADN, plusieurs protines de liaison lARN y participant dailleurs. De faon importante, cette rponse dicte un ou plusieurs destin(s) la cellule qui doit ragir la suite de dommages lintgrit de son ADN: rparation de lADN, arrt de la prolifration cellulaire, apoptose. Nous avons donc fait lhypothse que lexpression de Stau1 et/ou de Stau2 pourrait tre affecte en rponse un stress gnotoxique, ce qui pourrait avoir comme consquence de moduler lexpression et/ou la stabilit de leurs ARNm cibles. De mme, notre laboratoire a rcemment observ que lexpression de Stau1 varie pendant le cycle cellulaire, celle-ci tant plus leve jusquau dbut de la mitose (promtaphase), puis elle diminue alors que les cellules compltent leur division. Par consquent, nous avons fait lhypothse que Stau1 pourrait lier des ARNm de faon diffrentielle dans des cellules bloques en promtaphase et dans des cellules asynchrones. Dun ct, en employant la camptothcine (CPT), une drogue causant des dommages lADN, pour traiter des cellules de la ligne de cancer colorectal HCT116, nous avons observ que seule lexpression de Stau2 est rduite de faon considrable, tant au niveau de la protine que de lARNm. Lutilisation dautres agents cytotoxiques a permis de confirmer cette observation initiale. De plus, nous avons constat que lexpression de Stau2 est touche mme dans des conditions nengendrant pas une rponse apoptotique, ce qui suggre que cette dpltion de Stau2 est possiblement importante pour la mise en place dune rponse approprie aux dommages lADN. Dailleurs, la surexpression de Stau2 conjointement avec le traitement la CPT entrane un retard dans linduction de lapoptose dans les cellules HCT116. Nous avons aussi montr que la diminution de lexpression de Stau2 est due une rgulation de sa transcription en rponse au stress gnotoxique, ce pourquoi une rgion minimale du promoteur putatif de Stau2 est ncessaire. galement, nous avons identifi que le facteur de transcription E2F1, couramment impliqu dans la rponse aux dommages lADN, peut contrler lexpression de Stau2. Ainsi, E2F1 permet une augmentation de lexpression de Stau2 dans des cellules non traites, mais cette hausse est abolie dans des cellules traites la CPT, ce qui suggre que la CPT pourrait agir en inhibant lactivation transcriptionnelle de Stau2 par E2F1. Enfin, nous avons observ que certains ARNm associs Stau2, et codant pour des protines impliques dans la rponse aux dommages lADN et lapoptose, sont exprims diffremment dans des cellules traites la CPT et des cellules non traites. Dun autre ct, nous avons identifi les ARNm associs Stau1 lors de la promtaphase, alors que lexpression de Stau1 est son niveau le plus lev pendant le cycle cellulaire, grce une tude grande chelle de micropuces dADN dans des cellules HEK293T. Nous avons par la suite confirm lassociation entre Stau1 et certains ARNm dintrts, donc codant pour des protines impliques dans la rgulation de la prolifration cellulaire et/ou le droulement de la mitose. Une comparaison de la liaison de ces ARNm Stau1 dans des cellules bloques en promtaphase par rapport des cellules asynchrones nous a permis de constater une association prfrentielle dans les cellules en promtaphase. Ceci suggre une augmentation potentielle de la rgulation de ces ARNm par Stau1 ce moment du cycle cellulaire. Les donnes prsentes dans cette thse indiquent vraisemblablement que la rgulation posttranscriptionnelle de lexpression gnique contrle par les protines Staufen se fait en partie grce la modulation de lexpression de Stau1 et de Stau2 en fonction des conditions cellulaires. Nous envisageons alors que cette variation de lexpression des protines Staufen ait des consquences sur des sous-ensembles dARNm auxquels elles sont lies et que de cette faon, elles jouent un rle pour rguler des processus physiologiques essentiels comme la rponse aux dommages lADN et la progression dans le cycle cellulaire.
