Infecção por Treponema pallidum: análise serológica e pesquisa de DNA

RESUMO: A sífilis é uma infecção causada por T. pallidum que pode ser transmitida por via vertical, por contacto sexual ou por sangue, e cujo diagnóstico se baseia na associação entre manifestações clinicas e testes serológicos. Neste estudo utilizaram-se os testes serológicos RPR, TPHA, FTA-Abs, um teste rápido não comercializado (Signal-Spirolipin) que pesquisa anticorpos treponémicos (CDC-T) e não treponémicos (CDC-2) em simultâneo no mesmo dispositivo e uma técnica de PCR-multiplex para a pesquisa de ADN de T. pallidum. Da comparação das técnicas serológicas constatou-se que a sensibilidade dos testes RPR e TPHA foi de 84,5% e 98% respectivamente. A especificidade foi de 77,3% para o teste RPR e de 87,5% para o teste TPHA. Na avaliação do teste rápido a comparação do teste CDC-2 com o teste RPR resultou numa taxa de concordância de 93,1% enquanto que, a do teste CDC-T com o teste TPHA foi de 94,8%. A sensibilidade e especificidade obtidas pelos testes CDC-2 e CDC-T foram de 88,7% e 65% e de 94,9% e 91,3% respectivamente. Considerando o diagnóstico de sífilis activa com base na reactividade simultânea dos testes RPR e TPHA, avaliou-se a sensibilidade do teste rápido utilizando esse mesmo critério. A sensibilidade obtida foi de 98,4% para o teste rápido e de 97,2% para a associação dos testes RPR/TPHA. A técnica de PCR-multiplex apresentou fraca sensibilidade já que em apenas 33% dos casos de sífilis foi identificado ADN de T. pallidum. O teste rápido avaliado apresentou um comportamento idêntico aos testes geralmente utilizados na rotina laboratorial tais como os utilizados neste estudo. Apresenta a vantagem de pesquisar anticorpos treponémicos e não treponémicos, ao contrário dos testes rápidos comercializados que pesquisam apenas anticorpos treponémicos. Não sendo necessário para a sua execução equipamento laboratorial especializado poderá ser de grande utilidade para o clinico a exercer em locais sem laboratório.------------- ABSTRACT: Syphilis is an infection caused by T. pallidum. Transmission may be vertical, through sexual contact or blood. The diagnosis is based in both serology and clinical manifestations. In this study, we used the serological tests RPR, TPHA, FTA-Abs and a non -commercialized rapid test (Signal-Spirolipin) to detect both treponemal (CDC-T) and non – treponemal antibodies (CDC-2) in the same device. T. pallidum DNA was identified with a multiplex PCR technique. In this study, the RPR and TPHA tests sensitivity was 84,5% and 98%, respectively, and the specificity 77,3% for the RPR test and 87,5% for TPHA test, respectively. The concordance rate was 93,1% in the comparison between the RPR and the CDC2 tests and 94,8% between the CDC-T with the TPHA tests. Sensitivity and specificity of the CDC-2 and CDC-T tests were 88,7% and 65% and 94,9% e 91,3%, respectively. Taking into account that the diagnosis of active syphilis is made when both the RPR and TPHA tests are reactive, we evaluated the sensitivity of the rapid test (CDC2 and CDCT) in the diagnosis of active syphilis, using the above described criteria. The sensitivity was 98,4 % for the rapid test and 97,2 % for the association of reactivity in both RPA and TPHA tests. The multiplex PCR technique presented a low sensitivity, with T. pallidum DNA being identified in only 33% of the syphilis cases. The rapid test evaluated in this study presented identical results to the tests generally used in the routine laboratory diagnosis, such as those used here. However, it does have the advantage of detecting both treponemal and non – treponemal antibodies what is not the case of the commercialized rapid test. Furthermore, there is no need of specialized laboratory equipment, which makes it of great utility in regions where such conditions do not exist, as in developing countries.

