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Resumo:
RESUMO: O processo de glicosilao a modificao ps-traducional de protenas mais comum e est envolvido em vrios processos fisiolgicos e patolgicos. Especificamente, certos perfis glicosdeos esto correlacionados a estados especficos de diferenciao celular, e podem modular vrios eventos celulares, como sinalizao celular, migrao celular e interaes hospedeiro-patognio. Assim sendo, a glicosilao desempenha um papel crucial na modulao de vrios processos imunolgicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosdicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosdicas terminais que esto modificadas pela ligao de cido silico desempenham um papel importante em vrias funes do sistema imune, nomeadamente migrao leucocitria em contexto de inflamao e ativao de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expresso de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho est dividido em trs componentes principais: 1) A imunidade est amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligao de leuccitos Eselectina endotelial o primeiro passo. Assim, ns analismos a estrutura e funo dos ligandos de E-selectina que so expressos pelas células humanas mononucleares de sangue perifrico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreenso dos intervenientes moleculares que mediam a ligao dos moncitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotlio vascular. Surpreendentemente, os moncitos apresentaram maior capacidade de ligao E-selectina comparativamente aos linfcitos. Esta observao pode ser explicada pelo facto de os moncitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportrio de glicoprotenas que exibem afinidade de ligao E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adio j previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populaes linfocitrias apresentam de se ligar E-selectina, est integralmente relacionada com a sua expresso de glicoprotenas com afinidade de ligao E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligao E-selectina. Esta atividade de ligao E-selectina das células CD4+T conferida pela expresso de HCELL, em adio s j previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T no expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B no expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilao da superfcie destas células, levou ao dramtico aumento da expresso dos ligandos de E-selectina em todos as populaes leucocitrias, verificando-se que a criao de certos ligandos de E-selectina est dependente do tipo de clula, aps fucosilao. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o trfico das células mononucleares de sangue perifrico em contexto de inflamao. 2) A habilidade das células dendrticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamao crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analismos a estrutura e funo das molculas de adeso que mediam a migrao transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciao de moncitos (mo-DCS), obtidos quer pelo mtodos de separao imuno-magntica de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderncia ao plstico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligao Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 so expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. importante notar que a ligao do CD44 nas mo-DCs, mas no nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativao e consequente adeso da VLA-4 ao endotlio na ausncia de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se tambm anlise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de moncitos do sangue do cordo umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs no expressam qualquer glicoprotena com reatividade E-selectina. Alm disso, a exofucosilao das mo- DCs humanas utilizando uma (1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expresso de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem E-selectina em condies de fluxo hemodinmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratgias para potenciar a expresso de HCELL podero impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamao. 3) Outro obstculo para alcanar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs o estabelecimento de abordagens eficientes que podero melhorar o estado de maturao e apresentao antignica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstculo. Atravs da remoo de cido silico de superfcie celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturao de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferao de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte especfica de células tumorais. Em adio, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentao cruzada de antignios tumorais s células T citotxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma viso chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitrias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase uma nova tecnologia para melhorar a eficcia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilao e a sua manipulao podem modular a imunidade. Concretamente, atravs de uma reao de exofucosilao conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leuccitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoo dos nveis de cido silico da superfcie celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotxicas. ------------------------------------ ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an (1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites. 3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.
Resumo:
RESUMO:O processo de glicosilao a modificao ps-traducional de protenas mais comum e est envolvido em vrios processos fisiolgicos e patolgicos. Especificamente, certos perfis glicosdeos esto correlacionados a estados especficos de diferenciao celular, e podem modular vrios eventos celulares, como sinalizao celular, migrao celular e interaes hospedeiro-patognio. Assim sendo, a glicosilao desempenha um papel crucial na modulao de vrios processos imunolgicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosdicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosdicas terminais que esto modificadas pela ligao de cido silico desempenham um papel importante em vrias funes do sistema imune, nomeadamente migrao leucocitria em contexto de inflamao e ativao de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expresso de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho est dividido em trs componentes principais: 1) A imunidade est amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligao de leuccitos Eselectina endotelial o primeiro passo. Assim, ns analismos a estrutura e funo dos ligandos de E-selectina que so expressos pelas células humanas mononucleares de sangue perifrico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreenso dos intervenientes moleculares que mediam a ligao dos moncitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotlio vascular. Surpreendentemente, os moncitos apresentaram maior capacidade de ligao E-selectina comparativamente aos linfcitos. Esta observao pode ser explicada pelo facto de os moncitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportrio de glicoprotenas que exibem afinidade de ligao E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adio j previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populaes linfocitrias apresentam de se ligar E-selectina, est integralmente relacionada com a sua expresso de glicoprotenas com afinidade de ligao E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligao E-selectina. Esta atividade de ligao E-selectina das células CD4+T conferida pela expresso de HCELL, em adio s j previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T no expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B no expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilao da superfcie destas células, levou ao dramtico aumento da expresso dos ligandos de E-selectina em todos as populaes leucocitrias, verificando-se que a criao de certos ligandos de E-selectina est dependente do tipo de clula, aps fucosilao. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o trfico das células mononucleares de sangue perifrico em contexto de inflamao. 2) A habilidade das células dendrticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamao crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analismos a estrutura e funo das molculas de adeso que mediam a migrao transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciao de moncitos (mo-DCS), obtidos quer pelo mtodos de separao imuno-magntica de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderncia ao plstico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligao Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 so expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. importante notar que a ligao do CD44 nas mo-DCs, mas no nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativao e consequente adeso da VLA-4 ao endotlio na ausncia de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se tambm anlise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de moncitos do sangue do cordo umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs no expressam qualquer glicoprotena com reatividade E-selectina. Alm disso, a exofucosilao das mo- DCs humanas utilizando uma (1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expresso de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem E-selectina em condies de fluxo hemodinmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratgias para potenciar a expresso de HCELL podero impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamao. 3) Outro obstculo para alcanar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs o estabelecimento de abordagens eficientes que podero melhorar o estado de maturao e apresentao antignica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstculo. Atravs da remoo de cido silico de superfcie celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturao de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferao de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte especfica de células tumorais. Em adio, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentao cruzada de antignios tumorais s células T citotxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma viso chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitrias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase uma nova tecnologia para melhorar a eficcia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilao e a sua manipulao podem modular a imunidade. Concretamente, atravs de uma reao de exofucosilao conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leuccitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoo dos nveis de cido silico da superfcie celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotxicas. ---------------------------- ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an (1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites.3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.
