Desenvolvimento de um método de análise quantitativa de concentração celular e PHB por microscopia de fluorescência e análise de imagem

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Bioquímica

Microscopia de varrimento por sonda (SPM)

Gazeta da Física • VOL. 18 • Fascículo 4

Mapas por microscopia de Raman caso de estudo: cerâmicas arqueológicas portuguesas da idade do ferro provenientes do Castro de Azougada

Dissertação de Mestrado em Conservação e Restauro área de Especialização de Cerâmica e Vidro

UMA ABORDAGEM YEAST TWO-HYBRID PARA O ESTUDO DA REPLICAÇÃO E PATOGÉNESE DO VÍRUS DA HEPATITE DELTA

O vírus da hepatite delta (HDV) é o agente etiológico de uma das formas mais graves de hepatite viral e é ainda endémico em diversas regiões do globo, nomeadamente em África, na Amazónia e no Extremo Oriente. O HDV co-infecta ou super-infecta hepatócitos infectados com o vírus da hepatite B (HBV) aumentando em cerca de 10 vezes o risco de cirrose e hepatite fulminante. A associação clínica entre os dois vírus deve-se ao facto do invólucro do HDV ser constituído pelos antigénios de superfície do HBV (HBsAgs) que são necessários para a propagação da infecção. O genoma do HDV é constituído por uma molécula de RNA de cadeia simples, circular, com cerca de 1.7 Kb, que possui cerca de 70% de emparelhamento interno. Foi identificada uma única grelha de leitura aberta (ORF) no RNA viral que codifica para o antigénio delta (HDAg). A ocorrência de um mecanismo de editing do RNA, resulta na expressão de duas formas do HDAg, a pequena (S-HDAg) e a grande (L-HDAg). Várias funções essenciais para a replicação do HDV têm sido atribuídas a ambas as formas do HDAg, sendo a S-HDAg essencial para a acumulação de RNA viral e a L-HDAg responsável pela interacção com os HBsAgs para formar partículas virais. No entanto, dada a simplicidade dos seus componentes, admite-se que a replicação viral depende das interacções estabelecidas entre os HDAgs e factores celulares do hospedeiro. Apesar do número considerável de factores celulares descritos como interactores dos HDAgs ou RNA virais, a importância de muitas destas interacções não foi elucidada e muitas etapas do ciclo de replicação do HDV permanecem pouco claras. Para além disso, dado o número limitado de factores do hospedeiro que estão envolvidos na sua replicação, é muito provável que um número elevado de interactores do HDV permaneça por identificar. Este trabalho teve como objectivo a identificação de proteínas de fígado humano capazes de interagir com os HDAgs, utilizando o sistema yeast Two-Hybrid (YTH). Identificaram-se trinta proteínas com capacidade de interagir com a S-HDAg no sistema YTH, sendo que estas proteínas se encontram envolvidas em diferentes processos celulares. Com base nas características funcionais, foram seleccionadas três destas proteínas e as suas interacções com a S-HDAg foram investigadas com maior detalhe. As três proteínas seleccionadas foram a ribonucleoproteína nuclear heterogénea C (hnRNPC), a embryonic lethal abnormal vision like1 (ELAVL1/HuR) e a proteína 2 de ligação a EBNA1 (EBP2). As duas primeiras são proteínas de ligação a RNA, previamente descritas como envolvidas em processos de replicações de outros vírus com genoma RNA, enquanto a EBP2, é uma proteína de localização preferencialmente nucleolar, tal como por vezes acontece com os HDAgs. As interacções foram analisadas recorrendo a vários ensaios bioquímicos. No caso da hnRNPC e da HuR, após validação no sistema YTH, a capacidade de interacção com a S-HDAg foi confirmada quer in vitro por blot overlay quer in vivo por co-imunoprecipitação em células de hepatoma humano. Nas mesmas células, observou-se uma co-localização considerável entre os HDAgs e os RNAs virais. Finalmente, de modo a investigar a contribuição das proteínas hnRNPC e HuR na replicação do HDV, procedeu-se ao silenciamento destas proteínas pela utilização de short hairpin RNAs (shRNAs) específicos para os mRNAs correspondentes Observou-se que o silenciamento de ambas as proteínas hnRNPC e HuR endógenas, individualmente resultou numa diminuição acentuada nos níveis de expressão dos HDAgs. No que respeita à EBP2, a interacção com a S-HDAg foi confirmada em condições in vitro com recurso a ensaios de blot overlay e de cromatografia de afinidade. A análise por imunofluorescência indirecta e microscopia confocal revelou co-localização elevada entre os HDAgs e a EBP2, principalmente nos nucléolos de células de hepatoma humano. Finalmente, foi ainda utilizado o sistema YTH para estudar os mecanismos de importação dos HDAgs. Assim, este sistema foi utilizado com o propósito de identificar proteínas celulares capazes de interagir com um domínio específico dos HDAgs, o sinal de localização nuclear (NLS). Na pesquisa YTH realizada obtiveram-se 161 clones positivos, sendo que um deles mostrou codificar para a carioferina α4 (KPNA4). A interacção da KPNA4 com a S-HDAg foi reproduzida em condições in vitro através de um ensaio de cromatografia de afinidade tendo sido utilizadas formas recombinantes das duas proteínas. Este trabalho permitiu identificar várias proteínas celulares que interagem com a S-HDAg. Obtiveram-se evidências sugestivas de que algumas das proteínas identificadas podem desempenhar funções importantes no ciclo de replicação do HDV e que abrem novas perspectivas para o estudo do ciclo de replicação do vírus.

