Implementação de métodos moleculares para o diagnóstico precoce de leptospirose humana

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia

Em Portugal, estudos recentes têm evidenciado um aumento da incidência da Leptospirose, particularmente, no Arquipélago dos Açores (11,1 casos/100.000 habitantes), onde representa um problema emergente de Saúde Pública. O diagnóstico laboratorial baseia-se na detecção de anticorpos anti-Leptospira interrogans sensu lato pela Técnica de Aglutinação Microscópica (TAM). Contudo, a ausência de aglutininas detectáveis nos dois a três primeiros dias da doença, obriga ao recurso a métodos moleculares susceptíveis de um diagnóstico mais precoce. Com o objectivo de implementar uma técnica de PCR passível de contribuir para o diagnóstico precoce da Leptospirose, analisaram-se 164 soros de doentes com suspeita de infecção por Leptospira e uma evolução clínica de um a sete dias. Utilizando quatro protocolos diferentes, como segue: um PCR convencional com os primers G1-G2 (gene secY conservado entre leptospiras patogénicas, excepto em L. kirschneri), a par de um novo PCR convencional e de um nested-PCR com os primers A-lipL21 e U-lipL21 (gene lipL21) e A-lipL32 (gene lipL32), respectivamente, baseados em genes codificantes de proteínas da membrana externa de leptospiras patogénicas. Todas as amostras foram igualmente testadas pela TAM. Os resultados dos nested-PCR (gene lipL32) evidenciaram DNA leptospírico em 127 (77,4%) das 164 amostras analisadas, enquanto que os PCR‟s com os primers G1-G2 e U-lipL21 detectaram 20 (12,2%) e 11 (6,7%) soros positivos, respectivamente. A TAM mostrou reactividade positiva em 22 (13,4%) dos doentes. A aplicação do nested-PCR confirmou um valor diagnóstico muito significativo (p<0,001), na fase inicial da doença, quando comparado com a técnica de referência (TAM). A presente investigação constituiu, assim, um contributo relevante para o diagnóstico precoce da Leptospirose, cuja evolução clínica se pode traduzir em complicações muito graves e, por vezes, com um desfecho fatal, na ausência de um diagnóstico em tempo útil.