Resumo:
Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obteno do grau de Mestre em Engenharia dos Materiais
Resumo:
Dissertao apresentada para a obteno do Grau de Mestre em Gentica Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Cincias e Tecnologia
Resumo:
Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obteno do Grau de Mestre em Biotecnologia
Resumo:
Dissertao apresentada para cumprimento dos requisitos necessrios obteno do grau de Mestre em Terminologia e Gesto da Informao de Especialidade.
Resumo:
O objectivo principal dos estudos descritos nesta dissertao foi descrever a anatomia cirrgica da regio olfactiva, determinar a rea de distribuio da mucosa olfactiva nas fossas nasais e estudar as células estaminais nela presentes para fundamentar e desenvolver uma tcnica cirrgica destinada sua colheita por via transnasal endoscpica. O objectivo secundrio foi avaliar a exequibilidade, segurana e eficcia da utilizao da mucosa olfactiva na reparao das leses traumticas crnicas e severas da medula espinal. As investigaes incluram a disseco endoscpica e estudos morfomtricos da regio olfactiva de cadveres recentes, o exame histolgico de especmenes de um banco de peas anatmicas da regio olfactiva e a cultura de células estaminais olfactivas obtidas a partir de amostras de indivduos sem patologia naso-sinusal. Realizaram-se ainda estudos clnicos experimentais nos quais se transplantou a mucosa olfactiva colhida das fossas nasais na medula espinal de doentes com leses traumticas da medula espinal. Os estudos foram realizados num hospital de nvel tercirio com afiliao universitria, o Hospital de Egas Moniz do Centro Hospitalar de Lisboa Ocidental: em servios clnicos (Servio de Otorrinolaringologia) ou em unidades vocacionadas para a investigao (Unidade de Microcirurgia, Unidade de Neuropatologia). Parte dos estudos foram ainda realizados em locais externos instituio, como o Servio de Patologia Forense da Delegao de Lisboa do Instituto de Medicina Legal e a ECBio, I&D em Biotecnologia, S.A. Demonstrou-se que a regio olfactiva pode ser abordada sistematicamente por tcnica endoscpica. Demonstrou-se a rea de distribuio da mucosa olfactiva nas fossas nasais e concebeu-se uma tcnica para sua a colheita. Isolaram-se e quantificaram-se as células estaminais da mucosa olfactiva e colaborou-se na inveno de um mtodo destinado sua cultura e proliferao, que poder ter valor na utilizao das células cultivadas em outras patologias. Demonstrou-se ainda que, no tratamento dos doentes com leses traumticas crnicas da medula espinal, a transplantao de mucosa olfactiva autloga realizvel, razoavelmente segura e potencialmente benfica
Resumo:
Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obteno do Grau de Mestre em Gentica Molecular e Biomedicina
Resumo:
Dissertao apresentada para a obteno do Grau de Mestre em Gentica Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Cincias e Tecnologia
Resumo:
RESUMO Nos ltimos anos tm sido identificados vrios factores de risco para asma brnquica em crianas com sibilncia recorrente, no se encontrando clara a importncia da avaliao funcional respiratria nestas crianas. De igual modo, tm sido documentados resultados contraditrios na avaliao imunolgica das populaes de células reguladoras bem como na expresso de polimorfismos para a asma. O objectivo deste estudo consistiu na avaliao e comparao de parmetros de avaliao funcional respiratria, imunolgica e de polimorfismos genticos em crianas entre 8 e 20 meses de idade, com trs ou mais episdios de sibilncia (n=50), sem qualquer teraputica anti-inflamatria prvia, diagnosticados por um mdico, com e sem factores de risco para asma brnquica (histria de asma parental ou histria pessoal de eczema ou pelo menos dois dos seguintes: histria pessoal de rinite alrgica, sibilncia fora do contexto infeccioso e contagem de eosinfilos no sangue perifrico > 4%), comparados com um grupo controlo (n=30). Nestas crianas foram efectuadas provas de funo respiratria em volume corrente e em volume aumentado atravs de tcnicas de compresso torcica, avaliao de populaes celulares por citometria de fluxo, expresso de citocinas por mARN em culturas de células estimuladas com PMA (leitura s 24 horas) e com extractos de caros do p domstico (leitura ao 7 dia) e expresso de polimorfismos para alguns genes associados a asma (ADAM 33, DPP10, GPRA). Na comparao entre as crianas com sibilncia recorrente em relao ao grupo controlo foram observadas redues significativas nos Z-scores para FVC (diferena mdia [95% IC]: -0,7 [-1,2; -0,1], p=0,01), FEV0.5 (-1,0 [-1,5; -0,5], p=0,0001), FEF75 (-0,6 [-1,0; -0,2], p=0,0001) e FEF25-75 (-0,8 [-1,2; -0,4], p=0,0001), bem como valores significativamente mais baixos para a quantificao do nmero absoluto de CD4+CD25forte (-47,9 [-89,6; -6,1], p=0,03), do nmero absoluto e percentual de CD4+CD25+CTLA-4 (p=0,0001) e da expresso de CTLA-4 (p=0,03) e IFN-
Resumo:
Abstract The investigation of the web of relationships between the different elements of the immune system has proven instrumental to better understand this complex biological system. This is particularly true in the case of the interactions between B and T lymphocytes, both during cellular development and at the stage of cellular effectors functions. The understanding of the BT cells interdependency and the possibility to manipulate this relationship may be directly applicable to situations where immunity is deficient, as is the case of cancer or immune suppression after radio and chemotherapy. The work presented here started with the development of a novel and accurate tool to directly assess the diversity of the cellular repertoire (Chapter III). Contractions of T cell receptor diversity have been related with a deficient immune status. This method uses gene chips platforms where nucleic acids coding for lymphocyte receptors are hybridized and is based on the fact that the frequency of hybridization of nucleic acids to the oligonucleotides on a gene chip varies in direct proportion to diversity. Subsequently, and using this new method and other techniques of cell quantification I examined, in an animal model, the role that polyclonal B cells and immunoglobulin exert upon T cell development in the thymus, specifically on the acquisition of a broader repertoire diversity by the T cell receptors (Chapter IV and V). The hypothesis tested was if the presence of more diverse peptides in the thymus, namely polyclonal immunoglobulin, would induce the generation of more diverse T cells precursors. The results obtained demonstrated that the diversity of the T cell compartment is increased by the presence of polyclonal immunoglobulin. Polyclonal immunoglobulin, and particularly the Fab fragments of the molecule, represent the most diverse self-molecules in the body and its peptides are presented by antigen presenting cells to precursor T cells in the thymus during its development. This probably contributes significantly to the generation of receptor diversity. Furthermore, we also demonstrated that a more diverse repertoire of T lymphocytes is associated with a more effective and robust T cell immune function in vivo, as mice with a more diverse T cell receptors reject minor histocompatiblility discordant skin grafts faster than mice with a shrunken T cell receptor repertoire (Chapter V). We believe that a broader T cell receptor diversity allows a more efficient recognition and rejection of a higher range of external and internal aggressions. In this work it is demonstrated that a reduction of TCR diversity by thymectomy in wild type mice significantly increased survival of H-Y incompatible skin grafts, indicating decrease on T cell function. In addiction reconstitution of T-cell diversity in mice with a decreased T cell repertoire diversity with immunoglobulin Fab fragments, lead to a increase on TCR diversity and to a significantly decreased survival of the skin grafts (Chapter V). These results strongly suggest that increases on T cell repertoire diversity contribute to improvement of T cell function. Our results may have important implications on therapy and immune reconstitution in the context of AIDS, cancer, autoimmunity and post myeloablative treatments. Based on the previous results, we tested the clinical hypothesis that patients with haematological malignancies subjected to stem cell transplantation who recovered a robust immune system would have a better survival compared to patients who did not recover such a robust immune system. This study was undertaken by the examination of the progression and overall survival of 42 patients with mantle cell non-Hodgkin lymphoma receiving autologous hematopoietic stem cell transplantation (Chapter VI). The results obtained show that patients who recovered higher numbers of lymphocytes soon after autologous transplantation had a statistically significantly longer progression free and overall survivals. These results demonstrate the positive impact that a more robust immune system reconstitution after stem cell transplantation may have upon the survival of patients with haematological malignancies. In a similar clinical research framework, this dissertation also includes the study of the impact of recovering normal serum levels of polyclonal immunoglobulin on the survival of patients with another B cell haematological malignancy, multiple myeloma, after autologous stem cell transplantation (Chapter VII). The relapse free survival of the 110 patients with multiple myeloma analysed was associated with their ability to recover normal serum levels of the polyclonal compartment of immunoglobulin. These results suggest again the important effect of polyclonal immunoglobulin for the (re)generation of the immune competence. We also studied the impact of a robust immunity for the response to treatment with the antibody anti CD20, rituximab, in patients with non- Hodgkins lymphoma (NHL) (Chapter VIII). Patients with higher absolute counts of CD4+ T lymphocytes respond better (in terms of longer progression free survival) to rituximab compared to patients with lower number of CD4+ T lymphocytes. These observations highlight again the fact that a competent immune system is required for the clinical benefit of rituximab therapy in NHL patients. In conclusion, the work presented in this dissertation demonstrates, for the first time, that diverse B cells and polyclonal immunoglobulin promote T cell diversification in the thymus and improve T lymphocyte function. Also, it shows that in the setting of immune reconstitution, as after autologous stem cell transplantation for mantle cell lymphoma and in the setting of immune therapy for NHL, the absolute lymphocyte counts are an independent factor predicting progression free and overall survival. These results can have an important application in the clinical practice since the majority of the current treatments for cancer are immunosuppressive and implicate a subsequent immune recovery. Also, the effects of a number of antineoplastic treatments, including biological agents, depend on the immune system activity. In this way, studies similar to the ones presented here, where methods to improve the immune reconstitution are examined, may prove to be instrumental for a better understanding of the immune system and to guide more efficient