Modelação estatística das co-infecções da SIDA em países da União Europeia

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Matemática, especialidade de Estatística, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Infecções por Tinea capitis em meios desfavorecidos da periferia de Lisboa - Estudo em crianças do Bairro de Santa Filomena, Concelho da Amadora

PLAVRAS – CHAVE: Tinea capitis, colheita de amostras, diagnóstico laboratorial, questionário, estratégias de intervenção Os fungos dermatófitos estão entre os mais disseminados e prevalentes das doenças causadas por fungos, afectam milhões de pessoas em todas as partes do mundo. A tinea capitis é a infecção fúngica mais comum na idade pediátrica, é contagiosa, havendo aumento do risco de infecção quando existe partilha de objectos e poucos cuidados de higiene. É uma infecção que afecta essencialmente crianças e pré-adolescentes, sendo que estes apresentam mais susceptibilidade e exposição à infecção. É uma infecção com distribuição mundial, sendo muito comum em África. Anteriormente as áreas endémicas estavam mais definidas, mas com o aumento das viagens inter-continentais e da imigração novas doenças têm-se expandido nos países de acolhimento, daí o aumento da prevalência desta infecção nos países Europeus. Para além de ser uma doença com um impacto social marcado, levando as crianças à restrição de actividades sociais, como a ida à escola e todas as consequências que daí advêm, como por exemplo a exclusão. Perante esta situação, realizou-se um estudo de forma a identificar a prevalência da tinea capitis em crianças com idades entre os 1-14 anos no Bairro de Santa Filomena, Concelho da Amadora, Portugal, e os conhecimentos (definição, diagnóstico e tratamento) dos encarregados de educação/responsáveis pela criança sobre a doença, para se poderem traçar estratégias de intervenção. A população era composta por 127 crianças, que frequentavam a Associação da Encosta Nascente e o Centro de Catequese leccionado no Bairro de Santa Filomena, sendo 44,9% do Sexo Masculino e 55,1% do sexo Feminino, com idades pré-escolar e escolar. Utilizaram-se três técnicas de diagnóstico, observação clínica, microscopia e exame cultural. As amostras do couro cabeludo das crianças foram analisadas no Laboratório de Micologia do Instituto de Higiene e Medicina Tropical. A prevalência de crianças com doença activa foi de 17,3% e de portadoras 19,7%. Foram identificados dois agentes etiológicas, Microsporum audouinii e o Tricophyton soudanense (fungos de origem Africana). Aos encarregados de educação/responsáveis pelas crianças aplicou-se um questionário sobre aspectos relacionados com a infecção por tinea capitis. Os respondentes mostraram poucos conhecimentos, alguns até incorrectos. Tendo em vista o controlo da infecção, é necessário envolver vários parceiros, como os Centros de Saúde e Centros de Educação (Creches /Escolas/Catequese), para além dos encarregados de educação, intervindo na sua formação com Sessões de Educação, rastreios, diagnóstico e tratamento, medidas preventivas e melhorias das condições de higiene pessoal e ambiental.

A infertilidade na mulher e a ocorrência de infecções sexualmente transmissíveis em idade fértil

RESUMO - Enquadramento: Num momento em que a população mundial atinge os 7 biliões, um dos capítulos do Relatório do Fundo de População das Nações Unidas é dedicado à fertilidade. A maioria dos países europeus apresenta taxas de fecundidade abaixo das necessárias para a reposição populacional. Portugal não é excepção, apresentando um índice sintético de fecundidade, em 2009 de 1,32 crianças por mulher. Calcula-se que 10% dos casais portugueses são inférteis, com uma distribuição equitativa de causas femininas e masculinas (30% individualmente e 90% em conjunto). Para esta diminuição da taxa de fecundidade concorrem vários determinantes, entre eles a ocorrência de infecções sexualmente transmissíveis anteriores que desencadeiam alterações do aparelho genital feminino, provocando doença pélvica inflamatória e consequentemente infertilidade. Das infecções sexualmente transmissíveis, a infecção por Chlamydia trachomatis continua a ser a mais reportada por toda a Europa, encontrada em rastreios em grupos de jovens com idades abaixo dos 25 anos. É uma infecção passível de ser tratada, com cura, embora não confira uma imunidade duradoura. As infecções sexualmente transmissíveis, algumas delas há muito conhecidas do homem, constituem uma causa evitável de infertilidade. Finalidade / Objectivos: Conhecer a frequência de infecções sexualmente transmissíveis na história ginecológica de mulheres com infertilidade, com a finalidade de poder contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias na Saúde Reprodutiva para aumentar a índice sintético de fecundidade de Portugal. Metodologia: Estudo exploratório, natureza retrospectiva, uma vez que partimos do problema infertilidade, e averiguam-se antecedentes de infecções sexualmente transmissíveis, através da aplicação de um questionário às mulheres seguidas em consulta de infertilidade em instituições de saúde do SNS na área de abrangência da ARS LVT, durante o período de 1 de Janeiro a 31 de Dezembro de 2012. Discussão / Conclusão: É expectável que os resultados obtidos neste estudo vão de encontro ao que é relatado na literatura, confirmando a hipótese de trabalho que aponta para a existência de infecções sexualmente transmissíveis em mulheres seguidas em consultas de infertilidade. Certo é que a infertilidade tende a ser uma realidade crescente, associada a múltiplos factores, sendo que um deles continua a ser a exposição a agentes microbianos, constituindo em si mesma uma causa evitável. Se pretendemos aumentar o índice sintético de fecundidade de Portugal, é necessário investir também no estudo dos determinantes que concorrem para a fertilidade. Na realidade, para além da emergente necessidade de implementar um sistema de vigilância nacional das infecções sexualmente transmissíveis, é necessária uma aposta mais profunda na informação / educação, sensibilização dos jovens ainda antes do início da actividade sexual, e não apenas nas consultas de planeamento familiar. É certamente um trabalho pluridisciplinar que envolve parceiros comunitários como a escola e outros centros educativos, a família, o centro de saúde, a sociedade em geral, em particular, cada um de nós.

