15 resultados para |Nested-PCR
Resumo:
Biomphalaria glabrata, molusco de gua doce, desempenha um importante papel em Parasitologia Mdica, por ser o hospedeiro intermedirio de Schistosoma mansoni, tremtode digentico responsvel pela schistosomose intestinal. A deteco de moluscos infectados pelo Schistosoma mansoni tem uma grande importncia em Sade pblica, porque identifica focos de transmisso da schistosomose. As limitaes dos mtodos clssicos para o diagnstico de infeces pr patentes fazem com que os mtodos de biologia moleculares sejam vistos como possveis alternativas atravs da deteco de ADN do S. mansoni em moluscos hospedeiros. A deteco de sequncias especficas de ADN por reaco de polimerase em cadeia (PCR) tem-se verificado ser de extrema importncia para a anlise gentica e diagnstico de vrias doenas infecciosas. Neste estudo foi aplicada a tcnica de Nested-PCR, com o objectivo de identificar, no perodo pr-patente, S. mansoni em moluscos expostos a 1, 5 e 10 miracdios em diferentes perodos de tempo. Foram utilizados moluscos das estirpes albina e selvagem de B. glabrata. Para a realizao das tcnicas de PCR e de NestedPCR (NPCR) foram utilizados dois pares de oligonucletidos desenhados especificamente para detectar o ADN de S. mansoni . Verificou-se amplificao do fragmento de ADN do parasita em 80% das amostras analisadas, independentemente da dose de miracdios e do perodo de exposio. O mtodo utilizado altamente sensvel, mostrando ser uma ferramenta til na deteco de hospedeiros intermedirios de S. mansoni, consequentemente na identificao de focos de schistosomose intestinal. Palavras-chave: Schistosoma mansoni, Biomphalaria glabrata, perodo pr-patente e Reaco em Cadeia de Polimerase.
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Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obteno do grau de Mestre em Biotecnologia
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Resumo O vrus citomeglico humano (CMV) o principal agente de infeco congnita, atingindo cerca de 0.2 a 2.2% de todos os recm-nascidos. As crianas que nascem infectadas por este vrus tm cerca de 11% a 12.7% de probabilidades de apresentarem sintomas e sinais de doena citomeglica ao nascimento, podendo cerca de 40 a 58% destas virem a apresentar sequelas neurolgicas permanentes. Das crianas infectadas que tero infeco assintomtica no perodo neo-natal, 5 a 15% podero vir igualmente a sofrer de sequelas tardias, sobretudo a surdez ou o atraso mental. Em Portugal, desconhece-se a dimenso deste problema. O primeiro objectivo desta dissertao foi, desta forma, a determinao da prevalncia atravs do recurso aos cartes do diagnstico precoce (Guthrie cards), utilizando uma tcnica de nested-PCR dirigida para o vrus. Foram estudados 3600 cartes, seleccionados de todo o territrio nacional (continente e ilhas), de uma forma proporcional ao nmero de nascimentos em cada distrito, dos quais 38 foram positivos, o que d uma prevalncia de 1.05% (intervalo de confiana para 95%: 0.748-1.446). A reviso sobre a experincia acumulada nos ltimos 15 anos, na rea do diagnstico pr-natal, juntamente com um estudo adicional sobre a tcnica da avidez, permitiu retirar algumas ilaes, nomeadamente que este diagnstico constitui uma arma diagnostica fivel para a avaliao pr-natal desta infeco congnita e que a seleco dos casos para amniocentese dever obedecer a indicaes serolgicas precisas, como a seroconverso para IgG ou a IgM confirmada (devendo o mtodo de confirmao ser a avidez das IgG com um ndice <0,6) e as alteraes ecogrficas de etiologia no esclarecida. A possibilidade de utilizar pools de urinas para detectar a infeco congnita por CMV foi abordada na terceira parte do trabalho experimental. A metodologia a descrita teve correlao total com o mtodo de referncia, permitindo uma reduo bastante significativa nos tempos de execuo e nos custos em consumveis, pelo que abre a possibilidade da sua utilizao para o rastreio da infeco congnita por CMV nos recm-nascidos.
