Automaattisen nukleiinihappoeristyslaitteen ja reaaliaikaisen PCR-menetelmän soveltuvuus herpes simplex -virusten keskushermostoinfektiodiagnostiikkaan

Keskushermosto- ja neonataali-infektiot ovat herpes simplex -virusten aiheuttamista taudeista vakavimpia. Niihin on olemassa lääkitys, joka on tehokkain, kun se aloitetaan aivan sairauden alkuvaiheessa. Näiden infektioiden diagnostiikassa PCR-menetelmä on herkin. Tämä menetelmä on kuitenkin työläs ja aikaa vievä, joten uudet nopeammat menetelmät ovat tervetulleita. Opinnäytetyö tehtiin HUSLABin virologian osastolle. Työssä testattiin QIAGENIN artus®HSV-1/2 LC PCR-reagenssipakkausta, joka on tehty käytettäväksi Roche diagnosticsin reaaliaikaisella PCR-laitteella LightCyclerillä. Lisäksi työssä testattiin automaattista bioMérieuxin NucliSens easyMAG- nukleiinihappoeristyslaitetta. Referenssinä käytettiin HUSLABin virologian osastolla testaushetkellä käytössä olevia menetelmiä. Reaaliaikaisen PCR-menetelmän herkkyyttä testattiin positiivisilla HSV-1 ja HSV-2 kontrollilaimennussarjoilla. Menetelmän oikeellisuutta testattiin määrittämällä laaduntarkkailu- ja potilasnäytteitä, jotka olivat likvoria. Tuloksia verrattiin QCMD:n antamiin ja perinteisellä ”in house”- PCR-menetelmällä saatuihin referenssituloksiin. Spesifisyyttä testattiin muiden ihmisten herpesvirusten positiivisilla kontrolleilla. Automaattisen nukleiinihappoeristysmenetelmän toimivuutta testattiin HSV-positiivisilla ja -negatiivisilla likvornäytteillä, jotka oli aikaisemmin eristetty fenoli-kloroformiuutolla. Tulokset QIAGENIN artus®HSV-1/2 LC PCR-reagenssipakkauksesta olivat hyviä. Kont-rollilaimennussarjan määrityksessä reaaliaikainen PCR-menetelmä osoittautui perinteistä ”in house”- PCR-menetelmää herkemmäksi. Potilasnäytteiden määrityksessä tulokset olivat yhtenevät. EasyMAG- nukleiinihappoeristysmenetelmällä eristettyjen potilasnäytteiden määrityksistä saadut tulokset olivat myös hyviä. Kun tuloksia verrattiin fenoli-kloroformiuutolla saatuihin tuloksiin, olivat tulokset yhtä näytettä lukuun ottamatta yhtenevät. Molemmat testattavat menetelmät ovat nopeita ja virhelähteiden mahdollisuus on vähäisempi kuin perinteisessä ”in house”-PCR menetelmässä ja fenoli-kloroformiuutolla nukleiinihappoa eristettäessä. Tutkimusten tulokset osoittivat molempien menetelmien soveltuvan hyvin HSV:n eristykseen ja määritykseen likvornäytteistä.

Enterohemorraginen Escherichia coli (EHEC) ja sen osoittaminen PCR-menetelmällä

Summary: Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) and its detection with a PCR method

Lopentien (mt 132) pienet liikenneturvallisuutta parantavat toimenpiteet Röykän taajamassa : Toimenpidesuunnitelma