Ocorrência, diagnóstico molecular e resistência a antifúngicos de Candida sp. de infecções vaginais em Portugal e Cabo-Verde

Dissertação para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Nova abordagem no diagnóstico de infecções invasivas por fungos do género Aspergillus

Nas últimas duas décadas tem-se verificado um aumento da incidência de aspergilose pulmonar invasiva, que se reflecte em taxas de mortalidade e morbilidade extremamente elevadas. Esta realidade resulta da elevada utilização de quimioterapia e de agentes imunossupressores, usados sobretudo em doentes imunocomprometidos, principalmente, em doentes hemato-oncológicos e receptores de transplante de medula óssea. Estas infecções fúngicas são provocadas por algumas espécies do género Aspergillus em que Aspergillus fumigatus é a espécie mais frequentemente isolada a partir de infecções humanas. Contudo, outras espécies como A. flavus, A. niger, A. glaucus, A. nidulans, A. terreus ou A. versicolor também podem ser responsáveis por infecções fúngicas no Homem. Um factor determinante para o aumento da incidência de aspergilose invasiva consiste na incapacidade de se estabelecer um diagnóstico precoce definitivo para que, em tempo útil, possa ser instituída terapêutica antifúngica que vá seguramente melhorar o prognóstico desses doentes. Actualmente, as técnicas convencionais (microbiológicas e histológicas) têm servido como linhas de orientação para o diagnóstico definitivo de micoses. No entanto, como se tratam técnicas morosas, o diagnóstico imunológico e molecular tem todas as potencialidades para oferecer uma abordagem promissora no diagnóstico de infecções fúngicas. Neste trabalho foram estudadas 37 amostras clínicas, das quais 45,9% pertenciam a indivíduos do sexo feminino, 54,1% do sexo masculino, maioritariamente com o diagnóstico clínico de leucemia mielóide aguda (75,7%). O principal objectivo deste trabalho consistiu na comparação dos resultados obtidos por uma técnica imunológica utilizada no diagnóstico de aspergilose pulmonar invasiva (pesquisa do antigénio GM) com uma nova técnica molecular de diagnóstico (nested-PCR), com o intuito de avaliar a sensibilidade e especificidade dos resultados obtidos. Dos 37 doentes do estudo, 35,1% revelaram presença do antigénio galactomanano e em 32,4% das amostras foi possível detectar DNA fúngico utilizando primers específicos numa reacção de nested-PCR. No final deste trabalho pode-se constatar que, em virtude do método molecular utilizando uma reacção de nested-PCR não se ter revelado mais sensível que a pesquisa do antigénio galactomanano, julgamos ser no entanto muito promissor no diagnóstico da aspergilose pulmonar invasiva, bastando apenas aperfeiçoar a sua optimização.