treatment options and the design of future clinical trials. Resumo O estudo da rede de inter-relaes entre os diversos elementos do sistema immune tem-se mostrado um instrumento essencial para uma melhor compreenso deste complexo sistema biolgico. Tal particularmente verdade no caso das interaces entre os linfcitos B e T, quer durante o desenvolvimento celular, quer ao nvel das funes celulares efectoras. A compreenso da interdependncia entre linfcitos B e T e a possibilidade de manipular esta relao pode ser directamente aplicvel a situaes em que a imunidade est deficiente, como o caso das doenas neoplsicas ou da imunossupresso aps radio ou quimioterapia. O trabalho apresentado nesta dissertao iniciou-se com o desenvolvimento de um novo mtodo laboratorial para medir directamente a diversidade do reportrio celular (Captulo III). Redues da diversidade do reportrio dos receptores de células T tm sido relacionadas com um estado de imunodeficincia. O mtodo desenvolvido utiliza gene chips, aos quais hibridizam os cidos nucleicos codificantes das cadeias proteicas dos receptores linfocitrios. A diversidade calculada com base na frequncia de hibridizao do cido nucleico da amostra aos oligonucletidos presentes no gene chip. De seguida, e utilizando este novo mtodo e outras tcnicas de quantificao celular examinei, num modelo animal, o papel que as células policlonais B e a imunoglobulina exercem sobre o desenvolvimento linfocitrio T no timo, especificamente na aquisio de um reportrio diverso de receptores T (Captulos IV e V). Testei, ento, a hiptese de que a presena no timo de pptidos mais diversos, como a imunoglobulna policlonal, induzisse a gnese de precursores T mais diversos. Demonstrmos que a diversidade do compartimento T aumentado pela presena de imunoglobulina policlonal. A imunoglobulina policlonal, e particularmente os fragmentos Fab desta molcula, representam as molculas autlogas mais diversas presentes nos organismos vertebrados. Estes pptidos so apresentados por células apresentadoras de antignio s células precursoras T no timo, durante o desenvolvimento celular T. Tal, provavelmente, contribui para a gnese da diversidade dos receptores. Tambm demonstrmos que a presena de um reportrio mais diverso de linfcitos T se associa a um incremento da funo imunolgica T in vivo. Uma diversidade de receptores T mais extensa parece permitir um reconhecimento e rejeio mais eficientes de um maior nmero de agressores internos e externos. Demonstrmos que ratinhos com receptores de células T (RCT) com maior diversidade rejeitam transplantes cutneos discordantes para antignios minor de histocompatibilidade mais rapidamente do que ratinhos com um menor reportrio T (Captulo V). Por outro lado, uma reduo da diversidade do RCT, causada por timectomia de ratinhos de estirpes selvagens, mostrou aumentar significativamente a sobrevivncia de transplantes cutneos incompatveis para o antignio H-Y (antignio minor de histocompatibilidade), indicando uma diminuio da funo linfocitria T. Alm disso, a reconstituio da diversidade dos linfcitos T em ratinhos com uma diversidade de reportrio T diminuda, induzida pela administrao de fragmentos Fab de imunoglobulina, conduz a um aumento da diversidade dos RCT e a uma diminuio significativa da sobrevivncia dos enxertos cutneos (Captulo V). Estes resultados sugerem que o aumento do reportrio de células T contribui para uma melhoria das funes celulares T e podero ter implicaes importantes na teraputica e reconstitutio imunolgica em contexto de SIDA, neoplasias, autoimunidade e aps tratamentos mieloablativos. Baseado nos resultados anteriores, decidimos testar a hiptese clnica de que doentes com neoplasias hematolgicas sujeitos a transplantao de precursores hematopoiticos e com recuperao imunolgica precoce aps transplante teriam uma sobrevivncia mais longa do que doentes que no recuperassem to bem a sua imunidade. Analismos a sobrevivncia global e sobrevivncia sem doena de 42 doentes com linfoma no Hodgkin de células do manto sujeitos a transplante autlogo de precursores hematopoiticos (Captulo VI). Os resultados obtidos mostraram que os doentes que recuperaram contagens mais elevadas de linfcitos imediatamente aps o transplante autlogo, apresentaram uma sobrevivncia global e sem progresso mais longa do que doentes que no recuperaram contagens linfocitrias to precocemente. Estes resultados demonstram o efeito positivo de uma reconstitutio imunolgica robusta aps transplante de presursores hematopoiticos, sobre a sobrevivncia de doentes com neoplasias hematolgicas. Do mesmo modo, estudmos o efeito que a recuperao de nveis sricos normais de imunoglobulina policlonal tem na sobrevivncia de doentes com outras neoplasias hematolgicas de linfcitos B, como o mieloma mltiplo,aps transplante autlogo de precursos hematopoiticos (Captulo VII). A sobrevivncia livre de doena dos 110 doentes com mieloma mltiplo analizados est associada com a sua capacidade de recuperar nveis sricos normais do compartmento policlonal de imunoglobulina. Estes resultados pioneiros indicam a importncia da imunoglobulina policlonal para a gnese de competncia imunolgica. Tambm estudmos o impacto de um sistema imunitrio eficiente sobre a resposta ao tratamento com o anticorpo anti CD20, ituximab, em doentes com linfoma no Hodgkin (LNH) (Captulo VIII). Os resultados mostram que doentes com valores mais elevados de linfcitos T CD4+ respondem melhor (em termos de maior sobrevida livre de doena) ao rituximab, do que doentes com valores mais baixos. Estas observaes ilustram a necessidade de um sistema imunitrio competente para o benefcio clnico da teraputica com rituximab em doentes com LNH. Em concluso, o