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A infeco urogenital causada por Chlamydia trachomatis a doena bacteriana sexualmente transmissvel mais comum na Europa, tanto em homens como em mulheres. Constitui um grave problema de sade pblica devido elevada percentagem de portadores assintomticos, s complicaes clnicas que da podem resultar e possibilidade de transmisso vertical. O presente trabalho teve como principais objectivos: i) avaliar a prevalncia da infeco por C. trachomatis e por Neisseria gonorrhoeae num grupo de grvidas de 36 semanas atendidas na consulta externa de Obstetrcia do Hospital Amadora Sintra e nos recm-nascidos de mes infectadas, ii) identificar os serovares responsveis pelas infeces por C. trachomatis, iii) verificar a distribuio da prevalncia da infeco por C. trachomatis em funo da idade e iv) avaliar a utilidade de uma tcnica de PCR multiplex e de PCR multiplex em tempo real no diagnstico desta infeco. Foram testadas 1201 amostras de urina do primeiro jacto de grvidas e 18 exsudados oculares provenientes de recm-nascidos cujas mes estavam infectadas com C. trachomatis. Cada amostra foi testada pelas tcnicas de PCR multiplex e de PCR multiplex em tempo real, tendo como alvos de amplificao um fragmento do plasmdio crptico e outro do gene omp1. Todos os resultados positivos foram confirmados com uma tcnica de nested PCR e posteriormente enviados para sequenciao para identificao dos serovares envolvidos. Em todas as amostras foi ainda pesquisada a presena de ADN de N. gonorrhoeae atravs de tcnicas de PCR e de PCR em tempo real sendo que, na primeira, o alvo a amplificar foi um fragmento do gene ccpB do plasmdio pJDI e na segunda o pseudogene porA. Os resultados positivos foram confirmados por RFLP. A prevalncia da infeco por C. trachomatis e por N. gonorrhoeae foi de 3,7% (45/1201) e de 0,08% (1/1201), respectivamente. Nos recm-nascidos, a prevalncia foi de 0% para ambas as infeces, embora o nmero de recm-nascidos estudados (18/45) dificilmente seja representativo. O serovar mais prevalente foi o E (31,1%), seguido do G (15,6%), do D/Da (13,3%), do F, I/Ia e do J (11,1%). O serovar K foi identificado em 4,4% das amostras infectadas e o H em apenas 2,2%. A tcnica de PCR multiplex em tempo real parece ser mais adequada para o diagnstico da infeco por C. trachomatis do que a tcnica de PCR multiplex, tendo a primeira detectado 100% dos casos de infeco por este microrganismo (45/45), enquanto que a segunda detectou apenas 71% (32/45) dos mesmos.
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RESUMO: Nas ltimas quatro dcadas, desenvolveram-se vrios estudos, dispersos por todo o mundo, visando analisar a importncia da transmisso perinatal do CMV pelo leite materno, nos recm-nascidos prematuros e de baixo peso nascena. Comparando estes estudos, as taxas de incidncia de infeco e doena so extremamente variveis, no havendo consenso entre os autores. Surgiu, assim, a necessidade de realizar a presente dissertao, pioneira ao nvel nacional, com o objectivo de determinar a incidncia da infeco perinatal citomeglica, transmitida atravs do aleitamento materno a recmnascidos prematuros, e identificar as suas consequncias clnicas. Para a elaborao deste trabalho foram seleccionados todos os recm-nascidos com idade gestacional inferior a 35 semanas e respectivas mes seropositivas para CMV, internados na Unidade de Cuidados Intensivos de Neonatalogia do Hospital de So Francisco Xavier, entre o perodo de 1 de Outubro de 2010 e 31 Julho de 2011. Foram analisadas as urinas dos recm-nascidos e o leite materno das mes na primeira, sexta e dcima segunda semana ps-parto, utilizando a tcnica de Nested-PCR e, posteriormente, a PCR em Tempo Real, para determinar a carga viral do leite materno. Constatou-se que a aquisio da infeco perinatal de CMV no recm-nascido prematuro ocorre com alguma frequncia (40,5%), sendo muito provvel que a via de transmisso em 38,1% destes casos seja o leite materno infectado, no devendo esta ser desvalorizada. Relativamente s consequncias clnicas, no foram observadas alteraes clnico-laboratoriais associadas infeco citomeglica. Analisando os factores que condicionam a transmisso da infeco citomeglica perinatal, estabeleceu-se uma correlao entre a carga viral do leite materno e a transmisso do vrus, permitindo deduzir que quanto maior a carga viral, maior o risco de transmisso. Finalmente, os resultados obtidos sugerem que o risco de transmisso da infeco e suas consequncias clnicas no justificam a contra-indicao da amamentao, pois esta comporta, tambm, elevados benefcios. ----------------ABSTRACT: In the last four decades, several studies were developed all over the world to analyze the importance of CMV perinatal transmission