Microbiologia preditiva aplicada à análise de amostras de carne de vaca e porco

A microbiologia preditiva é a conjugação de conhecimentos provenientes de disciplinas como a matemática, estatística e os sistemas de informação e tecnologia que pretende providenciar modelos preditivos que prevejam o comportamento microbiano em ambientes alimentares, de forma a poder prevenir a deterioração dos géneros alimentares bem como as doenças de origem alimentar. Os modelos preditivos primários, secundários e terciários são aplicados no intuito de melhorar a qualidade e segurança alimentar e particularmente os terciários, podem ser utilizados como ferramentas auxiliadoras na área de HACCP; é necessário ter em conta que estes modelos são uma representação muito simplificada da realidade, que possuem limitações devido á complexidade do comportamento microbiano e dos ambientes alimentares, podendo por isto estimar previsões que se desviem das situações reais. O presente trabalho tem como principal objectivo averiguar a aplicabilidade da microbiologia preditiva, particularmente, dos modelos terciários ou softwares preditivos, na análise de amostras de carne de vaca e porco armazenadas a 5ºC e 10ºC, comparando os resultados obtidos através da análise microbiológica clássica, realizada no laboratório de microbiologia da empresa SGS, com os resultados obtidos das previsões provenientes de dois softwares preditivos, nomeadamente, ComBase Predictor e PMP (Pathogen Modeling Program). Para tal, foram realizadas análises microbiológicas, por forma a realizar contagens de E.coli, S.aureus, L.monocytogenes e pesquisa de Salmonella e análises químicas para analisar o pH, aw e NaCl de 20 amostras de carne de vaca e 20 amostras de carne de porco Adicionalmente foram efetuadas contagens de microrganismos totais a 30ºC. Os resultados demonstraram que a ferramenta preditiva ComBase conseguiu efectuar melhores previsões para o crescimento de E. coli, S. aureus e L. monocytogenes em amostras de carne de vaca e de porco do que a ferramenta preditiva PMP. Contudo, mesmo sendo melhor, as previsões efectuadas pelo programa apresentaram desvios em relação às contagens reais que muito provavelmente se relacionam com a existência da flora de decomposição. Os resultados estimados pela ferramenta PMP foram sempre muito mais elevados do que os resultados obtidos na análise microbiológica laboratorial, o que demonstrou a sua não aplicabilidade a este tipo de amostras.

Formação e transdisciplinaridade: uma pesquisa sobre as emergências formativas do CETRANS

Dissertação de mestrado em Ciências da Educação, na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa e do Diplôme d' Université François Rabelais de Tours

Ocorrência e diversidade de leveduras no filoplano de plantas seleccionadas do Parque Natural da Serra da Arrábida

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Biologia (especialidade Microbiologia), pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Leveduras isoladas de produtos frutícolas: Capacidade fermentativa e estudos sobre a H+-ATPase da membrana plasmática

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Biologia(especialidade Microbiologia), pela Universidade Nova de Lisboa,Faculdade de Ciências e Tecnologia

Pesquisa de imagens de rosto

Dissertação de Mestrado em Engenharia Informática

Pesquisa segura de dados em redes de sensores

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Informática

Implicações imunobiológicas da infecção a herpesvirus em tumores malignos : pesquisa e análise quantitativa de herpesvirus humanos no astrocitoma pilocítico