trabalho apresentado nesta dissertao demonstra que as células B e a imunoglobulina policlonal promovem a diversidade das células T no timo e melhoram a funo linfocitria T perifrica. Concomitantemente, tambm demonstrmos que, no contexto de reconstituio imune, por exemplo, aps transplante autlogo de precursores hematopoiticos em doentes com linfomas de células do manto, o nmero absoluto de linfcitos uma factor independente da sobrevivncia. Os resultados demonstram, tambm, a importncia dos valores de linfocitos T na resposta ao tratamento com rituximab no caso de doentes com LNH. O mesmo princpio se prova pelo facto de que doentes com mieloma mltiplo sujeitos a transplante autlogo de precursores hematopoiticos que recuperam valores normais sricos de imunoglobulinas policlonais, terem melhores taxas de resposta em comparao com doentes que no recuperam valores normais de imunoglobulinas policlonais. Estes resultados podem ter importantes aplicaes na prtica clnica dado que a maioria dos tratamentos de doenas neoplsicas implica imunossupresso e, subsequente, recuperao imunolgica. Estes estudos podem ser um instrumento fundamental para uma melhor compreenso do sistema imune e guiar uma escolha mais eficiente de opes teraputicas bem como contribuir para a concepo de futuros estudos clnicos.
Resumo:
Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obteno do grau de Mestre em Engenharia Microelectrnica e Nanotecnologia
Resumo:
RESMO: Introduo: A anemia de células falciformes doena hereditria, com repercusso multi-orgnica, tem grande variabilidade na sua expresso clnica. Da o interesse do estudo de indicadores de prognstico. A investigao realizada foi precedida de um resumo histrico incidindo sobre a compreenso de aspectos fundamentais da doena ao longo dos tempos. Na primeira parte do estudo e aps reviso bibliogrfica, foram referidos dados da fisiopatologia como base para os estudos que integram a presente dissertao. Abordou-se o estado da arte relativamente s complicaes, aos indicadores de prognstico e teraputica utilizada. Objectivos: Constituram objectivos deste estudo realizado numa amostra populacional representativa: identificar as leses a nvel dos sistemas cardio-respiratrio e nervoso central, avaliando-se as respectivas repercusses; avaliar a presena de indicadores de prognstico entre as variveis seleccionadas; estudar a eficcia e toxicidade da HU nos doentes com as formas graves da ACF. Para a prossecuo destes objectivos foram delineados para alm do estudo global trs estudos especficos: Estudo 1- repercusso no sistema cardio-respiratrio; Estudo 2- repercusso no sistema nervoso central; Estudo 3- teraputica com hidroxiureia. Doentes e mtodos: Procedeu-se a um estudo prospectivo e multi-institucional durante um perodo de trs anos tendo-se seleccionado para a amostra, e de acordo com critrios pr-definidos, 30 doentes com ACF na fase estvel da doena, com idades compreendidas entre os sete e os 18 anos, todos de origem africana excepo de um caucasiano. O diagnstico baseou-se em tcnicas de electroforese e estudo molecular que definiu o genotipo da doena e a presena da deleco da -talassmia assim como os haplotipos da amostra populacional. Foram utilizadas diferentes metodologias para avaliar a existncia de leso pulmonar e cerebral. Atravs do estudo estatstico foram seleccionadas diversas variveis como hipotticos indicadores de prognstico. Estudo 1. Para determinar a existncia de leso a nvel pulmonar usaram-se duas metodologias diferentes, a avaliao da funo pulmonar com estudo da saturao da Hb em O2 no sangue arterial e a tomografia computadorizada de alta resoluo. Estudou-se tambm a possvel disfuno cardaca como repercusso da leso pulmonar, atravs do ecocardiograma, e os indicadores de prognstico com significado estatstico para a leso encontrada. Estudo 2. O desenho deste estudo foi sobreponvel ao anterior, mas com metodologia adequada para o SNC. Procedeu-se ao estudo das leses cerebrais por meio de exames imagiolgicos, (RMN-CE e DTC) e de testes psicolgicos. Correlacionaram-se as trs metodologias utilizadas e a importncia de cada uma para a deciso de atitudes teraputicas preventivas. Estudo 3. Consistiu num estudo aberto prospectivo no controlado com nove crianas e adolescentes com formas graves de ACF, com o objectivo de avaliar a eficcia da teraputica com hidroxiureia, durante um perodo de 24 meses. Todos os doentes completaram no mnimo 15 meses de teraputica, com uma dose final mdia de 194 mg/K/dia. Resultados globais: Durante o perodo anterior investigao caracterizou-se a amostra populacional estudada quanto ao fenotipo gentico, clnico e hematolgico de acordo com os critrios utilizados por outros investigadores. Verificou-se: predomnio do haplotipo Bantu na forma homozigtica em 53% dos doentes; nmero total de EVO 3/ano em 87,5% dos doentes; crises de sequestrao em 18,75%; dactilites no primeiro ano de vida em 31,2%; quadro de spsis grave apenas num doente; crises de hiper-hemlise em 50%; e STA em 59,38% dos doentes. Quanto ao fenotipo hematolgico evidenciaram-se como factores de risco reticulocitose (13,1x103/l) e hiperbilirrubinmia (2,5 mg/dl) e como factores de bom prognstico a presena de deleco de um gene da -talassmia em 46,9% dos doentes e valor mdio de Hb 8,1 g/dl. Resultados dos estudos parcelares: Estudo 1. Deste estudo infere-se que a DPR ligeira foi diagnosticada em 70% dos doentes, uma vez que as alteraes da difuso no foram estatisticamente significativas, o estudo dos gases no sangue no evidenciaram resultados anormais e a TCAR evidenciou alteraes em 43,3% dos doentes. Apenas num doente se verificou doena pulmonar obstrutiva relacionada com maior