through mothers milk in the preterm and low birthweight newborns. Comparing these studies, the infection and disease incidence rates are extremely variable, without agreement between the authors. The aim of this study, the first of the kind made in Portugal, is to define the rate of perinatal cytomegalovirus infection in preterm newborns via breastfeeding and its clinical consequences. All the newborns with gestational age below 35 weeks and their CMV seropositive mothers, admitted between the October 1, 2010 and July 31, 2011 in the Neonatology Intensive Care Unit of the So Francisco Xavier Hospital, were included in this study. Human breast milk and urine specimens were collected from mothers and their preterms infants around the 1st, 6th and 12th week after delivery and analyzed by Nested-PCR. The PCR in Real Time was used to determine the breast milk viral load. It was found that the CMV perinatal infection in preterm infants occurs in 40,5% of the cases and most likely 38,1% of these were infected via breastmilk and therefore this should not be overlooked. Considering the clinical consequences, no clinical and laboratory changes associated with cytomegalovirus infection were observed. Analyzing the factors that determine the perinatal transmission of the cytomegalovirus, it was established a correlation between breast milk viral load and viral transmission, allowing to conclude that the higher the viral load the greater the risk of transmission. Finally, the obtained results suggest that the risk of CMV infection and its clinical consequences dont justify the breastfeeding contraindication because it also provides high benefits.
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A malria considerada como a doena parasitria mais sria em humanos, infectando cerca de 5 a 10% da populao mundial, estimando-se entre 300 a 600 milhes de casos e mais de dois milhes de mortes, anualmente. Apesar da severidade da doena, a compreenso da variabilidade da resposta do hospedeiro infeco (traduzida desde a infeco silenciosa at formas crnicas da doena, passando por quadros clnicos potencialmente fatais), continua a ser um dos grandes desafios da investigao mdica. Vrios factores genticos parasitrios ou do hospedeiro, estado imune e nveis de exposio, contribuem para esta variabilidade, mas a sua importncia relativa para a carga total da doena tem sido pouco estudada. Entre outros, possvel salientar como fontes importantes de variabilidade na susceptibilidade malria e gravidade da doena, factores intrnsecos ao hospedeiro tais como polimorfismos genticos relacionados com as clulas sanguneas e factores parasitrios como a composio da(s) populao(es) parasitria(s) presentes na infeco. Factores do hospedeiro humano relacionados com as clulas sanguneas (drepanocitose e deficincia na glucose-6-fosfato desidrogenase - G6PD) tm sido tradicionalmente estudados e relacionados com a gravidade da malria causada por Plasmodium falciparum. Relativamente s populaes parasitrias, das cinco espcies que infectam humanos, P. falciparum continua a ser responsvel pela malria grave, apesar de muito recentemente alguma gravidade ser atribuda a Plasmodium vivax. Sabe-se que nas mesmas reas outras espcies coexistem em muito maior prevalncia, contrariando o que se pensava h algum tempo. Apesar de poucos estudos terem focado o tema das infeces mistas, existem alguns relatos de que eventuais interaces entre as diferentes espcies presentes simultaneamente no mesmo hospedeiro poderem afectar a susceptibilidade doena. Com o objectivo geral de avaliar o efeito e a contribuio destes factores na susceptibilidade e gravidade da malria, analisando e comparando trs grupos (estudo de caso-controlo) doentes com malria grave (MG), doentes com malria no-complicada (Mnc) e indivduos infectados assintomticos (IA), realizmos em Angola de 2007 a 2010, um estudo em sete das 18 provncias com distintos nveis de endemicidade. Foram obtidas 1.416 amostras de sangue perifrico de 1.198 indivduos assintomticos e 218 doentes. O DNA obtido a partir destes isolados foi utilizado para deteco da presena de variantes genticos relacionados com os eritrcitos (drepanocitose anlise do gene HBB, deficincia G6PD anlise do gene G6PD, antignio Duffy-anlise do gene DARC) e identificao das espcies de Plasmodium presentes, atravs de nested-PCR mediante a amplificao dos genes que codificam a subunidade menor do RNA ribossomal. Os resultados demonstraram prevalncias superiores s anteriormente descritas em relao s seguintes espcies parasitrias: P. falciparum 98,2% vs 92,0% e Plasmodium malariae 10,7% vs 1,0% e inferior em relao a P. vivax 2,5% vs 7,0%. Foi reconfirmada a presena de Plasmodium ovale (descrita anteriormente), mas no