RESUMO: As infecções virais podem contribuir para o desenvolvimento do cancro, estando vários tumores malignos associados aos Herpesvirus (HHV). O vírus de Epstein-Barr (EBV) e o Herpesvirus 8, dois Herpesvirus, foram reconhecidos como agentes etiológicos de várias neoplasias. O astrocitoma pilocítico do cerebelo é um dos tumores cerebrais mais frequentes na criança, adolescentes e jovens adultos e a proliferação astrocitária ocorre geralmente após vários tipos de agressão, nomeadamente a infecção viral. Para investigar esta eventual interligação, estudámos 35 astrocitomas pilocíticos, pesquisando a presença dos 8 Herpesvirus. Neste estudo, foram utilizadas 10 amostras de biópsias do cerebelo de doentes que faleceram por doenças não relacionadas com infecção ou patologia tumoral. A maioria dos astrocitomas (33) eram tumores de baixa malignidade. As amostras foram analisadas por PCR (Polymerase Chain Reaction) quantitativa em tempo real (qPCR), com amplificação do gene da DNA polimerase viral. Treze astrocitomas e 7 controles revelaram pequenas quantidades de DNA viral (1-100 cópias/100ng DNA) de todos os Herpesvirus, com excepção do HHV6 A e B que estava ausente nas amostras. O EBV foi identificado em 9 dos 35 astrocitomas (26%) e em 7 dos 10 controles (70%) estando muito mais presente nos controles. As amostras positivas para o EBV foram também analisadas por imunohistoquímica, não tendo sido imunoreactivas para os anticorpos utilizados. A PCR com CODEHOP (consensus-degenerated hybrid oligonucleotide primers) foi utilizada para investigar a presença de um eventual Herpesvirus novo nestas amostras. Não foi identificada nenhuma sequência indicativa de um novo HHV por este método. 24. Em conclusão, os dados apontam para a presença de Herpesvirus, com particular relevância para o EBV, em tecido de cerebelo normal e em tumores cerebrais, embora em níveis demasiado baixos para poderem ser responsabilizados pela indução tumoral. A presença de sequências de DNA de Herpesvirus, nomeadamente do EBV, no Sistema Nervoso Central vem enriquecer a discussão sobre o significado da infecção viral na oncogénese humana, particularmente na neuro-oncogénese. ABSTRACT: Viral infections can contribute to the development of human cancer. Several human malignancies are linked with Human Herpesviruses (HHVs). Epstein-Barr virus and HHV8, two hHerpesvirus, have been recognized as etiologic agents of several neoplasms. Pilocytic astrocytoma of the cerebellum is one of the most common brain tumour in children, adolescents and young adults and astrocytary proliferation generally occurs after several types of injury, namely viral infection. To further explore this association, we have searched the tissue from 35 pilocytic astrocytoma, for all the 8 HHV. In this study, ten brain biopsies (cerebellum) from patients who died of unrelated diseases were used as controls. Most of the astrocytomas (33) were of low grade malignity. Samples were assessed by Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (q PCR) amplification of viral DNA polymerase gene. Thirteen astrocytoma and 7 controls showed low viral DNA levels (1-100 copies/100ng DNA) for all HHVs, with the exception of HHV6 that was absent. EBV was identified in 9 of the 35 astrocytoma (26 %) and in 7 of the 10 controls (70%) being more present in controls. EBV positive samples were also assessed by Immunohistochemistry (IHC) but none showed immunoreactivity for the antibodies used. PCR with consensus-degenerated hybrid oligonucleotide primers (CODEHOP) were also used to look for novel HHVs in these samples and no sequence indicative of a new HHV was detected. 26 Altogether the data indicate the presence of HHVs, with relevance for EBV in normal cerebellum tissue and also in brain tumours but at too low levels to be considered responsible for tumour induction. The presence of HHV DNA sequences, particularly EBV, in the studied brain tumours and control samples, further enriches the discussion about the relevance of viral infection in human oncogenesis, particularly neuro-oncogenesis.RÉSUMÉ: Les infections virales peuvent contribuer au développement du cancer. Les vírus de type Herpès sont associés à plusieurs néoplasies. Il est par exemple établi que les vírus Epstein-Barr et « human Herpesvirus 8 » (HHV-8) sont responsables de plusieurs tumeurs malignes. L´astrocytome pilocitique du cervelet est l’une des tumeurs les plus fréquentes chez les enfants, adolescents et adultes jeunes. En général la prolifération des astrocytes se produit en réponse à une agression. Posant l’hypothèse d’une agression d’origine virale, nous avons recherché la présence des 8 vírus Herpès dans les tissus de 35 astrocytomes. Dans cette étude, 10 échantillons de biopsie de cervelet de patients décédés suite à d’autres pathologies, ont été utilisés comme contrôles. La majorité des astrocytomes étaient de très basse malignité. Les échantillons ont été étudiés par PCR quantitative en temps réel, en amplifiant le gène de l’ADN-polymérase virale. Treize astrocytomes sur 35 (37%) et 7 contrôles sur 10 (70%) ont été trouvés positifs pour tous les HHV sauf l´HHV6, toujours avec un nombre de copies de polymérase virale bas (< 100 copies/100 ng d’ADN). Notamment l’EBV a été identifié 7 fois dans les contrôles (70%) et 9 fois dans les astrocytomes (26%). Les échantillons positifs pour l`EBV ont aussi été étudiés par immuno-histochimie. Aucun signal n’a été observé avec les anticorps utilisés. Enfin, une technique de PCR avec oligonucléotides dégénérés (CODEHOP ou consensus degenerated hybrid oligonucleotide primers) a été utilisée pour rechercher la présence d´un éventuel nouveau vírus Herpès dans les échantillons d’astrocytome. Aucun nouveau vírus n’a été identifié. 28 En résumé, nous avons établi la présence de vírus Herpès, en particulier l´EBV, dans le cervelet normal et dans les tumeurs du cerveau. Les quantités d’ADN viral retrouvées sont faibles et ne permettent pas d’attribuer à ces vírus la responsabilité de l’induction des tumeurs. Cependant, la présence d’ADN de vírus Herpès dans le cerveau sain ou pathologique vient enrichir la discussion sur le signification de l´infection virale dans les processus d´oncogenèse en général, et dans la neuroonco-genèse en particulier.