nmero da STA.O estudo da disfuno cardaca encontrada em 86,7% dos doentes no reflecte a repercusso da DPR a nvel cardaco, podendo estar associada s alteraes fisiopatolgicas da prpria anemia crnica. Encontraram-se indicadores de prognstico hematolgicos e clnicos. Entre os primeiros, valores de Hb 8,5 g/dl e de HbF 13% foram considerados indicadores de bom prognstico para a leso pulmonar. Em relao aos parmetros clnicos, as STA no foram consideradas indicadoras de prognstico para a DPR ao contrrio do que se verificou com o nmero de EVO. Pela anlise dos parmetros genticos e socio-econmicos provou-se a ausncia de relao estatisticamente significativa com leso pulmonar. Estudo 2. Pela RMN-CE foram diagnosticados ES em 33,3% com uma localizao preferencial na substncia branca profunda em 26,6% dos doentes. Relativamente aos parmetros hematolgicos seleccionados, o valor mdio da HbF 8,6% constituu um indicador de bom prognstico para o aparecimento de ES, enquanto o valor mdio de leuccitos 12.39x103/l foi considerado um indicador de mau prognstico. No estudo do DTC apenas um doente apresentou aumento da velocidade do fluxo cerebral na ACM igual a 196 cm/segundos, associado a vasculopatia grave. Os testes psicolgicos alterados em 80% dos doentes mostraram ser o mtodo mais sensvel para detectar alteraes do neurodesenvolvimento, mas sem correlao com os ES em 10% dos doentes. Reala-se a baixa percentagem de DTC patolgicos encontrados neste estudo em relao ao nmero elevado de ES e de testes psicolgicos alterados, no se verificando concordncia entre os trs exames. Dos indicadores de prognstico estudados a -talassmia foi considerada um factor de proteco para o coeficiente de inteligncia da escala de Wechsler. Em relao a parmetros clnicos estudados os doentes com maior nmero de EVO, tem em mdia valores inferiores nos testes psicolgicos. Estudo 3. Neste estudo verificou-se que o valor mdio da HbF aumentou significativamente de 7,04% para 13,75,3% (p=0,028) ao fim de 15 meses de teraputica com hidroxiureia. Clinicamente todos os doentes responderam significativamente com uma reduo de 80% no nmero de EVO, 69% no nmero de internamentos, 76% no nmero de dias de hospitalizao e 67% no nmero de transfuses. Deste modo comprovou-se no s a eficcia desta teraputica neste grupo peditrico como tambm a falta de efeitos secundrios significativos. Considera-se a necessidade de estudos mais prolongados e em grande sries, para com segurana se usar a HU antes que a leso orgnica se estabelea, portanto logo nos primeiros anos de vida. Concluso: Na amostra populacional estudada foram evidenciadas leses pulmonares e cerebrais na grande maioria dos doentes que condicionaram a sua qualidade de vida. Foram identificados indicadores de prognstico que podero eventualmente ditar medidas teraputicas precoces com o objectivo de diminuir a morbilidade e a mortalidade neste grupo etrio. Demonstrou-se que a teraputica com a HU foi eficaz e bem tolerada----------ABSTRACT: Background: Sickle cell anemia (SCA), a hereditary disease characterized by pain and lifetime multi-organic lesion, is a challenge for all that work with carriers of this disease. The clinical expression variability of SCA is a constant reality and a problem to be solved in the current world of investigation, for which the knowledge of prognostic indicators responsible for the different aspects of clinical evolution diversity wiil be an added value. The study is preceded by a historical summary of the most important factors in the evolution of SCA, which are in themselves, an incentive for future research. In the first part of the study, after an extensive bibliographical revision, physiopathology data is referred to in general and specifically regarding the target organs, that constituted the base for the studies presented in the dissertation. The state of the art for the complications to be studied, the choice of prognostic indicators and the therapeutics application, were approached for the renewed interest in the theme. Aims: In regard to the investigation, the objective was to study the lesions in the most affected organs of a chosen pediatric group, to investigate prognostic indicators for lung and cerebral lesions and to evaluate the protective effect of hydroxyurea in children with severe outcomes. Patients and methods: A prospective and multi-institutional study was carried out during a three-year period, February 1998 to March 2001, with children and adolescents followed up at a Immunohematology Outpatient Clinic of Dona Estefnia's Hospital, Lisbon. Based in predefined criteria, 30 children with SCA were selected in a stable phase of the disease, aged from seven to 18 years old, all of whom were of African origin with exception of one who was Caucasian. The diagnosis was based on electrophoresis techniques and molecular study that allowed to define the genotype, the presence of deletional alpha-thalassemia as well as haplotypes in the population. Different methodologies were used to evaluate the existence of lung and cerebral lesion. Statistical study of the different variables selected the prognostic indicators. In Study 1, to determine the existence of lung lesion two different methodologies were used: pulmonar function study with arterial blood gases determination; and high resolution computerized tomography. Heart dysfunction as a repercussion of lung lesion was also studied through echocardiography, and prognostic indicators were statistically significant for lesions found. The design of Study 2 was similar to Study 1, but with the appropriate methodology for CNS. After neurological examination, which was normal in all patients (control