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La dubiquitinase BAP1 ( BRCA1-Associated Protein1 ) a initialement t isole pour sa capacit de promouvoir la fonction suppressive de tumeurs de BRCA1. BAP1 est mut de manire homozygote dans plusieurs cancers (tel que le cancer du rein, de la peau, de loeil et du sein) suggrant fortement que cette dubiquitinase est un suppresseur de tumeurs. Effectivement, la surexpression de BAP1 rduit la prolifration cellulaire et la croissance tumorale dans des modles de xnogreffe de souris. Toutefois, la fonction biologique et le mcanisme daction de cette dubiquitinase restent encore marginalement connus. Ainsi, les objectifs de cette thse sont de caractriser la fonction biologique de BAP1 et de rvler les bases molculaires de sa fonction suppressive de tumeurs. Pour dterminer la fonction biologique de BAP1, nous avons immuno-purifi et identifi les protines associes BAP1, qui savrent tre principalement des facteurs et co-facteurs de transcription. Ensuite, nous avons dmontr que BAP1 est un rgulateur de la transcription. Paralllement, un autre groupe a montr que BAP1 chez la drosophile, Calypso, rgule lubiquitination de H2A et la transcription gnique. Dautre part, nos rsultats danalyse dexpression gnique globale suggrent que BAP1 jouerait un rle important dans la rponse aux dommages lADN. Effectivement, des expriences de gain et de perte de fonction (mthode de lARNi, modle de cellules KO en BAP1 et de cellules dficientes en BAP1 re-exprimant BAP1) ont rvl que cette dubiquitinase rgule la rponse aux bris double brin dADN par la recombinaison homologue. Nos rsultats suggrent que BAP1 exerce sa fonction suppressive de tumeurs en contrlant la rparation sans erreur de lADN via la recombinaison homologue. En cas dinactivation de BAP1, les cellules deviendront plus dpendantes du mcanisme de rparation par jonction d'extrmits non-homologues, qui est potentiellement mutagnique causant ainsi linstabilit gnomique. Dautres tudes seront ncessaires afin de dterminer le rle exact de BAP1 dans la transcription et de comprendre comment la drgulation de lubiquitination de H2A contribue au dveloppement du cancer. Dfinir les mcanismes de suppression tumorale est de grand intrt, non seulement pour comprendre la carcinognse mais galement pour le dveloppement de nouvelles thrapies contre cette maladie.
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Le mlanome malin est lun des cancers les plus mortels dont lincidence continue augmenter chaque anne avec peu de traitement efficace long terme. Il est caus et initi principalement par lexposition excessive aux rayons ultraviolets engendrant des photoproduits hautement gnotoxiques. Il est bien connu que la cascade de signalisation PI3K/Akt joue un rle crucial dans la rgulation des processus qui sont gnralement drguls durant le dveloppement tumoral comme la prolifration, le contrle du cycle cellulaire et lapoptose. Nanmoins, limplication de cette voie molculaire dans la rponse aux dommages lADN est peu caractrise. Chez les mammifres, trois isoformes de la protine kinase Akt ont t identifies: Akt1, Akt2 et Akt3. Bien quelles soient trs homologues en termes de squence, plusieurs tudes ont montr que ces isoformes ont des fonctions biologiques distinctes, et nous suggrons quelles puissent contribuer diffremment la rgulation de la rponse gnotoxique. Les objectifs de ce projet taient de: (i) valuer lactivation dAkt dans les cellules de mlanomes (ii) dterminer limpact de linhibition de cette activit sur la rgulation de la rponse cellulaire aux UV (iii) vrifier si la perte dexpression de lun ou de lautre des isoformes dAkt peut rguler la rponse aux UV. Nous avons dmontr quAkt est transitoirement hyperactive par phosphorylation suite aux irradiations UV dans les lignes cellulaires de mlanomes. Afin de dterminer l'importance de cette activation dans la rponse cellulaire aux UV, notre approche tait de diminuer (i) la phosphorylation dAkt par lusage dinhibiteurs pharmacologiques ou (ii) lexpression de chaque isoforme dAkt par lapproche des ARN interfrents. Nous avons montr que linhibition de la phosphorylation dAkt amne laugmentation du taux de lapoptose induit par les UV dune manire isoforme spcifique, alors quelle na aucun effet sur la rgulation de la voie de rparation par excision de nuclotides (NER), qui est la seule voie humaine pour liminer les dommages lADN induits par les UV. En somme, notre tude constitue un nouvel aspect qui permet de mieux comprendre les mcanismes molculaires du dveloppement de mlanomes malins suites aux irradiations ultraviolettes.
