Tipificação de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC e detecção da sua aderência a células epiteliais pulmonares

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

A Peripneumonia Contagiosa Bovina (PPCB) é uma doença respiratória infecciosa, de grande relevo no âmbito da produção de gado bovino, causada pela bactéria Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC). Actualmente, a PPCB permanece endémica apenas em África, sendo aí responsável por perdas incontornáveis no sector pecuário. O último surto de PPCB detectado na Europa ocorreu em Portugal em 1999 mas, devido à sua natureza insidiosa, o risco de re-emergência é permanente. As estirpes de MmmSC associadas aos últimos surtos europeus de PPCB são tradicionalmente consideradas geneticamente muito homogéneas. No entanto, trabalhos recentes de tipificação molecular revelaram a existência de uma variabilidade genética intraspecífica superior ao que se esperava. A realização deste trabalho teve como base dois objectivos fundamentais: a tipificação de estirpes de MmmSC isoladas durante os últimos surtos de PPCB que ocorreram em Portugal entre 1993 e 1998, e a aplicação de um método alternativo e inovador para a detecção e quantificação de MmmSC, após a infecção de culturas celulares. Para a concretização do primeiro objectivo foi realizada uma análise da variabilidade polimórfica de três regiões VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) existentes no genoma de estirpes de MmmSC. O locus VNTR4 comprovou ser o mais polimórfico, detectando-se quatro perfis distintos entre as estirpes portuguesas. O perfil VNTR4 do tipo “9” (numerado em função das repetições da sequência de consenso) revelou-se amplamente distribuído geograficamente e foi predominante entre os isolados. No entanto, observou-se uma segregação geográfica de perfis, dado que na região da Beira Litoral apenas foram encontradas estirpes com o perfil VNTR4 do tipo “8”. Estes resultados sugerem que podem ter ocorrido, pelo menos, dois eventos de re-emergência de PPCB em Portugal, entre 1993 e 1998. Para a realização do segundo objectivo deste trabalho foi optimizada uma técnica baseada na hibridação in situ com sondas de DNA fluorescentes (FISH) que permitiu visualizar micoplasmas aderidos a culturas celulares. Esta técnica, que nunca tinha sido usada previamente na detecção de MmmSC, comprovou ser adequada para futuras aplicações em estudos de citoaderência e para a detecção de micoplasmas em culturas celulares.