Conhecimentos e comportamentos sobre algumas infecções sexualmente transmissíveis dos alunos dos Ensinos Básicos e Secundário de uma escola da área Metropolitana de Lisboa

Os jovens são um grupo onde a prevalência e a incidência das Infecções Sexualmente Transmissíveis (IST) é cada vez maior. Este facto parece dever-se a um grupo de factores determinantes, entre os quais se destaca o comportamento de utilização do preservativo, enquanto único método capaz de evitar a transmissão das IST. A resolução do problema passa pela implementação de programas de prevenção e controlo ajustados à população juvenil. No entanto, a investigação dos factores determinantes das IST que estão na base destes programas tem sido escassa em Portugal. O presente estudo do tipo observacional, analítico e transversal incidiu sobre a totalidade dos 1101 alunos de uma escola da periferia de Lisboa e teve como objectivos: descrever alguns conhecimentos e factores sociodemográficos, escolares e comportamentais determinantes das IST; averiguar se existem diferenças atribuíveis à idade e ao sexo nestes factores determinantes; averiguar se estes factores determinantes se encontram associados à utilização do preservativo. Na colheita dos dados foi utilizado um questionário de auto-preenchimento, desenvolvido para o efeito, e no tratamento dos mesmos recorreu-se à estatística descritiva e analítica. Os resultados obtidos no presente estudo demonstram que a principal fonte de informação sobre sexualidade dos alunos são os amigos, mas estes preferiam que fossem os profissionais de saúde. Para além dos vírus da imunodeficiência humana e do herpes genital, a identificação de outras IST foi insuficiente. Os conhecimentos sobre a transmissão sexual das IST foram satisfatórios, mas não se repercutem na utilização do preservativo pelos alunos durante as relações não coitais. O sexo e a idade dos alunos encontram-se significativamente associados a fontes de informação sobre sexualidade e a algumas dimensões do conhecimento sobre as IST, do comportamento sexual e da procura de tratamento médico. Todavia, a maioria destes factores determinantes não está associada à utilização do preservativo pelos alunos.

Infecções Sexualmente Transmissíveis em utentes que recorrem à Consulta de DST no Centro de Saúde da Lapa: Relação entre Conhecimentos, Atitudes e Práticas de Prevenção e a Prevalência de Infecções Sexualmente Transmissíveis

As Infecções sexualmente transmissíveis possuem distribuição mundial e são um grave problema de saúde pública, com difícil controlo. Estas infecções apresentam-se como causa de mortalidade e morbilidade significativos e propiciam a transmissão do HIV. Assim, foi realizado um estudo quantitativo, descritivo, exploratório e não interventivo a partir de uma amostra não probabilística por conveniência de 556 utentes que recorreram à consulta do Centro de Saúde na Lapa no período de 1 de Fevereiro a 30 de Julho de 2011. Verificou-se que os utentes participantes no estudo são maioritariamente jovens, do género masculino e heterossexuais, detentores do ensino secundário ou superior, naturais de diversos países e residentes no concelho de Lisboa e Setúbal. Verificou-se ainda, que esta população apresenta bons conhecimentos, uma atitude de baixo risco para adquirir uma IST, uso inconsistente do preservativo e uma prevalência de infecção de 331 casos por cada 1.000 utentes. Concluiu-se, com este estudo, que os conhecimentos tendem a influenciar as atitudes, porém tanto as atitudes, como os conhecimentos não se associam estatisticamente com a prática de prevenção e a prevalência de ISTs. Apesar de em algumas situações, os utentes com menos conhecimentos ou com atitudes de maior risco, apresentarem maior percentagem de infecção. Desta forma, há que manter (no mínimo) o investimento que tem sido feito até ao momento. A criação de outras consultas com a mesma filosofia seria positiva e uma mais-valia para toda a comunidade.

Infecções urinárias adquiridas no hospital : resultados de um estudo de coorte realizado num serviço de medicina interna

RESUMO - Introdução: As infecções associadas aos cuidados de saúde são um importante problema de saúde pública. Entre elas, as infecções urinárias são as mais frequentes associando‐se a elevados custos e morbilidade. Pretende‐se caracterizar as ITU adquiridas no Hospital (ITUaH) ocorridas num serviço de Medicina Interna de um hospital português. Métodos: Efectuou‐se um estudo de coorte (histórica) para determinação da incidência da ITUaH e da bacteriúria assintomática. Analisaram-se os dados correspondentes a uma amostra aleatória sistemática de 388 doentes, representativa dos 3492 admissões ocorridas, em 2014, nesse Serviço. Resultados: A taxa de incidência global de ITUaH foi de 6,2% (24/388; IC 95%:[3,8--‐8,6%]). Ocorreram 19,76 ITU por mil dias de cateter vesical (ITUaCV) e 4,17 ITUaCV por mil dias de internamento. A taxa de incidência de ITUaCV foi de 4% (15/388; IC 95%:[2%--‐6%]). Oitenta por cento destas infecções ocorreram em doentes sem indicação para a algaliação. Um quarto dos doentes desta coorte foram algaliados (24,7%; IC 95%: [20%--‐29%]), não se verificando indicação para o procedimento em 36,5% dos casos. Os principais factores de risco para a algaliação identificados foram a dependência total (OR: 24,47; IC 95%: [5,50--‐ 108,87]; p<0,001) a dependência grave (OR:11,43; IC 95% [2,56--‐50,93]; p=0,001) (escala de Barthel) e a carga de doença (OR: 1,19; IC 95% [1,03--‐1,38]; p=0,017) (índice de comorbilidade de Charlson). Foram utilizados CV em 759 dias dos 3591 dias de internamento quantificados neste estudo (21%). A Taxa de incidência de Bacteriúria Assintomática (BA) foi de 4,4% (IC 95%:[2--‐6%]). Cerca de 60% (10/17) desses doentes foram submetidos a tratamento contrariamente às recomendações clínicas actuais. Conclusões: Este estudo evidencia a necessidade de implementação de estratégias de prevenção, das quais se destaca a redução do número de algaliações. O tratamento da BA deve ser evitado.