publicada em documentos oficiais e relatada pela primeira vez em Angola a presena de infeces mistas (duplas e triplas) (15,7%) e de infeco por P. vivax em indivduos Duffy-negativos (dados publicados). Relativamente aos polimorfismos relacionados com os genes HBB e G6PD e provvel associao com a proteco malria, os nossos resultados confirmam a associao do trao falciforme (heterozigotia HbS), com a proteco doena (OR = 0,30; IC 95% 0,18-0,49; p<0,001). Contudo, no foi encontrada, quer nos indivduos hemizigticos, quer nos heterozigticos para o alelo G6PD (A-) nenhuma evidncia para a proteco a malria (MG e Mnc) (OR = 1,69; IC 95% 0,91-3,13; p=0,096). Os resultados desta investigao requerem um estudo mais aprofundado, com uma dimenso amostral maior, necessrio confirmao da nossa observao.
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RESUMO: O maraviroc (MVC) o nico anti-retroviral antagonista do co-receptor CCR5 licenciado e interage com as ansas transmembranares de CCR5, induzindo uma alterao da sua conformao e impedindo a interaco com gp120. O MVC activo apenas contra estirpes R5 de HIV-1, sendo utilizado em terapia de recurso. Neste trabalho, foi estudada a diversidade gentica da regio C2V3C3 do gene env de estirpes de HIV-1 de oxicodependentes por via endovenosa da Grande Lisboa, pesquisando-se tambm a presena de polimorfismos genticos naturais. Foram utilizadas 52 amostras de plasma e para 35 destas foi amplificado por RT-nested PCR um produto de 565 pb. A anlise filogentica revelou a seguinte distribuio de gentipos: 23 B (incluindo, provavelmente, 2 CRF14_BG), 8 A, 3 G e 1 F1. Aps traduo, e por comparao com a sequncia consenso B, verificou-se uma elevada frequncia de polimorfismos genticos, sendo encontradas algumas assinaturas de aminocidos relativas aos subtipos no-B. Realizou-se ainda uma pesquisa de locais de N-glicosilao e a previso da utilizao de co-receptores (abordagem genotpica), com recurso s regras 11/25 e da carga lquida da ansa V3 e aos programas PSSM e geno2pheno[coreceptor]. Observou-se uma conservao genrica do nmero de locais de N-glicosilao e foram identificadas 5 sequncias com tropismo X4 ou duplo. Por fim, com base na literatura, realizou-se uma pesquisa de polimorfismos genticos associados a resistncia ao MVC presentes na ansa V3. Foi observado um nmero elevado destas mutaes. A presena dos padres 11S+26V e 20F+25D+26V, num total de 3 sequncias, relevante, visto estes estarem inequivocamente associados resistncia in vivo ao MVC. Apesar de no estar ainda definido um perfil de resistncia para o MVC, a presena das mutaes encontradas, em indivduos sem contacto prvio com o frmaco, trar implicaes relevantes na sua gesto clnica, considerando a introduo do MVC na terapia de recurso.---------- ABSTRACT: Maraviroc (MVC) is the only CCR5 inhibitor licensed today. This drug interacts with the transmembrane helices of CCR5 co-receptor, inducing a conformation change of its extracellular loops and preventing the interaction with gp120. MVC is only active against R5 strains of HIV-1 and is currently used in salvage therapy. The genetic diversity of the env C2V3C3 region of HIV-1 strains from injecting drug users in the Greater Lisbon was studied, along with the presence of natural genetic polymorphisms. 52 plasma samples were used and the amplification by RT-nested PCR of a 565 bp-product was possible in 35 of them. The phylogenetic analysis revealed 23 sequences classified as subtype B (probably including 2 CRF14_BG), 8 A, 3 G and 1 F1. After translation, the presence of natural genetic polymorphisms was studied by comparison to a subtype B consensus. A high frequency of genetic polymorphisms was observed and significant amino acid signatures were found in association with non-B subtypes. A full characterization of the N-glycosylation sites was also performed and a coreceptor prediction (genotypic approach) was accomplished using the 11/25 and the V3 net charge rules and the programs PSSM and geno2pheno[coreceptor]. The number of N-glycosylation sites was generically preserved. Five sequences were defined as X4 or dual-tropic. Based on published data, a search for genetic polymorphisms, present in V3loop, associated to MVC resistance was finally undertaken. Several of such mutations were observed, being particularly interesting the presence of the patterns 11S+26V and 20F+25D+26V, in a total of 3 sequences, since these patterns have unequivocally been associated with MVC resistance in vivo. Although a resistance profile for MVC is not yet defined, the presence of these mutations in MVC-nave populations may have significant impact in their clinical management in the future, especially considering the introduction of this drug in salvage therapy.