Työn tavoitteena oli Nurmijärven Röykkään Lopentielle (mt 132) sijoittuvan kevyen liikenteen alikulkutarpeen tutkiminen. Suunnitelmassa on päädytty esittämään vaihtoehtoisia ja korvaavia ratkaisuja kevyen liikenteen alikululle ja liikenneturvallisuuden parantamiselle Röykän taajamassa. Suurimmat syyt kevyen liikenteen alikulun jättämiseen pois suunnitelmasta ovat seuraavat. 1) Nykytilanteen analyysin ja maastokäynnin perusteella voidaan todeta, että Röykän taajamassa kevyen liikenteen tilanne on nykyisellään suhteellisen turvallinen. 2) Alikulkua ei voi toteuttaa ”Keimola-Loppi maantien 132 parantaminen ja varustaminen jk + pp -tiellä Röykän taajamassa” -tiesuunnitelmassa vuodelta 1996 sekä Nurmijärven kevyen liikenteen väylästön ja ulkoilureitistön suunnitelmassa 2010 esitettyyn kohtaan perustuen Uudenmaan ympäristökeskuksen lausuntoon tiesuunnitelmasta. Lisäksi, mikäli alikulku sijaitsisi kyseisessä kohdassa, se ei sijoittuisi paikkaan, jossa sille olisi suurin tarve (kaupan ja muiden palveluiden sekä koulun välille). 3) Alikulkua ei ole mahdollista toteuttaa Uudenmaan ELY-keskuksen kevyen liikenteen tarveselvityksen 2010 mukaisesti Röykän kaupan läheisyyteen kohtuullisin kustannuksin ympäröivän maankäytön aiheuttaman tilanpuutteen ja siitä johtuvan jyrkän pituuskaltevuuden takia. 4) Alikulun kustannusarvio on tarkentunut Uudenmaan ELY-keskuksen kevyen liikenteen tarveselvityksestä 2010 (300 000 €) Nurmijärven kevyen liikenteen väylästön ja ulkoilureitistön suunnitelmaan 2010 (500 000 €) perustuen mm. vaativiin pohjaolosuhteisiin ja alikulun sijoittumispaikkaan. Kohonneet kustannukset laskevat alikulun kustannustehokkuutta. 5) Tässä suunnitelmassa esitettyjen toimenpiteiden toteuttamisella saavutetaan laskennallisesti 0,181 henkilövahinkoon johtaneen onnettomuuden vuosittainen vähenemä, kun pelkän alikulun toteuttamisella saavutettaisiin 0,020 henkilövahinkoon johtaneen onnettomuuden vuosittainen vähenemä. Tämä on vain yhdeksäsosa siitä mitä koko taajamajakson kattavilla pienillä toimenpiteillä yhteensä saavutetaan. Suunnitelmassa esitetyillä toimenpiteillä parannetaan pääasiassa Lopentien (mt 132) liittymiä ajoneuvoliikenteen ja kevyen liikenteen turvallisuuden lisäämiseksi sekä nykyisten kevyen liikenteen tienylityspaikkojen turvallisuutta. Suunnitelmassa esitetyt toimenpiteet toteutetaan Uudenmaan ELY-keskuksen ”Pienet liikenneturvallisuustoimenpiteet” -hankkeen yhteydessä. Toimenpiteet otetaan suunnitteluun mahdollisimman pian ja toteutukseen mahdollisesti jo vuonna 2012 (osin jo vuonna 2011).

Kempeleentien (mt 816) ja Piriläntien (mt 8154) toimenpidesuunnitelma

Kempeleentien ja Piriläntien toimenpidesuunnitelma on laadittu, koska maankäyttö on muuttunut ja on muuttumassa edelleen merkittävästi teiden varsilla. Kempeleentiestä on olemassa vanha yleissuunnitelma, jonka esitykset haluttiin tarkistaa. Piriläntien osalta aiempaa, tulevaan maankäyttöön soveltuvaa suunnitelmaa ei ollut. Suunnitelma on laadittu Pohjois-Pohjanmaan ELY-keskuksen ja Kempeleen kunnan yhteistyönä. Suunnitelma on tehty samaan aikaan Kempeleen liikenneturvallisuussuunnitelman laatimisen kanssa. Suunnittelussa on hyödynnetty samoja lähtöaineistoja ja vuoropuhelu on käyty samanaikasesti. Suunnitelmaluonnoksia on esitelty asukkaille ja valtuutetuille syksyllä 2013. Toimenpidesuunnitelmassa on keskitytty liittymien sekä jalankulun ja pyöräilyn sujuvuuden ja liikenneturvallisuuden parantamiseen. Kempeleentien osalta liittymät säilyvät nykypaikoillaan. Piriläntiellä liittymät muuttuvat maankäytön toteutumisen mukana. Kempeleen ydinalueen liikenteen kehittymiseen ja liikennevirtoihin vaikuttaa merkittävästi uuden radan poikkiyhteyden toteutuminen Asemanseudun pohjoispuolelle. Mahdollinen Zatelliitin eritasoliittymän toteutuminen moottoritielle siirtää liikennettä Ketolanperantieltä uudelle poikkiyhteydelle, ja muutos vaikuttaa myös Kempeleentien liikenteeseen jonkin verran. Kempeleentien vilkkaimpiin liittymiin esitetään liikennevalo-ohjausta. Liikennevalot voidaan rakentaa ensimmäisessä vaiheessa nykyliittymiin ja toisessa vaiheessa rakennetaan tarvittavat lisäkaistat. Muihin liittymiin tehdään pieniä muutoksia. Piriläntiellä liittymät eivät tarvitse merkittäviä kaistajärjestelyjä, mutta sijainnit muuttuvat. Piriläntien ja Eteläsuomentien liittymään rakennetaan liikennevalo-ohjaus kesällä 2014. Jalankulku- ja pyöräteitä rakennetaan lisää varsinkin uuden maankäytön myötä. Taajaman länsiosaan muodostuu pohjois-etelä- ja itä-länsisuuntaisia yhteyksiä. Yksi tärkeimmistä on uuden radan poikkiyhteyden myötä syntyvä reitti Kokkokankaalta ydinkeskustaan ja edelleen Kirkonkylän koulukeskukseen. Joukkoliikenteen toimintaedellytyksiä pyritään parantamaan pysäkkijärjestelyillä. Esitetyillä toimenpiteillä parannetaan liikenneturvallisuutta ja liikenteen sujuvuutta. Muutokset mahdollistavat maankäytön kehittämisen. Toimenpide-esitysten alustava kustannusarvio on noin 1,7 miljoonaa euroa. Toimenpiteille on esitetty ohjeellinen kiireellisyysjärjestys.