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Contribuição da microbiologia preditiva na análise de cremes de pasteleiro

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Resolução de horários de exames com pesquisa local restringida

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Sífilis congénita : caracterização da infecção e avaliação de técnicas laboratoriais para o seu diagnóstico

RESUMO: Um dos maiores problemas da sífilis é a infecção intra-uterina do feto, que pode resultar em morte fetal com aborto espontâneo. Os objectivos desta tese foram comparar os cinco testes serológicos para o diagnóstico de sífilis congénita e optimizar e aplicar a várias amostras clínicas, colhidas de indivíduos com suspeita de infecção por Treponema pallidum, uma técnica de PCR-Multiplex e uma técnica de PCR em tempo real. Na globalidade dos soros estudados obtiveram-se os seguintes resultados: o RPR reactivo em 87/517; TPHA reactivo em 135/517; e EIA reactivo em 127/517. A pesquisa de anticorpos específicos de tipo IgM foi efectuada em 33 soros sendo estudada pelas técnicas de imunofluorescência indirecta e de westernblot. Quanto aos resultados obtidos pelas duas técnicas, o teste FTA-Abs-IgM demonstrou reactividade em 3/33, enquanto que a técnica de westernblot-M, apresentou reactividade em 18/33. Para a avaliação de uma técnica de PCR-TR, foram estudadas 318 amostras de 236 indivíduos classificados, com base em critérios clínicos e laboratoriais, em diferentes estádios de infecção por Treponema pallidum e em indivíduos sem infecção por aquele microrganismo. Relativamente a estas técnicas foi possível observar amplificação de ADN de Treponema pallidum em 133/318 pela técnica de PCR-TR e 90/318 pela técnica de PCR-Multiplex. Mediante os resultados obtidos e de outros estudos efectuados parece poder concluir-se que o teste EIA é o mais indicado para o rastreio da infecção por Treponema pallidum, devendo um resultado reactivo por esta técnica, ser confirmado com a realização de um teste não treponémico (RPR). Relativamente ao diagnóstico de infecção congénita, o teste westernblot para pesquisa de anticorpos específicos de tipo IgM, parece ser o mais apropriado. A técnica PCR-TR, parece ser a mais indicada, pois apresenta uma maior sensibilidade e especificidade que a PCR-Multiplex.----------------- ABSTRACT:The syphilis major problem is the intrauterine infection of the fetus, which may result in fetal death with spontaneous abortion. The objectives of this thesis were to compare the five serological tests for the diagnosis of congenital syphilis and optimize and apply several clinical samples taken from individuals suspected of infection with Treponema pallidum, a PCR-Multiplex and real-time PCR. In all sera studied were obtained the following results: the RPR reactive in 87/517; reactive TPHA in 135/517, and 127/517 in reactive EIA. The search for specific IgM antibodies was performed on 33 sera that were studied by indirect immunofluorescence and westernblot. The results obtained by both techniques, the test FTA-Abs-IgM showed reactivity in 3/33, while the technique westernblot-M, showed reactivity in 18/33. For an RT-PCR evaluation, we studied 318 samples from 236 individuals classified based on clinical and laboratory criteria at different stages of infection by Treponema pallidum and in individuals without infection by that organism. For these techniques it was possible to observe ADN amplification of Treponema pallidum in 133/318 by RT-PCR and 90/318 by PCR-Multiplex. Based on obtained results and in other studies seems that we can conclude that the EIA test is the most suitable for Treponema pallidum screening infection, and a reactive result by this technique, should be confirmed with the realization of a non-treponemal test (RPR). For the congenital infection diagnosis, testing for antibodies westernblot specific IgM appears to be the most appropriate. The RT-PCR seems to be the most suitable, since it has a higher sensitivity and specificity than the PCR-Multiplex.