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Nas ltimas duas dcadas tem-se verificado um aumento da incidncia de aspergilose pulmonar invasiva, que se reflecte em taxas de mortalidade e morbilidade extremamente elevadas. Esta realidade resulta da elevada utilizao de quimioterapia e de agentes imunossupressores, usados sobretudo em doentes imunocomprometidos, principalmente, em doentes hemato-oncolgicos e receptores de transplante de medula ssea. Estas infeces fngicas so provocadas por algumas espcies do gnero Aspergillus em que Aspergillus fumigatus a espcie mais frequentemente isolada a partir de infeces humanas. Contudo, outras espcies como A. flavus, A. niger, A. glaucus, A. nidulans, A. terreus ou A. versicolor tambm podem ser responsveis por infeces fngicas no Homem. Um factor determinante para o aumento da incidncia de aspergilose invasiva consiste na incapacidade de se estabelecer um diagnstico precoce definitivo para que, em tempo til, possa ser instituda teraputica antifngica que v seguramente melhorar o prognstico desses doentes. Actualmente, as tcnicas convencionais (microbiolgicas e histolgicas) tm servido como linhas de orientao para o diagnstico definitivo de micoses. No entanto, como se tratam tcnicas morosas, o diagnstico imunolgico e molecular tem todas as potencialidades para oferecer uma abordagem promissora no diagnstico de infeces fngicas. Neste trabalho foram estudadas 37 amostras clnicas, das quais 45,9% pertenciam a indivduos do sexo feminino, 54,1% do sexo masculino, maioritariamente com o diagnstico clnico de leucemia mielide aguda (75,7%). O principal objectivo deste trabalho consistiu na comparao dos resultados obtidos por uma tcnica imunolgica utilizada no diagnstico de aspergilose pulmonar invasiva (pesquisa do antignio GM) com uma nova tcnica molecular de diagnstico (nested-PCR), com o intuito de avaliar a sensibilidade e especificidade dos resultados obtidos. Dos 37 doentes do estudo, 35,1% revelaram presena do antignio galactomanano e em 32,4% das amostras foi possvel detectar DNA fngico utilizando primers especficos numa reaco de nested-PCR. No final deste trabalho pode-se constatar que, em virtude do mtodo molecular utilizando uma reaco de nested-PCR no se ter revelado mais sensvel que a pesquisa do antignio galactomanano, julgamos ser no entanto muito promissor no diagnstico da aspergilose pulmonar invasiva, bastando apenas aperfeioar a sua optimizao.