Projecto e construção de uma câmara de cultura celular para uso em microscopia óptica

O grupo de Engenharia de Tecidos da FCT/UNL desenvolve membranas biodegradáveis que servem de substrato a culturas celulares e que se destinam a substituir temporariamente tecidos humanos danificados. O objectivo desta dissertação é desenvolver uma câmara que permita manter uma cultura celular em incubação por um período de tempo indefinido e que simultaneamente permita a sua observação através de microscopia óptica. Foi projectada e construída uma câmara de cultura compatível com o microscópio disponível no laboratório do Grupo de Engenharia de Tecidos da FCT/UNL, capaz de manter um ambiente interno adequado às necessidades fisiológicas das células: 37 ºC, CO2 a 5% e entre 90 a 100% de humidade sem interferir com a capacidade de formação de imagens do microscópio. Os testes efectuados permitiram verificar que o sistema desenvolvido é capaz de controlar e monitorizar a temperatura e a percentagem de CO2, proporcionando um ambiente adequado para manter as células em incubação por um período de tempo indefinido e permitindo a sua observação num microscópio óptico invertido.

Tratamentos termomecânicos de ligas do sistema Ni-Ti

As ligas de Níquel‑Titânio (Ni‑Ti) são as mais atractivas entre as ligas com memória de forma devido às suas boas propriedades funcionais juntamente com a elevada resistência e melhor ductilidade. As transformações de fases associadas ao efeito de memória de forma (EMF) podem ser em uma etapa, B19’ (martensite) ↔ B2 (austenite), em duas ou em múltiplas etapas, incluindo a fase‑R intermédia dependendo da história térmica e termomecânica da liga. As temperaturas de transformação são geralmente observadas acima da temperatura ambiente para as ligas ricas em Ti, enquanto nas ricas em Ni se situam abaixo da temperatura ambiente. O objectivo da presente dissertação foi o de investigar as modificações nas propriedades funcionais e estruturais em uma liga de Ni‑Ti rica em Ti (49,0%at.Ni‑51,0%at.Ti) sujeita a diferentes tratamentos térmicos e termomecânicos de marforming e ausforming. Para melhor entender os fenómenos presentes nesta liga foi feito um paralelismo com outras duas ligas de Ni‑Ti: (i) equiatómica com EMF acima da temperatura ambiente e (ii) rica em Ni superelástica (SE) à temperatura ambiente. Com o intuito de uma análise completa das transformações de fases foram utilizadas durante ciclos térmicos diversas técnicas de caracterização: Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC), Resistividade Eléctrica (RE), Dilatometria (DT) e Difracção de Raios‑X (DRX) convencional e por radiação sincrotrão – rotina e textura. Foram também utilizadas outras técnicas à temperatura ambiente com o intuito de observar características microestruturais (Microscopia Óptica (MO) e Electrónica de Varrimento (SEM)) e mecânicas (Microdureza e Ultra‑Microdureza Vickers, e Tracção). A liga de Ni‑Ti rica em Ti tem as suas transformações directa e inversa fortemente afectadas pelos tratamentos termomecânicos, devido à formação de fase‑R durante a transformação directa em duas (B2®R®B19’) ou em múltiplas etapas (B2®R, B2®B19’ e R®B19’). Os tratamentos termomecânicos conducentes à sequência de transformação B2®R®B19’ decrescem a temperatura de fim da formação de B19’ para próximo da temperatura ambiente e apresentam maior estabilidade nas temperaturas e histereses de transformação.

