Aikaerotteisesti fluoresenssia mittaavan reaaliaikaisen PCR-laitteen kehitys

Kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (engl. polymerase chain reaction, PCR) on osoittautunut käyttäjäystävällisimmäksi menetelmäksi nukleiinihapposekvenssien kvantitoimisessa. Tätä menetelmää voidaan herkistää pienempien DNA-pitoisuuksien havaitsemiseen käyttämällä hyväksi aikaerotteista fluorometriaa (engl. time-resolved fluorometry, TRF) ja luminoivia lantanidileimoja, joiden fluoresenssin pitkän eliniän ansiosta emission mittaus voidaan suorittaa vasta hetki virittävän valopulssin jälkeen, jolloin lyhytikäinen taustasäteily ehtii sammua. Tuloksena saadaan korkea signaali-taustasuhde. Tämän diplomityön tarkoituksena oli rakentaa TRF:än pystyvä reaaliaikainen PCR-laite, sillä tällaista laitetta ei ole markkinoilla tarjolla. Laite rakennettiin kehittämällä lämpökierrätin ja yhdistämällä se valmiiseen TRF:än kykenevään mittapäähän. Mittapään ja lämpökierrättimen hallitsemiseksi kehitettiin myös tietokoneohjelma. Valon tuottamiseksi ja mittaamiseksi haluttiin käyttää edullisia komponentteja, joten työssä käytettiin valmiin mittapään optiikkaa, jossa viritys tapahtuu hohtodiodilla (engl. light-emitting diode, LED) ja lantanidileiman emission mittaus fotodiodilla (engl. photodiode, PD) tai valomonistinputkella (engl. photomultiplier tube, PMT). Myös mittapään suorituskykyä tutkittiin. Työtä varten kehitettiin lämpökierrätin, joka koostui Peltier-elementillä lämmitettävästä PCR-putkitelineestä ja lämpökannesta. Mittalaitteen suorituskyvyn tutkimiseen käytettiin kelaattikomplementaatioon perustuvaa PCR-tuotteen havaitsemismenetelmää. Kelaattikomplementaatio perustuu kahteen erilliseen oligonukleotidimolekyyliin, joista toiseen on sidottu lantanidi-ioni ja toiseen valoa absorboiva ligandirakenne, jotka yhdessä muodostavat fluoresoivan kokonaisuuden. Kehitetyn lämpökierrättimen todettiin olevan tarpeeksi tarkka sekä tehokas ja sen lämmitys- ja jäähdytysnopeuden maksimeiksi saatiin 2,6 °C/sekunti. Detektorina käytetyn PD:n ei todettu olevan tarpeeksi herkkä emission havainnoimiseksi ja se korvattiin laitteessa PMT:llä. Käytetyllä PCR-määrityksellä kynnyssykleiksi (engl. threshold cycle, Ct) sekä kehitetylle että referenssilaitteelle saatiin 28,4 käyttämällä samaa 100 000 kopion DNA:n aloitusmäärää. Työssä osoitettiin, että on mahdollista kehittää edullisia komponentteja käyttävä, TRF:än pystyvä, reaaliaikainen PCR-laite, joka kykenee vastaavaan Ct-arvoon kuin vertailulaite. PD:n herkkyys ei kuitenkaan riittänyt. Tulokset olivat lupaavia, sillä LED- ja PD-teknologiat kehittyvät ja markkinoille on tullut myös muita komponentteja, joiden avulla on tulevaisuudessa mahdollista kehittää vielä herkempi laite.

Quantitative real-time polymerase chain reaction has been shown to be easy to use method for measuring DNA and RNA quantitatively. The sensitivity of the method can be improved by using luminescent lanthanide labels with time resolved fluorometry (TRF) to detect DNA at earlier cycles. The long lifetime of fluorescence of lanthanide labels enables the use of delayed time gate after the exciting light pulse to measure emission light after the short lived autofluorescence has decayed. With this method a high signal to background ratio can be obtained. The aim of this Master's thesis was to develop a TRF capable real-time PCR device since there are currently no TRF measurement capable real-time PCR devices in the market. The device was constructed by developing a thermal cycler and combining it with a TRF measurement capable detector head. A PC software was also developed to control the combined detector and thermal cycler. A detector module with low cost components, an ultra violet light emitting diode (UV-LED) for excitation and a photodiode (PD) or a photomultilplier tube (PMT) for detection, was used. The capability of the detector module was studied. A metal holder and a heated lid for the sample tube were also developed. The temperature of the holder was controlled with a Peltier element. A PCR detection method based on lanthanide chelate complementation was used for studying the performance of the device. The method is based on a lanthanide ion carrier and light-absorbing components of a luminescent lanthanide chelate which are carried by two discrete oligonucleotide molecules and which together form a fluorescent complex. The developed thermal cycler was found to be effective and accurate enough with heating and cooling ramps of 2,6 °C/second. It was found that the PD used for the detection of the emission signal was not sensitive enough and it was replaced with a PMT. With the used PCR assay the threshold cycle (Ct) for the developed device and for the reference device was 28,4 with the same amount of 100 000 copies of starting template. It was shown that a low cost TRF measuring real-time PCR device can be developed to produce similar Ct as the reference device. However it was shown that the PD was not sensitive enough. The results were promising since LED and PD technologies are still improving and there are also other components which can be used to develop even more sensitive device in the future.