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Dissertao para obteno do grau de Mestre em Microbiologia Mdica
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As helmintoses em ovinos e bovinos so provocadas principalmente por parasitas dos filos Platyhelminthes e Nematoda. Atualmente esto espalhadas um pouco por todo o mundo, inclusivamente Portugal, desde o Continente Americano (norte e sul) ao continente Asitico, passando pela Europa e algumas regies do continente Africano, estando a sua incidncia relacionada com locais onde existe uma enorme criao de gado. Apesar de a sua prevalncia ser muitas vezes subestimada, esto associados a morbilidade e mortalidade animal, levando a perdas econmicas em exploraes pecurias, e podem tambm constituir um problema de sade pblica para humanos, que geralmente so infetados de forma acidental. Este estudo aborda as trs espcies principais de helmintas parasitas hepticos em bovinos e ovinos em Portugal: E. granulosus, a F. hepatica e o D. dendriticum. O principal objetivo deste estudo estimar a prevalncia destas helmintoses, e a sua distribuio, em animais abatidos em matadouros de Portugal, particularmente em ovinos e bovinos, e perceber se a inspeo visual feita em matadouros suficientemente eficaz para deteo daqueles parasitas, com possveis consequncias para a sade pblica e para estimao de prevalncia. As amostras estudadas foram fgado e pulmo, obtidas em dois matadouros da Regio Centro de Portugal (Leiria e Pedrogo Grande), a partir de ovinos e bovinos aquando do sacrifcio do animal. Foi efetuada a extrao de DNA e posteriormente a amplificao por PCR do gene mitocondrial COI e das regies ITS1 e ITS2 com primers descritos na literatura (LCO1490/HCO2198, JB2/JB4.5, BD1/4S e Dd58SF1/Dd28SR1). Para aumentar a sensibilidade de deteo de DNA dos 3 parasitas estudados e permitir assim efetuar um diagnstico diferencial foram desenhados e testados novos primers, internos aos existentes na literatura, desenvolvendo assim uma tcnica de Nested-PCR. Posteriormente foram purificados e sequenciados alguns produtos de amplificao das reaes de PCR com os primers descritos na literatura e analisados do ponto de vista filogentico. Os resultados obtidos indicaram que os primers descritos na literatura tm a capacidade de amplificar a regio alvo dos parasitas estudados, mesmo na presena de DNA do hospedeiro, e que em nenhuma amostra de ovino e bovino ocorreu a deteo de DNA de quaisquer dos 3 helmintas. A anlise filogentica de produtos de PCR obtidos de amostras portuguesas revelou que as sequncias obtidas eram muito semelhantes a amostras Europeias e foi encontrado um novo hapltipo para a regio ITS1 e ITS2 de F. hepatica na amostra Fasc3 e Fasc4, respetivamente. Os dados obtidos indicam que a prevalncia de D. dendriticum e E. granulosus foi estimada entre 0 e 2% (intervalo de confiana de 0.95). Quanto a F. hepatica, detetou-se uma prevalncia de 1% com uma margem de 0 a 5% (intervalo de confiana de 0.95).
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This paper suggests that a convenient score test against non-nested alternatives can be constructed from the linear combination of the likelihood functions of the competing models. It is shown that this procedure is essentially a test for the correct specification of the conditional distribution of the variable of interest.
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Pneumocystis jirovecii conhecido por causar infeces especficas no aparelho respiratrio de seus hospedeiros, principalmente em doentes imunocomprometidos, manifestando-se por uma pneumonia grave e por vezes fatal, normalmente designada por pneumonia por Pneumocystis. A caracterizao da diversidade gentica de P. jirovecii tem demonstrado que determinados polimorfismos de base nica podero ser reconhecidos como marcadores moleculares de eleio para o estudo da distribuio geogrfica, vias de transmisso, resistncia/susceptibilidade a frmacos, factores de virulncia e gentica populacional de subtipos genticos. Este estudo teve como objectivo a caracterizao de polimorfismos de P. jirovecii, atravs da metodologia PCR multiplex/Extenso de base nica (do ingls single base extension), com a principal finalidade de constatar eventuais associaes entre polimorfismos de base nica, gentipos multilocus, e dados clnicos e demogrficos da infeco. Sessenta e seis espcimes pulmonares, previamente considerados positivos para P. jirovecii, obtidos entre 2001 e 2012, a partir de doentes portugueses