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Les dendrites sont essentielles pour la rception et lintgration des stimuli affrents dans les neurones. De plus en plus dvidences dune dtrioration dendritique sont associes une axonopathie dans les maladies neurodgnratives. Le glaucome dont la physiopathologie est caractrise par une dtrioration progressive et irrversible des cellules ganglionnaires de la rtine (CGRs) est la premire cause de ccit irrversible dans le monde. Son volution est associe un amincissement graduel des axones et latrophie des somas des CGRs. La majorit des tudes de neuroprotection des neuropathies rtiniennes visent la survie et la protection des somas et des axones. Des tudes rcentes ont dmontr des changements dendritiques associs cette pathologie, toutefois les mcanismes molculaires les rgulant sont mconnus. Lhypothse principale de ma thse stipule quune lsion axonale entrane des altrations prcoces des structures dendritiques. Lidentification de voies de signalisation rgulant ces changements permettrait dlaborer des stratgies de neuroprotection et de rtablir la fonction de ces neurones. Dans la premire tude, nous avons examin leffet prcoce dune lsion axonale aige sur la morphologie dendritique des CGRs in vivo. En utilisant des souris transgniques exprimant la protine fluorescente jaune (YFP) soumises une axotomie, nous avons dmontr un rtrcissement de larbre dendritique des CGRs et une diminution slective de lactivit de mTOR avant le dbut de la mort des CGRs lses. Aussi nous avons dmontr une augmentation de lexpression de la protine Regulated in development and DNA damage response 2 (REDD2), un rgulateur ngatif en amont de la protine mTOR en rponse la lsion du nerf optique in vivo. Nous avons dmontr que la ractivation de mTOR par linhibition de lexpression de REDD2 prserve les arbres dendritiques des CGRs adultes. En effet, linjection de petits ARN dinterfrence contre la REDD2 (siREDD2) stimule lactivit de mTOR dans les CGRs lses et augmente significativement la longueur et la surface dendritique totale. De plus, la rapamycine, un inhibiteur de mTOR, inhibe compltement leffet du siREDD2 sur la croissance et llaboration des dendrites. Lanalyse lectrophysiologique des CGRs dmontre une augmentation de lexcitabilit des CGRs lses qui est restaure en prsence du siREDD2. Par ailleurs, des donnes rcentes ont mis en vidence limplication de la neuro-inflammation dans le glaucome, caractrise par une augmentation de cytokines pro-inflammatoires dont principalement le facteur de ncrose tumorale (TNF). Ainsi dans la deuxime tude nous avons examin leffet du TNF exogne sur la morphologie de larbre dendritique des CGRs et commenc ltude des mcanismes molculaires sous-jacents ces changements. Nos rsultats dmontrent que linjection de TNF recombinante dans le vitre induit une rtraction dendritique prcoce qui corrle une rduction de phospho-S6 suggrant limplication de mTOR dans ces CGRs lses. Ainsi, les tudes prsentes dans cette thse mettent en vidence un nouveau rle de mTOR dans la stabilit et le maintien des dendrites de neurones rtiniennes adultes. Ces tudes ont aussi dmontr leffet prcoce de stress direct ou indirect, cest--dire laxotomie et le TNF respectivement sur la pathologie dendritique et sur leur effet sur la fonction neuronale.
