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Dissertação apresentada para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Sociologia do Território, da Cidade e do Ambiente

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Relatório de Estágio apresentado para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Ensino de Inglês e de Língua Estrangeira (Espanhol) no 3.º Ciclo do Ensino Básico e no Ensino Secundário

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Avaliação das propriedades antioxidantes e antimutagénicas de diferentes cultivares de Vaccinium spp, do grupo “Southern Highbush”, produzidas em Portugal

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Tecnologia e Segurança Alimentar

O2/CO2-sensitive cyclic AMP-signalling pathway in peripheral chemoreceptors

RESUMO: O corpo carotídeo (CB) é um pequeno órgão sensível a variações na PaO2, PaCO2 e pH. As células tipo I (células glómicas) do corpo carotídeo, as unidades sensoriais deste órgão, libertam neurotransmissores em resposta às variações dos gases arteriais. Estes neurotransmissores atuam quer em recetores pré-sinápticos, localizados nas células tipo I, quer em recetores póssinápticos, localizados nas terminações do nervo do seio carotídeo, ou em ambos. A activação dos recetores pré-sinápticos modula a atividade do corpo carotídeo, enquanto que, a activação dos recetores pós-sinápticos, de carater excitatório, desencadeia um aumento da frequência de descarga das fibras do CSN, com subsequente despolarização dos neurónios do gânglio petroso, e posterior despolarização de um grupo específico de neurónios do centro respiratório central, desencadeando, como resposta final, hiperventilação. Estes recetores pré- e pós-sinápticos podem ser classificados em ionotrópicos ou metabotrópicos, estando os últimos acoplados a adenilatos ciclases transmembranares (tmAC). O mecanismo exato pelo qual as variações dos gases arteriais são detetadas pelo CB não se encontra ainda completamente elucidado, mas tem sido sugerido que alterações nos níveis de cAMP estejam associadas ao mecanismo de deteção de variações de O2 e CO2. Os níveis de cAMP podem ser regulados através da sua via de síntese, mediada por dois tipos de adenilatos ciclases: tmAC sensível aos eurotransmissores e adenilato ciclase solúvel (sAC)sensível a variações de HCO3/CO2, e pela sua via de degradação mediada por fosfodiesterases. A via de degradação do cAMP pode ser manipulada farmacologicamente, funcionando enquanto alvo terapêutico para o tratamento de patologias do foro respiratório (e.g. asma, hipertensão pulmonar, doença pulmonar obstructiva crónica e apneia do sono), que induzem um aumento da actividade do CB.O trabalho descrito nesta dissertação partiu da hipótese de que a actividade do CB é manipulada por fármacos, que interferem com a via de sinalização do cAMP, tendo sido nosso objectivo geral, investigar o papel do cAMP na quimiotransdução do CB de rato, e determinar se a actividade dos enzimas responsáveis pela via de sinalização do cAMP é ou não regulada por variações de O2/CO2. Assim, a relevância deste trabalho é a de estudar e identificar possíveis alvos moleculares (sAC, isoformas de tmAC e PDE) com potencial para serem usados no tratamento de patologias relacionadas com o controlo respiratório. A primeira parte do presente trabalho, centrou-se na caracterização farmacológica da PDE4 no CB e em tecidos não quimiorecetores (e.g. gânglio cervical superior e artérias carótidas), e na observação do efeito de hipóxia aguda na acumulação dos níveis de cAMP, induzidos pelos inibidores de PDE, nestes tecidos. A quantificação de cAMP foi efectuada por técnica imunoenzimática (EIA), tendo sido elaboradas curvas de dose-resposta para os efeitos de inibidores, não específicos (IBMX) e específicos para a PDE2 e PDE4 (EHNA, Rolipram e Ro 