Estudo da eficiência da ETAR da zona industrial da AutoEuropa por análise biológica

No tratamento de águas residuais por lamas activadas, existem diferentes populações de protozoários e metazoários que se podem desenvolver durante o processo. A sua presença é fundamental para o bom desempenho da ETAR. Além de reduzirem a turvação do efluente final, estimulam o crescimento bacteriano, promovem a floculação e algumas espécies reduzem a poluição. É possível estabelecer uma estreita relação entre a predominância de determinadas espécies ou grupos de espécies, com parâmetros operacionais da ETAR, tais como os índices bióticos. Este procedimento requer a identificação e enumeração das diferentes espécies. No entanto, existem outros métodos, que apresentam relações entre a abundância de uma dada espécie ou grupo e os parâmetros da estação. O presente trabalho tem como objectivos: avaliar o funcionamento do sistema de tratamento de lamas activadas através da observação microscópica de protozoários e metazoários, identificação e contagem das espécies relevantes; estabelecer relações entre os organismos que contribuem para o processo de depuração de águas residuais e as condições de operação, como parâmetros físicoquímicos ou o desempenho da ETAR; e produzir uma ferramenta de apoio à gestão da ETAR, baseada em princípios biológicos. Pretende-se, ainda, contribuir e incentivar para a adopção de metodologias semelhantes em outros sistemas de lamas activadas em funcionamento no nosso País. Em termos metodológicos, a colheita de amostras foi realizada semanalmente na ETAR da ZIA durante dois meses e meio. Os parâmetros operacionais e físico-químicos foram obtidos junto da ETAR. A análise biológica foi efectuada por microscopia óptica. Avaliou-se qualitativa e quantitativamente a microfauna presente no tanque de arejamento, no poço de mistura de lamas e no clarificado de ambos os decantadores, a fim de se verificar as possíveis correlações desses parâmetros com a eficiência do sistema. Aplicou-se os resultados biológicos obtidos, em quatro modelos propostos para a avaliação do processo de tratamento, baseada em análises biológicas. Em termos qualitativos e na maior parte das observações, a lama apresentou boa qualidade. A ETAR da ZIA foi colonizada por tecamebas, principalmente Arcella sp. e Euglypha alveolata, em todo, o estudo e em todos os pontos analisados. No tanque de arejamento foram sempre observados ciliados nadadores livres. A densidade total de organismos no tanque de arejamento variou de 2982 e 7330 organismos/mL, com valor médio de 5995 organismos/mL. Relativamente, aos parâmetros estudados, os objectivos de remoção para o CBO5, CQO, SST e SSV foram alcançados.

Caracterização da resistência à antracnose dos frutos verdes do cafeeiro

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Biologia, especialidade Biologia Vegetal,pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Avaliação da compatibilidade de argamassas de cal aérea para reparações superficiais em “Brecha da Arrábida”

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Conservação e Restauro. Área de especialização: pedra

Modelação térmica e de tensões residuais de soldadura de metais duros

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Mecânica

Interacção de proteínas com superfícies nanoestruturadas e nanopartículas de metais nobres

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Química Inorgânica pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

A cor dos tapetes : análise de materiais de tapetes persas dos séculos XVI e XVII

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Conservação e Restauro

Um segredo bem guardado: Leques mandarim – caracterização material e conservação

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Conservação e Restauro

A cor na pintura balinesa: caracterização dos pigmentos da pintura balinesa

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Conservação e Restauro

Conservação de negativos em triacetato de celulose

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Conservação e Restauro (Área de Fotografia)