Clonagem funcional como metodologia na identificação de marcadores de virulência de Leishmania (Viannia) braziliensis

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia.

Tolerância à vancomicina em Enterococcus faecalis: papel de proteínas hipotéticas

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Interacção Parasita-Hospedeiro e susceptibilidade de Leishmania infantum a fármacos

RESUMO As leishmanioses são doenças causadas por um protozoário intracelular pertencente à ordem Kinetoplastida, da família Trypanosomatidae, do género Leishmania. Os parasitas são transmitidos aos hospedeiros vertebrados por dípteros pertencentes à sub-família Phlebotominae. Devido à inexistência de vacinas a quimioterapêutica continua a representar o único mecanismo de prevenção e controlo. Os fármacos de primeira linha para o tratamento da leishmaniose visceral continuam a ser os antimoniais pentavalentes e a anfotericina B (AMB). A AMB lipossómica está a ser cada vez mais utilizada como 1ª linha. O conhecimento do(s) mecanismo(s) utilizados pelos parasitas, responsáveis pela resistência, é fundamental de modo a permitir o desenvolvimento de novos fármacos anti-Leishmania que possam substituir e/ou complementar os fármacos existentes, de uma forma eficaz assim como contribuir para o desenvolvimento de metodologias para avaliar e monitorizar a resistência. Espera-se do modelo animal a reprodução da infecção na Natureza. Os modelos canino e murino têm ajudado na compreensão dos mecanismos responsáveis pela patogénese e pela resposta imunitária à infecção por Leishmania. Sendo o cão o principal hospedeiro da infecção por L. infantum e o principal reservatório doméstico da leishmaniose visceral humana, procedeu-se à caracterização da evolução da infecção experimental em canídeos de raça Beagle através da análise clínica, hematológica, histopatológica, parasitária, assim com através da resposta imunitária desenvolvida. As alterações hematológicas observadas foram as associadas à leishmaniose visceral: anemia, leucopenia, trombocitopenia com aumento das proteínas totais e da fracção gama-globulina, e diminuição da albumina. Histologicamente observou-se nos órgãos viscerais uma reacção inflamatória crónica, acompanhada por vezes da formação de granulomas ricos em macrófagos. Apesar de todos os animais terem ficado infectados (confirmado pela presença do parasita nos vários tecidos e órgãos recolhidos na necrópsia), os únicos sinais clínicos observados transitoriamente foram adenopatia e alopécia. As técnicas moleculares foram significativamente mais eficazes na detecção do parasita do que os métodos parasitológicos convencionais. As amostras não invasivas (sangue periférico e conjuntiva) mostraram ser significativamente menos eficazes na detecção de leishmanias. No nosso modelo experimental não se observou a supressão da resposta celular ao antigénio parasitário e confirmou-se que, apesar de não protectora, a resposta humoral específica é pronunciada e precoce. A bipolarização da resposta imunitária Th1 ou Th2, amplamente descrita nas infecções experimentais por L. major no modelo murino, não foram observadas neste estudo. O facto dos animais não evidenciarem doença apesar do elevado parasitismo nos órgãos viscerais poderá estar relacionado com a expressão simultânea de citocinas de ambos os tipos Th1 e Treg, no baço, fígado, gânglio, medula óssea e sangue periférico. Neste estudo também se caracterizou o efeito da saliva do