group), cerebral lesions were studied with imagiologic exams (MRN-CE and TCD) and psychological tests. These three methodologies were correlated and the importance of each one in the decision of the therapeutic profilactic attitudes. Study 3 consisted of a controlled prospective open study in children with severe forms of SCA, with the aim of the evaluating therapeutic effectiveness of hydroxyurea, during a period of 24 months. Results: In the global overall study preceding the Studies 1,2 and 3, there were a prevalence of haplotype Bantu (53%) and other risk factors, namely the number of VOC (87,5%), sequestration crisis (18,75%), dactilytis in first year of life(31,2%), hyperhemolysis crisis (50%) and ATC in more than half of the patients (59,38%). This group of bad prognostic indicators, associated with the population of the lower class according to the Graffar scale, demonstrates the importance of primary health care services, information provided to the children and their relatives, as well as the interest in prophylactic therapeutics, specific screening and prenatal diagnosis. Study 1. It was evident from this study that slight RPD was diagnosed in 70% of the patients, because alterations of the diffusion had no statistical significance and arterial blood gases determinations were normal. Only one patient had restrictive lung disease related with numerous ACS. However ACS was not considered a prognostic indicator for RPD, contrary to the number of EVO. HRTC revealed discreet fibrotic lines that could be related with slight RPD, but the lack of correlation of these two exams (33%) supports the value of lung function tests for precocious diagnosis of RPD. Heart dysfunction was found in 86,7% of patients, does not reflect the repercussion of RPD, but with the physiopathology of chronic anemia. Hematologic and clinical prognostic indicators were found. Good prognostic indicators for the non-evolution of RPD with average Hb values of 8,5 g/dl and average HbF values of 13%, respectively. The genetic and social-economic factors had no statistical significance; nevertheless, they were more prevalent among Bantu haplotype (53,3%) in patients with RPD. Study 2. RMN-CE detected SI in 33,3% of the patients, with preferential location in deep white substance in 26,6% and in front lobe in 20%. This distribution can be related to structural aspects of the brain and with the high sensibility of this organ to hypoxia. From the hematological parameters selected, average HbF value 8,6% and average leucocyte count 12.39x103/l were prognostic indicators with different meaning to SI. The increase in the total bilirubin related to hyperhemolysis clinically explains the genesis of SI In the TCD study, only one patient had increased cerebral flow speed >196 cm/sec in CMA, which corresponded to serious vasculopathy in AngioMR. This patient never present previously neurological symptoms and had several hyperhemolysis crisis and VOC as risk factors. Low percentage of pathological TCD in this study, in relation to the high number of SI and altered tests, although without correlation among the three exams, is probably attributed to factors related to the methodology, aspects of cerebral physiopathology or perhaps a sign of good prognostic if the duration of study had not been so short. TCD should be used as a screening method in the age groups with higher risk of AVC and should never be considered separately in prophylactic therapeutics indication. Psychological tests were the most sensitive method to detect neurodevelopment impairment; in 80% of patients the neuropsychologics tests were altered, but without correlation with SI (10%). Since SI can become evident during the first two years of life and develop with time, the first psychological tests should be carried out between 3 and 5 years of age to timely be referred to special education and stimulation programs. Prognostic indicators to psychological tests were also found: alpha-thalassemia was found to be a protection factor of the IQ, just as other hematologic factors (hematocrit, MGCV and erythrocytes count). In relation to clinical parameters, although without statistical significance, patients with larger number of VOC had average lower scores versus the average in tests, except in TP. Results from different studies were conclusive as to the type of lesion found and the importance of prognostic indicators. Study 3. All the patients completed a minimum of 15 months therapeutic treatment with the final average daily dose of 194 mg/kg/day. The average value of the fetal hemoglobin increased significantly from 7,03,9% to 13,75,3% (p=0.028). The HbF average values increased from 6% to 15% after 15 months of therapeutic treatment. Clinically there was a reduction of 80% in the number of VOE , 69% in the number of hospitalization, 76% in the number of days of hospitalization and 67% in the number of transfusions. Once again the effectiveness of this treatment in this pediatric group, as well as the lack of any significant secondary effects, was evident. The study confirms the need for further detailed research in order to safely effect the appropriate treatment prior to the development of organic lesions, which ideally should be in the first year of life. Conclusions: These results allow us to clarify the importance of either pulmonary lesions or either nervous central system impairment among patients, children and adolescents, with sickle cell anemia. These lesions were demonstrated in most of the patients studied compromising their quality of life and the mortality. The treatment with HU is proved to be effective and having low toxicity.