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Le cancer du col utrin (CCU) est dans plus de 99% des cas provoqu par une infection avec le virus du papillome humain (VPH), dont le potentiel oncognique rside dans l'expression des proto-oncognes viraux E6/E7. Le potentiel carcinognique de ces protines virales rside essentiellement dans leurs actions sur les produits des gnes suppresseurs de tumeur p53 et RB. Les produits de ces gnes, p53 et Rb, font parti des voies de signalisation de rponse aux dommages de l'ADN cellulaire (RDA) et leur perte entraine une perte de fonctionnalit qui mne une instabilit gnomique. long terme et en prsence de d'autres facteurs ceux-ci mneront au dveloppement d'un cancer. Les protines E6 et E7 sont constitutivement exprimes dans les cellules du CCU ainsi que dans les cellules de tout autre cancer induit par le VPH et seulement dans ces dernires. La prise en charge des cas avancs de ces cancers se fait principalement par radiothrapie et chimiothrapie concomitante. La chimio-radiothrapie utilise en traitement est efficace mais rsulte en un taux lev de morbidit et un nombre important de patientes rcidiveront. Nous proposons que l'exploitation de l'expression spcifique dE6 et dE7 dans les cellules du CCU permette denvisager une stratgie de ltalit synthtique afin d'amplifier l'effet ltal de l'irradiation sur les cellules CCU. Ceci permettrait potentiellement d'augmenter l'efficacit du traitement et de diminuer les rcidives, ainsi que la morbidit lie au traitement. En s'appuyant sur cette hypothse, notre objectif est didentifier des composs dont l'action seule ou couple l'irradiation provoquerait prfrentiellement la mort des cellules exprimant les protines E6 et E7 du VPH. Les cellules testes comprennent des cellules isogniques humaines issues de kratinocytes normaux que nous avons modifies squentiellement pour obtenir les modifications associes aux cellules CCU (hTERT, E6 et E7), ainsi que les lignes de cellules de CCU HeLa et CaSki .Nous avons procd la mise au point et la validation du protocole de criblage et des mthodes dvaluation de la sensibilisation, qui se dfinit comme une perte de viabilit, un arrt ou ralentissement de la croissance, par dtection dATP ainsi que par coloration dADN gnomique au DRAQ5. Suite un criblage cibl impliquant des inhibiteurs connus de la voie de rparation des dommages lADN, nous avons identifi linhibiteur de mdm2, Nutlin-3, comme tant un compos sensibilisant et radio-sensibilisant prfrentiellement les cellules exprimant E6 et E7 du VPH. La Nutlin-3 a t teste sur des cellules HEKn-hTERT-E6-E7, des cellules CaSki et HeLa. Leffet de sensibilisation et de radio-sensibilisation a t confirm dans ces trois lignes. Tel que suggr par son action sur mdmd2, la Nutlin-3 permet la stabilisation de p53 dans les cellules HEKn-hTERT-E6-E7 et CaSki et sa ractivation dans les lignes cellulaires HeLa et CaSki. Malgr cette stabilisation de p53, de faon surprenante, leffet de la Nutlin-3 sur la sensibilisation et la radio-sensibilisation des cellules HeLa et CaSki semble indpendant de p53, tel quobserv en utilisant des cellules HeLa-GSE et CaSki-GSE dont le p53 est dficient. In vivo la Nutlin-3a montre dans un essai prliminaire linhibition de la croissance tumorale des xnogreffes HeLa chez des souris RAG2c. Ce rsultat reste confirmer avec un essai impliquant un nombre dchantillons plus grand. plus long terme, nous comptons tudier limplication de mdm2 dans leffet de sensibilisant de la Nutlin-3 dans les cellules CCUs, ainsi que les autres cibles pouvant tre impliques dans la cration de cet effet sensibilisant observ.