20-1724), nos níveis de cAMP acumulados, em situações de normóxia (20%O2/5%CO2) e hipóxia (5%O2/5%CO2). A caracterização das PDE no gânglio cervical superior foi aprofundada, utilizando-se a técnica de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET) em culturas primárias de neurónios, na presença de inibidores não específicos (IBMX) e específicos para a PDE3 e PDE4 (milrinone e rolipram, respetivamente). Foram igualmente estudadas, através de RT-qPCR, as alterações na expressão de PDE3A-B e PDE4A-D, no gânglio cervical superior, em resposta a diferentes percentagens de oxigénio. Na segunda parte do trabalho investigou-se a via de síntese do cAMP no CB em resposta a variações na concentração de HCO3/CO2. Em concreto, o protocolo experimental centrou-se na caracterização da sAC, dado que a sua actividade é regulada por variações de HCO3/CO2. A caracterização da expressão e regulação da sAC, em resposta a variações de HCO3/CO2 ,foi efectuada no CB e em tecidos não quimioreceptores periféricos (e.g. gânglio cervical superior, petroso e nodoso) por qRT-PCR. A actividade deste enzima foi caracterizada indirectamente através da quantificação dos níveis de cAMP (quantificação por EIA), induzidos por diferentes concentrações de HCO3/CO2, na presença de MDL-12,33-A, um inibidore da tmAC. A expressão das isoformas da tmAC no CB e gânglio petroso foi determinada por RT-qPCR. Adicionalmente, estudámos a contribuição relativa da tmAC e sAC no mecanismo de sensibilidade ao CO2 no CB. Para o efeito foram estudadas as alterações: 1) nos níveis de cAMP (quantificado por EIA) na presença de diferentes concentrações de HCO3/CO2 e ao longo do tempo (5-30 min); 2) na ativação da proteína cinase A (PKA, FRET baseado em sensores) em células tipo I do CB; e 3) na frequência de descarga do CSN (registos) na presença e ausência de ativadores e inibidores da sAC,tmAC e PKA. Por último, foi caracterizada a expressão e actividade da sAC nos quimioreceptors centrais (locus ceruleus, rafe e medula ventro-lateral) através de técnicas de RT-qPCR e EIA. A expressão das isoformas da tmAC foi aprofundada no locus coeruleus através de RT-qPCR. Por fim, comparámos a contribuição da tmAC e sAC nos níveis de cAMP no locus coeruleus em condições de normocapnia e hipercapnia.O nosso trabalho teve os seguintes resultados principais: 1) PDE4 está funcional no corpo carotídeo, artérias carótidas e gânglio cervical superior de rato, embora a PDE2 só se encontre funcional neste último; 2) Os efeitos dos inibidores de PDE nos níveis de acumulação de cAMP foram exacerbados em situações de hipóxia aguda no CB e artérias carótidas, mas foram atenuados no gânglio cervical superior; 3) No gânglio cervical superior, diferentes tipos de células apresentaram uma caracterização específica de PDEs, sugerindo uma subpopulação de células neste gânglio com funções fisiológicas distintas; 4) Embora todas as isoformas de PDE4 e PDE3 estivessem presentes no gânglio, a PDE3a, PDE4b e a PDE4d foram as isoformas mais expressas. Por outro lado, incubações de gânglio cervical superior, em diferentes percentagens de oxigénio, não alteraram (não regularam) significativamente a expressão das diferentes isoformas de PDE neste órgão; 5) a sAC encontra-se expressa e funcional no CB e nos quimiorecetores centrais estudados (locus coeruleus, rafe e medula ventrolateral). A sAC apresenta maior expressão no CB comparativamente aos restantes orgãos estudados, exceptuando os testículos, orgão controlo. Variações de HCO3/CO2 de 0/0 para 24/5 aumentaram os níveis de cAMP no CB e quimiorecetores centrais, tendo sido o aumento mais significativo observado no CB. Concentrações acima dos 24mM HCO3/5%CO2 não induziram alterações nos níveis de cAMP, sugerindo que a actividade da sAC se encontra saturada em condições fisiológicas (normocapnia) e que este enzima não desempenha