Resumo:
Dissertao apresentada para a obteno do Grau de Mestre em Engenharia de Materiais, pela Universidade Nova de Lisboa,Faculdade de Cincias e Tecnologia
Resumo:
A infeco pelo VIH/SIDA constitui um dos principais problemas de sade no Mundo e em frica. A frica Sub-sahariana detm actualmente 67% das infeces a nvel global. Angola, localizada na sub-regio central de frica (OMS) tem uma prevalncia actual mdia estimada em 2.4%, estando rodeada a Sul e Leste por pases de prevalncias mais elevadas. Em Angola, predomina o VIH-1. Os dados publicados sobre a epidemiologia molecular do VIH em Angola mostram uma grande diversidade de subtipos e formas recombinantes circulantes (CRF), recombinantes circulantes nicas (URF) e amostras no tipificadas. A motivao para o estudo presente foi o conhecimento ainda limitado sobre a infeo por VIH em Angola, desde a epidemiologia molecular s caractersticas clnicas, imunolgicas, virolgicas, resposta teraputica anti-retrovrica combinada (TARVc) e perfil de resistncia do VIH TARVc. Foi estudado um coorte de 300 doentes adultos, com infeco por VIH, de 15 de Junho de 2006 a 15 de Junho de 2010. Predomina o gnero feminino, 65% (194/300) e o grupo etrio dos 25 aos 39 anos, 62% (186/300). A mediana de idades 33 anos, residem em Luanda 98% (295/300), 94% so angolanos, sendo os estrangeiros de S. Tom e RDC. A Classificao CDC de 1993 na linha de base mostrou um predomnio de doentes da categoria clnica C, 53% (160/300), com uma ou duas doenas definidoras; 34% (101/300) dos doentes eram da Categoria C3 do CDC e 49% (147/300) tinham linfcitos T CD4+ abaixo das 200 cel/l. A doena definidora mais frequente foi a Tuberculose, em 39% dos doentes (117/300). A mediana de linfcitos T CD4+ na linha de base foi de 195 cel/l [1-1076]. Apenas 12,2% dos doentes (37/302) tinha T CD4+ de base superior a 500 células/l. Determinou-se a carga vrica na linha de base, em 213 dos doentes (71%), verificando-se que 46% destes doentes (97/213) tinham cargas vircas superiores a 100.000 cp/ml, 32% (69/213) entre 10001 e 100000, 21% (45/213) entre 400 e 10000, 0,9% (2/213) abaixo de 400 cp/ml. Iniciaram teraputica anti-retrovrica no perodo de estudo 206 doentes (69%) com esquemas teraputicos baseados em NNRTI, sendo 131 (64%) medicados com a associao d4t+3TC+ NVP. Ao fim de 4 anos, em Junho de 2010, havia 126 doentes monitorizados com contagem de linfcitos T CD4+ e CV, estando 62% dos doentes com CV indetectvel (79/126). Os doentes em falncia virolgica corresponderam a 16% (20/126), 9% (11/126) tinham resultados discordantes (boa resposta imunolgica mas carga viral detectvel) e 13% (16/126) foram inconclusivos. Foi mudada a teraputica para esquema de 2 linha em 5 doentes, 4 dos 5 doentes com critrios de falncia virolgica e 1 sem critrios de falncia virolgica, por toxicidade ao EFV. Os doentes com critrios de falncia imunolgica ou virolgica segundo a OMS e os doentes com dados inconclusivos foram seleccionados para testes genotpicos de resistncia aos anti-retrovricos (TR). Foram realizados TR e subtipagem em 37 doentes. Nos doentes que realizaram TR sob TARVc, as mutaes de resistncia mais frequentemente encontradas foram a M184V, em 16 doentes, a K103N em 12 doentes e a Y181C em 7 doentes. O subtipo C, foi o subtipo predominante em 30% (11/37) dos casos. Para avaliar a adeso TARVc, foram estudados 63 doentes, faltosos a consultas ou demonstrado sinais de falncia clnica, imunolgica ou virolgica. O mtodo realizado foi o auto-relato por entrevista. Verificou-se uma adeso TARVc de 100% em 33% (21/63), adeso entre 100% e 90% em 7% (4/63), de 50 a 90% em 7% (4/63) e inferior a 50% em 54% (34/63). Como factores de no-adeso, predominavam a mobilidade no emprego Opes de utilizao sequencial de anti-retrovricos em doentes com falncia teraputica em Angola X e factores familiares e sociais, apontados como razo para a falta s consultas que davam acesso aos medicamentos ARV. Fazendo corresponder os resultados dos testes de resistncia realizados adeso de todos os doentes entrevistados, verifica-se que o grupo de 34 doentes com menos de 50% de adeso, 19 realizaram TR e desses, 13 mostraram mutaes de resistncia, sendo 10 resistentes a 2 classes de ARV, NITR e NNITR, 2 a NNITR e 1 a NITR. Os restantes 6 doentes deste grupo eram aparentemente susceptveis s 3 classes de ARV. Actualmente, esto em seguimento 58% dos doentes (176/300), 26 % (77/300) perderam-se no seguimento e 16% (47/300) faleceram. O estudo realizado salienta a fase tardia da chegada aos cuidados mdicos; mostra a tuberculose como doena indicadora mais frequente e mostra que a maioria dos doentes foi medicada com D4T+3TC+NVP. Os critrios de sucesso teraputico descem ao longo do estudo de 71% para 62%. Indica a necessidade de aces urgentes para acesso mais precoce aos cuidados de sade e interveno social para ultrapassar as limitaes adeso TARVc e tornar esta mais eficaz. As opes de segunda linha j disponveis so muito reduzidas (tenofovir, lopinavir potenciado com ritonavir e saquinavir), havendo necessidade de continuar estes estudos para uma avaliao mais profunda da eficcia destas teraputicas.