Diversidade genética e resistência natural ao Maraviroc em estirpes do vírus da imunodeficiência humana Tipo 1 (HIV-1) em circulação em utilizadores de drogas por via endovenosa na Grande Lisboa

RESUMO: O maraviroc (MVC) é o único anti-retroviral antagonista do co-receptor CCR5 licenciado e interage com as ansas transmembranares de CCR5, induzindo uma alteração da sua conformação e impedindo a interacção com gp120. O MVC é activo apenas contra estirpes R5 de HIV-1, sendo utilizado em terapia de recurso. Neste trabalho, foi estudada a diversidade genética da região C2V3C3 do gene env de estirpes de HIV-1 de oxicodependentes por via endovenosa da Grande Lisboa, pesquisando-se também a presença de polimorfismos genéticos naturais. Foram utilizadas 52 amostras de plasma e para 35 destas foi amplificado por RT-nested PCR um produto de 565 pb. A análise filogenética revelou a seguinte distribuição de genótipos: 23 B (incluindo, provavelmente, 2 CRF14_BG), 8 A, 3 G e 1 F1. Após tradução, e por comparação com a sequência consenso B, verificou-se uma elevada frequência de polimorfismos genéticos, sendo encontradas algumas “assinaturas de aminoácidos” relativas aos subtipos não-B. Realizou-se ainda uma pesquisa de locais de N-glicosilação e a previsão da utilização de co-receptores (abordagem genotípica), com recurso às regras 11/25 e da carga líquida da ansa V3 e aos programas PSSM e geno2pheno[coreceptor]. Observou-se uma conservação genérica do número de locais de N-glicosilação e foram identificadas 5 sequências com tropismo X4 ou duplo. Por fim, com base na literatura, realizou-se uma pesquisa de polimorfismos genéticos associados a resistência ao MVC presentes na ansa V3. Foi observado um número elevado destas mutações. A presença dos padrões 11S+26V e 20F+25D+26V, num total de 3 sequências, é relevante, visto estes estarem inequivocamente associados à resistência in vivo ao MVC. Apesar de não estar ainda definido um perfil de resistência para o MVC, a presença das mutações encontradas, em indivíduos sem contacto prévio com o fármaco, trará implicações relevantes na sua gestão clínica, considerando a introdução do MVC na terapia de recurso.---------- ABSTRACT: Maraviroc (MVC) is the only CCR5 inhibitor licensed today. This drug interacts with the transmembrane helices of CCR5 co-receptor, inducing a conformation change of its extracellular loops and preventing the interaction with gp120. MVC is only active against R5 strains of HIV-1 and is currently used in salvage therapy. The genetic diversity of the env C2V3C3 region of HIV-1 strains from injecting drug users in the Greater Lisbon was studied, along with the presence of natural genetic polymorphisms. 52 plasma samples were used and the amplification by RT-nested PCR of a 565 bp-product was possible in 35 of them. The phylogenetic analysis revealed 23 sequences classified as subtype B (probably including 2 CRF14_BG), 8 A, 3 G and 1 F1. After translation, the presence of natural genetic polymorphisms was studied by comparison to a subtype B consensus. A high frequency of genetic polymorphisms was observed and significant “amino acid signatures” were found in association with non-B subtypes. A full characterization of the N-glycosylation sites was also performed and a coreceptor prediction (genotypic approach) was accomplished using the 11/25 and the V3 net charge rules and the programs PSSM and geno2pheno[coreceptor]. The number of N-glycosylation sites was generically preserved. Five sequences were defined as X4 or dual-tropic. Based on published data, a search for genetic polymorphisms, present in V3loop, associated to MVC resistance was finally undertaken. Several of such mutations were observed, being particularly interesting the presence of the patterns 11S+26V and 20F+25D+26V, in a total of 3 sequences, since these patterns have unequivocally been associated with MVC resistance in vivo. Although a resistance profile for MVC is not yet defined, the presence of these mutations in MVC-naïve populations may have significant impact in their clinical management in the future, especially considering the introduction of this drug in salvage therapy.