Aikaerotteisesti fluoresenssia mittaavan reaaliaikaisen PCR-laitteen kehitys

Kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (engl. polymerase chain reaction, PCR) on osoittautunut käyttäjäystävällisimmäksi menetelmäksi nukleiinihapposekvenssien kvantitoimisessa. Tätä menetelmää voidaan herkistää pienempien DNA-pitoisuuksien havaitsemiseen käyttämällä hyväksi aikaerotteista fluorometriaa (engl. time-resolved fluorometry, TRF) ja luminoivia lantanidileimoja, joiden fluoresenssin pitkän eliniän ansiosta emission mittaus voidaan suorittaa vasta hetki virittävän valopulssin jälkeen, jolloin lyhytikäinen taustasäteily ehtii sammua. Tuloksena saadaan korkea signaali-taustasuhde. Tämän diplomityön tarkoituksena oli rakentaa TRF:än pystyvä reaaliaikainen PCR-laite, sillä tällaista laitetta ei ole markkinoilla tarjolla. Laite rakennettiin kehittämällä lämpökierrätin ja yhdistämällä se valmiiseen TRF:än kykenevään mittapäähän. Mittapään ja lämpökierrättimen hallitsemiseksi kehitettiin myös tietokoneohjelma. Valon tuottamiseksi ja mittaamiseksi haluttiin käyttää edullisia komponentteja, joten työssä käytettiin valmiin mittapään optiikkaa, jossa viritys tapahtuu hohtodiodilla (engl. light-emitting diode, LED) ja lantanidileiman emission mittaus fotodiodilla (engl. photodiode, PD) tai valomonistinputkella (engl. photomultiplier tube, PMT). Myös mittapään suorituskykyä tutkittiin. Työtä varten kehitettiin lämpökierrätin, joka koostui Peltier-elementillä lämmitettävästä PCR-putkitelineestä ja lämpökannesta. Mittalaitteen suorituskyvyn tutkimiseen käytettiin kelaattikomplementaatioon perustuvaa PCR-tuotteen havaitsemismenetelmää. Kelaattikomplementaatio perustuu kahteen erilliseen oligonukleotidimolekyyliin, joista toiseen on sidottu lantanidi-ioni ja toiseen valoa absorboiva ligandirakenne, jotka yhdessä muodostavat fluoresoivan kokonaisuuden. Kehitetyn lämpökierrättimen todettiin olevan tarpeeksi tarkka sekä tehokas ja sen lämmitys- ja jäähdytysnopeuden maksimeiksi saatiin 2,6 °C/sekunti. Detektorina käytetyn PD:n ei todettu olevan tarpeeksi herkkä emission havainnoimiseksi ja se korvattiin laitteessa PMT:llä. Käytetyllä PCR-määrityksellä kynnyssykleiksi (engl. threshold cycle, Ct) sekä kehitetylle että referenssilaitteelle saatiin 28,4 käyttämällä samaa 100 000 kopion DNA:n aloitusmäärää. Työssä osoitettiin, että on mahdollista kehittää edullisia komponentteja käyttävä, TRF:än pystyvä, reaaliaikainen PCR-laite, joka kykenee vastaavaan Ct-arvoon kuin vertailulaite. PD:n herkkyys ei kuitenkaan riittänyt. Tulokset olivat lupaavia, sillä LED- ja PD-teknologiat kehittyvät ja markkinoille on tullut myös muita komponentteja, joiden avulla on tulevaisuudessa mahdollista kehittää vielä herkempi laite.