imunocomprometidos, foram seleccionados de forma aleatria para este estudo multilocus. PCR multiplex foi utilizada para a amplificao simultnea de trs regies genmicas: subunidade grande do rRNA mitocondrial, superxido dismutase e dihidropteroato sintetase. Cinco polimorfismos de base nica, previamente correlacionados com parmetros da doena, foram genotipados por extenso de base nica: mt85, SOD110, SOD215, DHPS165 e DHPS171. Um total de 330 polimorfismos de base nica e 29 gentipos multilocus putativos de P. jirovecii foram identificados e caracterizados nos espcimes pulmonares analisados. Os padres de distribuio dos polimorfismos foram analisados, sendo considerada a variao temporal e/ou geogrfica das suas formas allicas. Constatou-se grande diversidade genotpica entre os isolados de P. jirovecii que poder ter influncia a nvel epidemiolgico. Foram observadas associaes estatsticas entre mt85/gentipos multilocus e parmetros demogrficos e clnicos. A correlao mais importante verificou-se entre mt85C e cargas parasitrias baixas a moderadas, enquanto mt85T foi associado com cargas parasitrias altas; MLG5, MLG9 e MLG13 foram associados com cargas parasitrias baixas, moderadas e altas, respectivamente. Tais associaes demonstram que potenciais marcadores moleculares da infeco por P. jirovecii podero existir e que polimorfismos/gentipos especficos podero determinar perfis epidemiolgicos da pneumonia por Pneumocystis. A anlise gentica cruzada permitiu verificar associaes entre polimorfismos de base nica. Os polimorfismos SOD110T e SOD215C, SOD110C e SOD215T, DHPS165A e DHPS171C, DHPS165G e DHPS171T foram associados estatisticamente. Os gentipos multilocus mais prevalentes foram considerados para o teste recombinatrio d1. Dois gentipos multilocus (MLG7 e MLG9) foram observados com elevada frequncia, e a anlise gentica indicou que estes se encontravam sobre-representados na populao de P. jirovecii estudada. Estas evidncias indicam que o fenmeno de desequilbrio de ligao e a propagao clonal de subtipos genticos frequente, considerando que a espcie P. jirovecii poder ser representada por uma populao com estrutura epidmica. O presente trabalho confirmou a importncia do estudo de polimorfismos em P. jirovecii, sugerindo que a caracterizao multilocus poder fornecer informao relevante para a compreenso dos padres, causas e controlo da infeco, melhorando assim a investigao deste importante patogneo.
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Mycobacterium avium Complex (MAC) comprises microorganisms that affect a wide range of animals including humans. The most relevant are Mycobacterium avium subspecies hominissuis (Mah) with a high impact on public health affecting mainly immunocompromised individuals and Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Map) causing paratuberculosis in animals with a high economic impact worldwide. In this work, we characterized 28 human and 67 porcine Mah isolates and evaluated the relationship among them by Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis (MLVA). We concluded that Mah population presented a high genetic diversity and no correlations were inferred based on geographical origin, host or biological sample. For the first time in Portugal Map strains, from asymptomatic bovine faecal samples were isolated highlighting the need of more reliable and rapid diagnostic methods for Map direct detection. Therefore, we developed an IS900 nested real time PCR with high sensitivity and specificity associated with optimized DNA extraction methodologies for faecal and milk samples. We detected 83% of 155 faecal samples from goats, cattle and sheep, and 26% of 98 milk samples from cattle, positive for Map IS900 nested real time PCR. A novel SNPs (single nucleotide polymorphisms) assay to Map characterization based on a Whole Genome Sequencing analysis was developed to elucidate the genetic relationship between strains. Based on sequential detection of 14 SNPs and on a decision tree we were able to differentiate 14 phylogenetic groups with a higher discriminatory power compared to other typing methods. A pigmented Map strain was isolated and characterized evidencing for the first time to our knowledge the existence of pigmented Type C strains. With this work, we intended to improve the ante mortem direct molecular detection of Map, to conscientiously aware for the existence of Map animal infections widespread in Portugal and to contribute to the improvement of Map and Mah epidemiological studies.