vector Phlebotomus perniciosus na infecção experimental de murganhos BALB/c com estirpes de L. infantum selvagem e tratada com AMB, inoculadas por via intradérmica. A visceralização da infecção ocorreu após a utilização da via de administração do inóculo que mais se assemelha ao que ocorre na Natureza. Apesar da disseminação dos parasitas nos animais co-inoculados com extracto de uma glândula salivar ter sido anterior à do grupo inoculado apenas com parasitas, não se detectaram diferenças significativas na carga parasitária, entre os três grupos, ao longo do período de observação pelo que, embora a saliva do vector esteja descrita como responsável pela exacerbação da infecção, tal não foi observado no nosso estudo. O aumento de expressão de citocinas esteve relacionado com o aumento do parasitismo mas, tal como no modelo canino, não se observou bipolarização da resposta imunitária. Os animais dos três grupos infectados parecem ter desenvolvido nos diferentes órgãos uma resposta mista dos tipos Th1 e Th2/Treg. Contudo, verificou-se a predominância da expressão Th1 (TNF-α), no fim do período de observação, o que pode estar relacionado com a resolução da infecção. Por outro lado, a presença de parasitas na pele dos animais inoculados com a estirpe L. infantum tratada com AMB permite colocar a hipótese da existência de parasitas resistentes na Natureza e destes poderem ser transmitidos. Após se ter verificado que a estirpe de L. infantum tratada com AMB tinha a capacidade de infectar e visceralizar no modelo murino, analisou-se o seu comportamento em dois dos principais vectores de L. infantum, Lutzomyia longipalpis e P. perniciosus. Os parasitas tratados com AMB apresentaram uma menor capacidade de permanecerem no interior do vector assim como um desenvolvimento mais lento apontando para uma menor capacidade de transmissão das estirpes resistentes a este fármaco, pelo que o tratamento com AMB poderá ser favorável à prevenção e controlo através da interrupção do ciclo de vida do parasita. De modo a determinar in vitro a susceptibilidade de Leishmania aos diferentes fármacos utilizados na terapêutica da leishmaniose humana e canina (Glucantime®, Fungizone®, miltefosine e alopurinol) comparou-se o sistema de promastigotas axénicos com o sistema amatigota-macrófago. Verificou-se que, para as estirpes estudadas, os resultados de ambos os sistemas não apresentavam diferenças significativas sendo a utilização do primeiro mais vantajosa ao ser menos moroso e de mais fácil execução. Seleccionaram-se estirpes quimio-resistentes in vitro, por exposição prolongada a doses crescentes de AMB, tendo-se verificado que os parasitas tratados, apresentaram uma menor susceptibilidade do que os não tratados à acção dos fármacos estudados, com excepção do alopurinol. A diminuição da susceptibilidade das estirpes aos fármacos utilizados poderá facilitar a dispersão de parasitas multiresistentes. Sendo a apoptose um dos mecanismos utilizados pelos parasitas para evitar a indução de uma resposta imune por acção de compostos anti- Leishmania, determinou-se o número de amastigotas apoptóticos assim como a produção de TNF-α e IL-10 pelos macrófagos tratados. Concluiu-se que os compostos conseguiram suprimir a produção de IL-10, inibidora da activação dos macrófagos, contudo nem a produção da citocina pro-inflamatória TNF- α nem a apoptose pareceram ser os principais mecanismos responsáveis à sobrevivência dos parasitas ao contacto com os fármacos.