qualquer papel na deteção de situações de hipercapnia; 6) No CB, a expressão das isoformas tmAC1, tmAC4, tmAC6 e tmAC9 é mais elevada comparativamente à expressão da sAC; 7) Utilizamos diferentes inibidores da tmAC (MDL 12-330A, 500μM, 2’5’-ddADO, 30-300μM, SQ 22536, 200μM) e da sAC (KH7, 10-100μM) para estudar a contribuição relativa destes enzimas na acumulação do cAMP no CB. Tanto a tmAC como a sAC contribuem para a acumulação dos níveis de cAMP em condições de hipercapnia. Contudo, existe um maior efeito destes inibidores nas condições de 12 mM HCO3/2.5%CO2 do que em condições de normocapnia e hipercapnia, sugerindo um papel relevante destes enzimas na atividade do CB em situações de hipocapnia; 8) Não se observaram variações nos níveis de cAMP em resposta a diferentes concentrações de HCO3/CO2 ao longo do tempo (5-30 min). O efeito inibitório induzido por ddADO e KH7 foi sobreponível após 5 ou 30 minutos de incubação em todas as concentrações de HCO3/CO2 estudadas; 9) Por último, verificou-se um aumento na frequência da descarga do nervo do seio carotídeo entre as condições de normocapnia e hipercapnia acídica. Ao contrário do KH7 (10μM), o 2’5’-ddADO reduziu significativamente a frequência de descarga do nervo, quer em condições de normocapnia quer de hipercapnia acídica. Contudo, não se verificou aumento na frequência de descarga do nervo entre normocapnia e hipercapnia isohídrica, sugerindo que a sensibilidade à hipercapnia no CB é mediada por variações de pH. Em conclusão, os resultados decorrentes deste trabalho permitiram demonstrar que, embora os enzimas que medeiam a via de sinalização do cAMP possam ser bons alvos terapêuticos em condições particulares, a sua actividade não é específica para o CB. Os resultados sugerem ainda que o cAMP não é um mediador específico da transdução à hipercapnia neste orgão. Contudo, os nossos resultados demonstraram que os níveis de cAMP são mais elevados em condições fisiológicas, o que sugere que o cAMP possa ter uma função homeostática neste orgão. Por último, o presente trabalho demonstrou que os aumentos de cAMP descritos por outros em condições de hipercapnia, não são observáveis quando o pH se encontra controlado. ------------------ ABSTRACT: The work presented in this dissertation was aimed to establish how specific is cAMP-signaling pathways in the CB mainly in different CO2 conditions and how O2 concentrations alter/drives the manipulation of cAMP signaling in the CB. The experimental studies included in this thesis sought to investigate the role of cAMP in the rat CB chemotransduction mechanisms and to determine whether the enzymes that participate in cAMP signal transduction in the CB are regulated by O2/CO2. We characterized the enzymes involved in the cAMP-signaling pathway in the CB (sAC, tmAC, PDE) under different O2/CO2 conditions. Our results demonstrated that many of these enzymes are involved in CO2/O2 sensing and while they may be useful in treating conditions with alterations in CO2/O2 sensing,they will not be specific to chemoreception within the CB: 1) PDE4 is ubiquitously expressed in CB and non-chemoreceptor related tissues and their affinity to inhibitors change with O2 tensions in both CB and carotid arteries, and 2) sAC and tmAC are expressed in peripheral and central chemo- and non-chemoreceptor tissues and their effect on cAMP levels do not change between normocapnic and isohydric hypercapnic conditions. Our results provide evidence against a specific role of cAMP as a mediator for O2 and CO2 chemotransduction in the rat CB and emphasized the role of pH in CO2 sensitivity of the CB. Furthermore, our results demonstrate that cAMP levels are maintained higher under physiological conditions, supporting recent finding from our lab, which all together suggests that cAMP has a homeostatic function in this organ.