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As leveduras da espcie Candida albicans so comensais do ser humano, podendo em certos casos, como a toma prolongada de antibiticos de largo espectro, a diminuio da imunidade, ou a quimioterapia, causar infeces severas. Estas infeces classificam-se em superficiais ou sistmicas, consoante a zona anatmica ou os rgos afectados. As infeces hospitalares por fungos, nomeadamente as causadas por C. albicans, tm vindo a aumentar nos ltimos anos, assim como a mortalidade e a morbilidade associadas, e ainda os custos relacionados com os cuidados de sade. Torna-se por isso importante a implementao de teraputica de uma forma rpida, eficaz e correcta. Assim, imperativo que os laboratrios de microbiologia clnica possuam mtodos de diagnstico rpidos, simples e econmicos em relao a uma correcta identificao ao nvel de espcie e em relao ao estudo da sensibilidade aos antifngicos. Contudo, esta identificao ao nvel de espcie no permite averiguar a origem das infeces, facto importante para a compreenso da evoluo das infeces nosocomiais. Para tal, necessrio realizar um estudo ao nvel de estirpe atravs de mtodos moleculares que permitam fazer a distino acurada entre isolados de C. albicans. Os mtodos moleculares tm vindo a desenvolver um papel importante no diagnstico de infeces: so rpidos, sensveis, precisos e possuem a vantagem de se poder trabalhar pequenas quantidades de amostra. Tm no entanto a desvantagem de ser mtodos caros, por vezes demasiado elaborados para serem institudos num laboratrio de microbiologia clnica com grande volume de amostras dirias. O principal objectivo deste trabalho consistiu na diferenciao de estirpes de C. albicans atravs de uma metodologia molecular inovadora, nunca antes efectuada no ocidente, simples e rpida, por meio de simples amplificaes por PCR. Para tal, foram seleccionados 60 isolados clnicos de leveduras obtidas a partir de amostras clnicas de trs localidades: Covilh (Centro Hospitalar Cova de Beira, E.P.E) Lisboa (Instituto Portugus de Oncologia e Hospital de Santa Maria, E.P.E) e Viseu (Hospital de So Teotnio). O trabalho baseou-se na genotipagem de isolados clnicos de C. albicans por amplificao por PCR com primers dirigidos s sequncias 25S rDNA e s regies ALT das sequncias RPS. Foi possvel a sua diferenciao e distino em estirpes, fazendo deste mtodo um bom recurso para estudos epidemiolgicos. Realizou-se ainda um estudo de sensibilidade in vitro das estirpes de C. albicans ao antifngicos Fluconazol e Voriconazol pelo mtodo de difuso em disco, segundo os procedimentos padronizados e publicados pelo CLSI. Atravs deste estudo foi verificada elevada susceptibilidade aos antifngicos estudados. Com este trabalho conclui-se que a diferenciao ao nvel de estirpe muito importante para compreender padres de surtos de infeces e ainda para averiguar a origem, endgena ou exgena, destas infeces nosocomiais. Como tal, este estudo epidemiolgico torna-se essencial para definir um controlo mais rigoroso das infeces.
Resumo:
As alergias alimentares so um grande problema de sade pblica a nvel mundial, que ocorre em todas as faixas etrias, tendo maior incidncia em crianas. Mediada pelo sistema imunitrio, a alergia alimentar uma reao adversa que ocorre devido presena de alergnios alimentares, que so identificados erroneamente como sendo um perigo ao organismo. Como uma patologia que no possui cura, a preveno a melhor forma de evitar que ocorram reaes alrgicas em indivduos sensveis, sendo a rotulagem um componente indispensvel para a identificao dos alergnios presentes nos alimentos. Dentro dos mtodos utilizados para a deteo de alergnios est a Reao em Cadeia da Polimerase em tempo real (PCR em tempo real), que capaz de identificar o gene que codifica a protena alergnica. Este mtodo possui elevada sensibilidade e especificidade, sendo atualmente utilizado na rea alimentar para a deteo de organismos genticamente modificados e alergnios. Devido a uma grande procura de clientes e consumidores, para identificao de alergnios em alimentos, o objetivo do presente trabalho foi implementar e validar, a partir de anlises de sensibilidade, preciso e robustez, o mtodo de PCR em tempo real. Dessa forma, foi testada a deteo qualitativa de oito alergnios em alimentos, sendo estes o aipo, amendoim, avel, caju, noz, pistchio, ssamo e soja, no Laboratrio da SGS - Socit Gnrale de Surveillance. Destes alergnios, foi possvel a validao de sete, demonstrando que o mtodo de PCR em tempo real, para os presentes alergnios, possui elevada preciso e sensibilidade nos resultados obtidos.