Implicações imunobiológicas da infecção a herpesvirus em tumores malignos : pesquisa e análise quantitativa de herpesvirus humanos no astrocitoma pilocítico

RESUMO: As infecções virais podem contribuir para o desenvolvimento do cancro, estando vários tumores malignos associados aos Herpesvirus (HHV). O vírus de Epstein-Barr (EBV) e o Herpesvirus 8, dois Herpesvirus, foram reconhecidos como agentes etiológicos de várias neoplasias. O astrocitoma pilocítico do cerebelo é um dos tumores cerebrais mais frequentes na criança, adolescentes e jovens adultos e a proliferação astrocitária ocorre geralmente após vários tipos de agressão, nomeadamente a infecção viral. Para investigar esta eventual interligação, estudámos 35 astrocitomas pilocíticos, pesquisando a presença dos 8 Herpesvirus. Neste estudo, foram utilizadas 10 amostras de biópsias do cerebelo de doentes que faleceram por doenças não relacionadas com infecção ou patologia tumoral. A maioria dos astrocitomas (33) eram tumores de baixa malignidade. As amostras foram analisadas por PCR (Polymerase Chain Reaction) quantitativa em tempo real (qPCR), com amplificação do gene da DNA polimerase viral. Treze astrocitomas e 7 controles revelaram pequenas quantidades de DNA viral (1-100 cópias/100ng DNA) de todos os Herpesvirus, com excepção do HHV6 A e B que estava ausente nas amostras. O EBV foi identificado em 9 dos 35 astrocitomas (26%) e em 7 dos 10 controles (70%) estando muito mais presente nos controles. As amostras positivas para o EBV foram também analisadas por imunohistoquímica, não tendo sido imunoreactivas para os anticorpos utilizados. A PCR com CODEHOP (consensus-degenerated hybrid oligonucleotide primers) foi utilizada para investigar a presença de um eventual Herpesvirus novo nestas amostras. Não foi identificada nenhuma sequência indicativa de um novo HHV por este método. 24. Em conclusão, os dados apontam para a presença de Herpesvirus, com particular relevância para o EBV, em tecido de cerebelo normal e em tumores cerebrais, embora em níveis demasiado baixos para poderem ser responsabilizados pela indução tumoral. A presença de sequências de DNA de Herpesvirus, nomeadamente do EBV, no Sistema Nervoso Central vem enriquecer a discussão sobre o significado da infecção viral na oncogénese humana, particularmente na neuro-oncogénese. ABSTRACT: Viral infections can contribute to the development of human cancer. Several human malignancies are linked with Human Herpesviruses (HHVs). Epstein-Barr virus and HHV8, two hHerpesvirus, have been recognized as etiologic agents of several neoplasms. Pilocytic astrocytoma of the cerebellum is one of the most common brain tumour in children, adolescents and young adults and astrocytary proliferation generally occurs after several types of injury, namely viral infection. To further explore this association, we have searched the tissue from 35 pilocytic astrocytoma, for all the 8 HHV. In this study, ten brain biopsies (cerebellum) from patients who died of unrelated diseases were used as controls. Most of the astrocytomas (33) were of low grade malignity. Samples were assessed by Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (q PCR) amplification of viral DNA polymerase gene. Thirteen astrocytoma and 7 controls showed low viral DNA levels (1-100 copies/100ng DNA) for all HHVs, with the exception of HHV6 that was absent. EBV was identified in 9 of the 35 astrocytoma (26 %) and in 7 of the 10 controls (70%) being more present in controls. EBV positive samples were also assessed by Immunohistochemistry (IHC) but none showed immunoreactivity for the antibodies used. PCR with consensus-degenerated hybrid oligonucleotide primers (CODEHOP) were also used to look for novel HHVs in these samples and no sequence indicative of a new HHV was detected. 26 Altogether the data indicate the presence of HHVs, with relevance for EBV in normal cerebellum tissue and also in brain tumours but at too low levels to be considered responsible for tumour induction. The presence of HHV DNA sequences, particularly EBV, in the studied brain tumours and control samples, further enriches the discussion about the relevance of viral infection in human oncogenesis, particularly neuro-oncogenesis.RÉSUMÉ: Les infections virales peuvent contribuer au développement du cancer. Les vírus de type Herpès sont associés à plusieurs néoplasies. Il est par exemple établi que les vírus Epstein-Barr et « human Herpesvirus 8 » (HHV-8) sont responsables de plusieurs tumeurs malignes. L´astrocytome pilocitique du cervelet est l’une des tumeurs les plus fréquentes chez les enfants, adolescents et adultes jeunes. En général la prolifération des astrocytes se produit en réponse à une agression. Posant l’hypothèse d’une agression d’origine virale, nous avons recherché la présence des 8 vírus Herpès dans les tissus de 35 astrocytomes. Dans cette étude, 10 échantillons de biopsie de cervelet de patients décédés suite à d’autres pathologies, ont été utilisés comme contrôles. La majorité des astrocytomes étaient de très basse malignité. Les échantillons ont été étudiés par PCR quantitative en temps réel, en amplifiant le gène de l’ADN-polymérase virale. Treize astrocytomes sur 35 (37%) et 7 contrôles sur 10 (70%) ont été trouvés positifs pour tous les HHV sauf l´HHV6, toujours avec un nombre de copies de polymérase virale bas (< 100 copies/100 ng d’ADN). Notamment l’EBV a été identifié 7 fois dans les contrôles (70%) et 9 fois dans les astrocytomes (26%). Les échantillons positifs pour l`EBV ont aussi été étudiés par immuno-histochimie. Aucun signal n’a été observé avec les anticorps utilisés. Enfin, une technique de PCR avec oligonucléotides dégénérés (CODEHOP ou consensus degenerated hybrid oligonucleotide primers) a été utilisée pour rechercher la présence d´un éventuel nouveau vírus Herpès dans les échantillons d’astrocytome. Aucun nouveau vírus n’a été identifié. 28 En résumé, nous avons établi la présence de vírus Herpès, en particulier l´EBV, dans le cervelet normal et dans les tumeurs du cerveau. Les quantités d’ADN viral retrouvées sont faibles et ne permettent pas d’attribuer à ces vírus la responsabilité de l’induction des tumeurs. Cependant, la présence d’ADN de vírus Herpès dans le cerveau sain ou pathologique vient enrichir la discussion sur le signification de l´infection virale dans les processus d´oncogenèse en général, et dans la neuroonco-genèse en particulier.

