Outcome of human papillomavirus infection among men in the Finnish Family HPV Study

Ihmisen papilloomaviruksen taudinkuva suomalaisperheiden seurantatutkimuksen mieskohortissa Tieto ihmisen papilloomaviruksen (HPV) yhteydestä eri anatomisten alueiden sairauksien syntyyn on lisännyt mielenkiintoa miehen papilloomavirustulehduksen taudinkulun selvittämiseksi. Tämä väitöskirjatyö on osa suomalaista seurantatutkimusta, jossa tutkitaan HPVinfektioiden tartuntareittejä 329 perheessä. Väitöstyössä keskitytään tutkimukseen osallistuneiden 131 miehen aineistoon. Suun limakalvonäytteet otettiin seitsemässä aikapisteessä. Lisäksi otettiin sukuelinalueen näytteet kahdella seurantakäynnillä. Riskitekijöitä kartoittava kyselytutkimus teetettiin tutkimuksen alkutilanteessa sekä viimeisellä seurantakäynnillä. Oireettomat HPV infektiot olivat alkutilanteessa yleisiä molemmilla sukupuolilla (miesten suu 18,3 % ja sukuelinalue 35,9 %, naisten suu 17,2 % ja kohdunsuu 18,8 %), mutta HPV:n genotyyppien vastaavuus partnerien välillä oli vähäinen. Naisen, mutta ei miehen, seksuaalinen riskikäyttäytyminen oli yhteydessä pariskunnan HPV tyyppien vastaavuuteen. Partnerin ja siviilisäädyn vaihtaminen lisäsivät miehen riskiä saada uusia HPV infektioita. Miehen suun limakalvonäytteistä löytyi kaikkiaan 17 eri HPV tyyppiä. Suun HPV-tulehduksen esiintyvyys vaihteli eri aikapisteissä 15 %:sta 31 %:iin. Uusien HPV tulehdusten ilmaantumisaika vaihteli 3,9 ja 25,7 kuukauden välillä. Suun HPV infektio parani valtaosalla miehistä. Suun krooninen HPV-infektio todettiin 14 %:lla miehistä. Näiden infektioiden keskimääräinen kesto vaihteli 6.0:sta 30.7:ään kuukauteen. Tupakointi lisäsi korkean riskin HPV tyyppien aiheuttamien suun kroonisten infektioiden riskiä, kun taas aikaisemmin sairastetut sukuelinten kondyloomat suojasivat siltä. Tuloksemme osoittavat, että miehen oireeton HPV tulehdus on yleinen suussa ja sukuelinten alueella. Vakaa parisuhde suojaa uusilta HPV tulehduksilta. Tupakoinnilla on keskeinen merkitys suun HPV-infektion kroonistumisessa.

Automaattisen nukleiinihappoeristyslaitteen ja reaaliaikaisen PCR-menetelmän soveltuvuus herpes simplex -virusten keskushermostoinfektiodiagnostiikkaan

Keskushermosto- ja neonataali-infektiot ovat herpes simplex -virusten aiheuttamista taudeista vakavimpia. Niihin on olemassa lääkitys, joka on tehokkain, kun se aloitetaan aivan sairauden alkuvaiheessa. Näiden infektioiden diagnostiikassa PCR-menetelmä on herkin. Tämä menetelmä on kuitenkin työläs ja aikaa vievä, joten uudet nopeammat menetelmät ovat tervetulleita. Opinnäytetyö tehtiin HUSLABin virologian osastolle. Työssä testattiin QIAGENIN artus®HSV-1/2 LC PCR-reagenssipakkausta, joka on tehty käytettäväksi Roche diagnosticsin reaaliaikaisella PCR-laitteella LightCyclerillä. Lisäksi työssä testattiin automaattista bioMérieuxin NucliSens easyMAG- nukleiinihappoeristyslaitetta. Referenssinä käytettiin HUSLABin virologian osastolla testaushetkellä käytössä olevia menetelmiä. Reaaliaikaisen PCR-menetelmän herkkyyttä testattiin positiivisilla HSV-1 ja HSV-2 kontrollilaimennussarjoilla. Menetelmän oikeellisuutta testattiin määrittämällä laaduntarkkailu- ja potilasnäytteitä, jotka olivat likvoria. Tuloksia verrattiin QCMD:n antamiin ja perinteisellä ”in house”- PCR-menetelmällä saatuihin referenssituloksiin. Spesifisyyttä testattiin muiden ihmisten herpesvirusten positiivisilla kontrolleilla. Automaattisen nukleiinihappoeristysmenetelmän toimivuutta testattiin HSV-positiivisilla ja -negatiivisilla likvornäytteillä, jotka oli aikaisemmin eristetty fenoli-kloroformiuutolla. Tulokset QIAGENIN artus®HSV-1/2 LC PCR-reagenssipakkauksesta olivat hyviä. Kont-rollilaimennussarjan määrityksessä reaaliaikainen PCR-menetelmä osoittautui perinteistä ”in house”- PCR-menetelmää herkemmäksi. Potilasnäytteiden määrityksessä tulokset olivat yhtenevät. EasyMAG- nukleiinihappoeristysmenetelmällä eristettyjen potilasnäytteiden määrityksistä saadut tulokset olivat myös hyviä. Kun tuloksia verrattiin fenoli-kloroformiuutolla saatuihin tuloksiin, olivat tulokset yhtä näytettä lukuun ottamatta yhtenevät. Molemmat testattavat menetelmät ovat nopeita ja virhelähteiden mahdollisuus on vähäisempi kuin perinteisessä ”in house”-PCR menetelmässä ja fenoli-kloroformiuutolla nukleiinihappoa eristettäessä. Tutkimusten tulokset osoittivat molempien menetelmien soveltuvan hyvin HSV:n eristykseen ja määritykseen likvornäytteistä.