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Dissertação de Mestrado em Ciências Musicais - Etnomusicologia

Caraterização estatística dos valores percentuais de sangue do grupo AB0 colhido pelo Centro Regional de Sangue de Lisboa e respetivo emparelhamento com a distribuição a nível hospitalar

RESUMO: A Medicina Transfusional está a mudar rapidamente em resposta a um número de diferentes catástrofes, patologias e novas técnicas da ciência. Por detrás de uma transfusão de sangue existe todo um conjunto de procedimentos, técnicas e atuações que salvaguardam o rigor e segurança científicas resultando numa maior eficiência na diminuição da morbilidade/mortalidade humana. Todo o processo de colheita, análise, processamento e distribuição de concentrados de eritrócitos comporta um capital elevado em termos da economia para a saúde e os requisitos básicos de uma gestão de qualidade, na área da saúde em geral e da hemoterapia em particular, tem de compreender, com rigor, estas condições de gestão parceria de forma a evitar um aumento nos custos da saúde. Para identificar as discrepâncias nos pedidos efetuados pelos Hospitais Públicos e Privados ao Centro de Sangue e Transplantação de Lisboa, no que diz respeito ao Sistema AB0 dos concentrados de Eritrócitos, foi feito um estudo quantitativo, com fins descritivos simples, aos 95 984 concentrados de eritrócitos enviados às 32 Instituições de Saúde da abrangência do CST de Lisboa. Tendo em conta o Sistema AB0 RhD, confirma-se que o grupo sanguíneo prevalente, tanto na população portuguesa como nos dadores de sangue que efetuaram a sua dádiva de sangue em 2011, é o grupo A Rh+. Observou-se no entanto que o grupo sanguíneo mais pedido e enviado pertence ao grupo 0 Rh positivo. Assim, apurou-se que existe uma disparidade, mesmo que pouco acentuada, nos pedidos efetuados pelos Hospitais Públicos e Privados ao Centro de Sangue e Transplantação de Lisboa no que configura ao Sistema AB0 dos concentrados de eritrócitos. Os Hospitais Públicos Sem Serviço de Colheita de Sangue e os Hospitais Privados são responsáveis por este desencontro de valores. No que se refere às inutilizações por prazo de validade ressalva-se que os desaproveitamentos de CE’s não são tão acentuados como se esperaria numa primeira fase de estudo. No entanto, e em termos económicos, se existem inutilizações por prazo de validade, existe igualmente despojo financeiro. Por detrás de cada unidade inutilizada existe um alto investimento que será desperdiçado por carência de solicitação. De forma a minimizar gastos e a salvaguardar um Banco de Sangue capaz de suportar qualquer eventualidade de rutura de stock estão patentes propostas de estratégias capazes de impedir constrangimentos diários e futuros no que diz respeito à disponibilidade de sangue e componentes sanguíneos.--------------ABSTRACT: The Transfusion Medicine it is changing fast in response to a number of different catastrophes, disease and new techniques of science. From behind a blood transfusion there is a whole set of procedures, techniques and actions that safeguard the safety and scientific rigor resulting in greater efficiency in reducing morbidity / mortality human. The entire process of procurement, testing, processing and distribution of concentrated erythrocytes involves a high capital in terms of the economy to health and the basic requirements of a quality management in healthcare in general and hemotherapy in particular has to understand with rigor, this partnership in order to avoid an increase in health costs. In order to identify discrepancies in the orders placed by the Government and Private Hospitals Center Blood and Transplant Lisbon regarding the AB0 system of concentrated erythrocytes was made a quantitative study with simple descriptive purposes to 95,984 erythrocytes concentrates sent to 32 Health Institutions of the scope of CST Lisbon. Having regard to the system AB0 blood group RhD prevalent both in the Portuguese population as blood donors, who made his blood donation in 2011, confirms that belong to group A Rh +. It was found that blood group most requested and sent belongs to group 0 Rh positive. Thus, it was found that there is a disparity, even a little sharp, requests made by the Government and Private Hospitals Blood Center and Transplantation in Lisbon that configures the system AB0 erythrocyte concentrates. The Public Hospitals without Blood Harvest and Private Hospitals are responsible for this clash of values. With regard the expiry date by disables proviso that the wastes of CE's are not as sharp as one would expect in a first phase of the study. However, in economic terms, if there is disables by expiry date, there is also financial squandering. Behind every unused unit is a high investment to be wasted by shortage of request. To minimize costs and safeguarding a Blood Bank can support any event of rupture of stock patents are proposed strategies to prevent future and diaries constraints with regard to the availability of blood and blood components.

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