CONTRIBUIÇÃO PARA O DIAGNÓSTICO MOLECULAR DAS ONICOMICOSES

Resumo Onicomicose ou infecção fúngica das unhas das mãos ou dos pés pode ser provocada por fungos que invadem primariamente a lâmina ungueal saudável. Embora existam outros agentes, como por exemplo bactérias, que podem causar infecções ungueais, as infecções causadas por fungos são mais frequentes e são consideradas uma das principais onicopatias do homem. Os efeitos psicológicos e emocionais que resultam dos aspectos clínicos da onicomicose podem ser marcantes e ter um impacto significativo na qualidade de vida dos portadores. É uma doença com grande potencial crónico associada a uma séria dificuldade terapêutica, sendo estes os principais factores agravantes do seu prognóstico. Conforme a extensão do comprometimento e a porção da unha envolvida na onicomicose, a infecção causada por fungos pode ser classificada em 5 tipos: onicomicose subungueal distal e lateral, onicomicose superficial leitosa, onicomicose subungueal proximal, onicomicose com distrofia total e onicomicose por candidose. São causadas por diferentes agentes etiológicos sendo que os mais comuns são os fungos dermatófitos (80 a 90%), seguidos pelas leveduras (5 a 17%) e fungos filamentosos não dermatófitos (2 a 12%). Neste trabalho foram estudadas 54 amostras recolhidas de unhas de doentes com hipótese clínica de onicomicose, das quais 25,93% (14/54) pertenciam a indivíduos do sexo masculino e 74,07% (40/54) a indivíduos do sexo feminino. As técnicas convencionais de diagnóstico são morosas e muitas vezes de difícil caracterização a nível fenotipico, o que condiciona grandemente a implementação da terapêutica adequada. O presente trabalho teve como principal objectivo a aquisição de conhecimentos que permitissem um correcto diagnóstico micológico das onicomicoses, através do isolamento e identificação das espécies de fungos causadoras de infecção. De uma forma global, consistiu inicialmente no isolamento e posteriormente na identificação dos agentes etiológicos de onicomicoses, utilizando para tal metodologias convencionais e moleculares. Foi realizado o diagnóstico laboratorial baseado no exame directo e na cultura de fragmentos de unhas provenientes de doentes com infecção. Paralelamente, foi extraído o DNA fúngico das mesmas amostras clínicas que, após amplificação da região ITS dos genes ribossómicos foi utilizado para confirmação e comparação dos resultados. Foi igualmente estudada a ocorrência de fungos não dermatófitos responsáveis por onicomicose. Os métodos moleculares de diagnóstico podem não só constituir uma alternativa mais rápida de diagnóstico micológico como também, por serem mais sensíveis, permitir a detecção de espécies que, por serem de crescimento fastidioso, não se desenvolvem em cultura.

CONTRIBUIÇÃO PARA O DIAGNÓSTICO MOLECULAR DAS ONICOMICOSES

Onicomicose ou infecção fúngica das unhas das mãos ou dos pés pode ser provocada por fungos que invadem primariamente a lâmina ungueal saudável. Embora existam outros agentes, como por exemplo bactérias, que podem causar infecções ungueais, as infecções causadas por fungos são mais frequentes e são consideradas uma das principais onicopatias do homem. Os efeitos psicológicos e emocionais que resultam dos aspectos clínicos da onicomicose podem ser marcantes e ter um impacto significativo na qualidade de vida dos portadores. É uma doença com grande potencial crónico associada a uma séria dificuldade terapêutica, sendo estes os principais factores agravantes do seu prognóstico. Conforme a extensão do comprometimento e a porção da unha envolvida na onicomicose, a infecção causada por fungos pode ser classificada em 5 tipos: onicomicose subungueal distal e lateral, onicomicose superficial leitosa, onicomicose subungueal proximal, onicomicose com distrofia total e onicomicose por candidose. São causadas por diferentes agentes etiológicos sendo que os mais comuns são os fungos dermatófitos (80 a 90%), seguidos pelas leveduras (5 a 17%) e fungos filamentosos não dermatófitos (2 a 12%). Neste trabalho foram estudadas 54 amostras recolhidas de unhas de doentes com hipótese clínica de onicomicose, das quais 25,93% (14/54) pertenciam a indivíduos do sexo masculino e 74,07% (40/54) a indivíduos do sexo feminino. As técnicas convencionais de diagnóstico são morosas e muitas vezes de difícil caracterização a nível fenotipico, o que condiciona grandemente a implementação da terapêutica adequada. O presente trabalho teve como principal objectivo a aquisição de conhecimentos que permitissem um correcto diagnóstico micológico das onicomicoses, através do isolamento e identificação das espécies de fungos causadoras de infecção. De uma forma global, consistiu inicialmente no isolamento e posteriormente na identificação dos agentes etiológicos de onicomicoses, utilizando para tal metodologias convencionais e moleculares. Foi realizado o diagnóstico laboratorial baseado no exame directo e na cultura de fragmentos de unhas provenientes de doentes com infecção. Paralelamente, foi extraído o DNA fúngico das mesmas amostras clínicas que, após amplificação da região ITS dos genes ribossómicos foi utilizado para confirmação e comparação dos resultados. Foi igualmente estudada a ocorrência de fungos não dermatófitos responsáveis por onicomicose. Os métodos moleculares de diagnóstico podem não só constituir uma alternativa mais rápida de diagnóstico micológico como também, por serem mais sensíveis, permitir a detecção de espécies que, por serem de crescimento fastidioso, não se desenvolvem em cultura.