Enterohemorraginen Escherichia coli (EHEC) ja sen osoittaminen PCR-menetelmällä

Summary: Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) and its detection with a PCR method

Aikaerotteisesti fluoresenssia mittaavan reaaliaikaisen PCR-laitteen kehitys

Kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (engl. polymerase chain reaction, PCR) on osoittautunut käyttäjäystävällisimmäksi menetelmäksi nukleiinihapposekvenssien kvantitoimisessa. Tätä menetelmää voidaan herkistää pienempien DNA-pitoisuuksien havaitsemiseen käyttämällä hyväksi aikaerotteista fluorometriaa (engl. time-resolved fluorometry, TRF) ja luminoivia lantanidileimoja, joiden fluoresenssin pitkän eliniän ansiosta emission mittaus voidaan suorittaa vasta hetki virittävän valopulssin jälkeen, jolloin lyhytikäinen taustasäteily ehtii sammua. Tuloksena saadaan korkea signaali-taustasuhde. Tämän diplomityön tarkoituksena oli rakentaa TRF:än pystyvä reaaliaikainen PCR-laite, sillä tällaista laitetta ei ole markkinoilla tarjolla. Laite rakennettiin kehittämällä lämpökierrätin ja yhdistämällä se valmiiseen TRF:än kykenevään mittapäähän. Mittapään ja lämpökierrättimen hallitsemiseksi kehitettiin myös tietokoneohjelma. Valon tuottamiseksi ja mittaamiseksi haluttiin käyttää edullisia komponentteja, joten työssä käytettiin valmiin mittapään optiikkaa, jossa viritys tapahtuu hohtodiodilla (engl. light-emitting diode, LED) ja lantanidileiman emission mittaus fotodiodilla (engl. photodiode, PD) tai valomonistinputkella (engl. photomultiplier tube, PMT). Myös mittapään suorituskykyä tutkittiin. Työtä varten kehitettiin lämpökierrätin, joka koostui Peltier-elementillä lämmitettävästä PCR-putkitelineestä ja lämpökannesta. Mittalaitteen suorituskyvyn tutkimiseen käytettiin kelaattikomplementaatioon perustuvaa PCR-tuotteen havaitsemismenetelmää. Kelaattikomplementaatio perustuu kahteen erilliseen oligonukleotidimolekyyliin, joista toiseen on sidottu lantanidi-ioni ja toiseen valoa absorboiva ligandirakenne, jotka yhdessä muodostavat fluoresoivan kokonaisuuden. Kehitetyn lämpökierrättimen todettiin olevan tarpeeksi tarkka sekä tehokas ja sen lämmitys- ja jäähdytysnopeuden maksimeiksi saatiin 2,6 °C/sekunti. Detektorina käytetyn PD:n ei todettu olevan tarpeeksi herkkä emission havainnoimiseksi ja se korvattiin laitteessa PMT:llä. Käytetyllä PCR-määrityksellä kynnyssykleiksi (engl. threshold cycle, Ct) sekä kehitetylle että referenssilaitteelle saatiin 28,4 käyttämällä samaa 100 000 kopion DNA:n aloitusmäärää. Työssä osoitettiin, että on mahdollista kehittää edullisia komponentteja käyttävä, TRF:än pystyvä, reaaliaikainen PCR-laite, joka kykenee vastaavaan Ct-arvoon kuin vertailulaite. PD:n herkkyys ei kuitenkaan riittänyt. Tulokset olivat lupaavia, sillä LED- ja PD-teknologiat kehittyvät ja markkinoille on tullut myös muita komponentteja, joiden avulla on tulevaisuudessa mahdollista kehittää vielä herkempi laite.