Identificação Molecular de Candidoses invasivas no Centro Hospitalar Cova da Beira, E.P.E Métodos Convencionais vs. Métodos Moleculares

As leveduras são fungos oportunistas responsáveis pela maior parte das infecções fúngicas nos seres humanos. Este tipo de infecções é mais comum em indivíduos com o sistema imunitário comprometido e têm vindo a aumentar ao longo dos anos. A espécie Candida albicans é a mais frequentemente identificada, como sendo responsável por este tipo de infecções, no entanto, o número de infecções provocadas por outras espécies do género Candida ocorre cada vez com mais frequência. As infecções hospitalares fúngicas constituem uma causa crescente de morbilidade e mortalidade em hospitais, afectando tanto doentes internados, como profissionais de saúde. Do ponto de vista etiológico, a grande maioria das infecções fúngicas hospitalares é causada por espécies do género Candida, principalmente Candida albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis e C.glabrata. A sua identificação taxonómica, geralmente exige o seu isolamento inicial em meios de cultura, a realização de provas bioquímicas de assimilação in vitro, com a utilização de “kits” comerciais, ou a sua repicagem para meios cromogénios. O principal objectivo deste trabalho foi a identificação rápida e eficaz de candidoses invasivas através de uma metodologia molecular de diagnóstico que fosse simples e fácil de implementar em laboratórios de diagnóstico microbiológico. Para tal, foram seleccionados 100 isolados clínicos de leveduras obtidas a partir de amostras clínicas enviadas para o Laboratório de Patologia Clínica do Centro Hospitalar Cova da Beira E.P.E. para o diagnóstico laboratorial de infecção fúngica durante um período de 8 meses, desde Novembro de 2008 até Junho de 2009. O trabalho baseou-se na identificação molecular por PCR-RFLP de espécies do género Candida, e os resultados foram comparados com os obtidos pelos métodos de diagnóstico tradicionais (CHROMagar® Candida e VITEK® - bioMérieux) utilizados no laboratório hospitalar. Foi ainda efectuado o estudo da sensibilidade in vitro de espécies do género Candida aos antifúngicos fluconazol, voriconazol, através dos métodos, de difusão em disco e E-Test®, segundo os procedimentos padronizados e publicados pelo CLSI, tendo-se verificado elevada sensibilidade dos isolados para ambos os fármacos. Com este trabalho concluiu-se que a eficiente e rápida identificação dos fungos clinicamente relevantes por parte dos laboratórios de patologia clínica deve ser uma tarefa fundamental para o controle das infecções. A identificação ao nível da espécie é importante para determinar a etiologia da infecção, para detectar novos agentes da doença, para prever resistências intrínsecas a agentes antifúngicos e para detectar causas de infecções nosocomiais. Face ao exposto, os estudos epidemiológicos são de extrema importância, assim como o diagnóstico das infecções fúngicas. O diagnóstico das infecções fúngicas continua a ser efectuado por métodos tradicionais, que avaliam características fisiológicas e bioquímicas dos elementos fúngicos, mas que apesar de serem eficazes são, na sua maioria, demoradas impedindo um início rápido e atempado da terapêutica. Como tal, os métodos moleculares podem constituir uma alternativa mais viável ao diagnóstico micológico, nomeadamente de leveduras do género Candida, como se pode comprovar pelos resultados obtidos neste trabalho.