Desenvolvimento de fármacos: melhoria do desempenho de princípios farmacologicamente ativos por síntese supramolecular

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Bioorgânica

O corpo sem orgãos da arquitectura

Tese apresentada para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em Filosofia (área de especialização: Estética)

Moluscos hospedeiros intermediários de tremátodes: Estudo molecular de helisoma sp. (Gastropoda: planorbidae) de diferentes áreas geográficas

Ao longo dos tempos a caracterização das diferentes espécies da classe Gastropoda baseava-se apenas em características fenotípicas (morfologia da concha e partes moles), as quais eram insuficientes para distinguir espécies e subespécies. Assim, a caracterização genética desenvolvida nos últimos anos, tem-se mostrado uma boa ferramenta aplicada á diferenciação molecular de espécies, permitindo uma melhor compreensão sobre moluscos com um importante papel como hospedeiros intermediários de tremátodes e qual a sua posição dentro da família Planorbidae. Os objectivos deste trabalho foram, por um lado fazer um estudo comparativo de populações de Helisoma sp., de Portugal e Cabo Verde, baseado num estudo molecular utilizando marcadores moleculares, nomeadamente o gene COI do DNA mitocondrial (mtDNA) e o gene 16S do RNA ribossomal (rRNA) e a região interna transcrita (ITS) do DNA ribossomal, e recorrendo à técnica PCR-RFLP, direccionada para a região ITS para a identificação de possíveis polimorfismos e, por outro lado estabelecer uma relação filogenética entre as populações portuguesas e cabo verdianas de Helisoma e outros planorbideos, hospedeiros intermediários de tremátodes. Os resultados obtidos, para os genes em análise permitiram a identificação de três regiões distintas: Cabo Verde, Madeira e Portugal Continental, esta última formada pelas amostras de Algarve e Coimbra, apesar da distante geográfica que separa cada umas destas duas áreas. Os resultados obtidos para os genes COI e 16S e para a região ITS, mostraram uma elevada homologia com as espécies Helisoma trivolvis e H. duryi.

New roles of Rab GTPases on eye diseases: targeting VEGF secretion

RESUMO: A retina é composta, entre outras estruturas, pelo epitélio pigmentar da retina (EPR)e pela coróide. A região central da retina denomina-se mácula, e é a zona mais afetada na degenerescência macular relacionada com a idade, a forma mais comum de degenerescência da retina. Nesta doença, a secreção de fatores de crescimento pelo EPR é afetada, nomeadamente a do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), e pouco se sabe ainda sobre os mecanismos moleculares conducentes a esta condição. A família de proteínas Rab GTPases está envolvida nas vias intracelulares de sinalização e tráfego membranares, essenciais na transdução de sinais extracelulares em respostas biológicas. A sua crucial importância nestes mecanismos levou-nos a considerar o seu potencial envolvimento nas vias de secreção do VEGF, e a questionar-nos se teriam algum papel regulador sobre as mesmas. O principal objetivo deste trabalho é identificar Rab GTPases importantes para as vias de secreção e endocitose do VEGF no EPR. Essa identificação ajudará a esclarecer a patogénese da degenerescência macular da retina, e poderá servir para uma procura mais direcionada de novos agentes terapêuticos. A caracterização de dois modelos in vitro do EPR, células primárias isoladas de murganho e a linha celular B6-RPE07,levou-nos a concluir que são ambos semelhantes. Contudo, a linha celular foi escolhida como protótipo do EPR por permitir o acesso a um número ilimitado de células. No decurso deste trabalho, desenvolvemos e caracterizámos uma biblioteca de ferramentas moleculares que nos permitiram reduzir os níveis proteicos das proteínas Rab GTPases, com base na tecnologia de ácido ribonucleico (ARN) de interferência. O papel das proteínas Rab GTPases na secreção do VEGF no EPR foi estudado com base no silenciamento de apenas uma proteína, ou combinando várias, segundo a sua localização e funções intracelulares descritas. Este trabalho permitiu-nos concluir que as proteínas Rab GTPases são importantes intervenientes no processo de secreção de VEGF pelo EPR, e confirmar dados anteriores que relatam o envolvimento de algumas Rab GTPases endocíticas no processo. Propomos ainda um novo modelo para a interação destas proteínas no EPR, e sugerimos que a Rab10 e a Rab14 atuam negativamente sobre a Rab8, controlando o seu funcionamento. Os nossos resultados evidenciam a importância das proteínas Rab GTPases na secreção do VEGF pelas células do EPR, e servem de base a futuros estudos que melhor procurem compreender este mecanismo e de que modo a sua alteração se relaciona com a degenerescência da retina.--------ABSTRACT: Retinal pigment epithelium (RPE) and choroid are components of the mammalian retina, of which the central region is called macula. The most common form of retinaldegeneration, age-related macular degeneration (AMD), involves primarily deregulation of growth factors secretion by the RPE. Very little is known about the molecular mechanisms that lead to impairment of RPE’s homeostatic intracellular processes, namely the secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF). Rab GTPases’ family regulates membrane targeting and traffic, being essential in the transduction of signal pathways. Given Rab proteins’ role in intracellular trafficking, we propose to identify key regulatory Rab proteins involved in either the secretory or the recycling pathways of VEGF in RPE. Understanding how Rab proteins’ function disruption could lead to retinal and choroidal pathology would ultimately contribute to find new therapeutic agents. Here, we characterized two mouse RPE in vitro cell models, primary cells and B6-RPE07 cell line, and concluded that both display important epithelial features as the RPE presents in vivo. Considering unlimited cell number and results reproducibility, we chose B6-RPE07 cells to further study Rab proteins’ function. To scrutinize the consequences of Rab proteins’ absence or diminished levels, we have developed novel molecular tools to achieve silencing of these key proteins using miRNA technology. We further addressed the effect of Rab proteins’ absence on VEGF secretion by performing an extensive screening where different Rab proteins were silenced, both individually and in multiple combinations considering their cellular/ compartment location. We conclude that Rab GTPases are important intervenients in VEGF secretion by RPE cells, confirming endocytic Rab proteins’ role in regulation of VEGF biology. We also propose a novel model for Rab proteins’ interaction in RPE. Our results suggest that Rab10 and Rab14 might influence Rab8 in a negative feedback mechanism, important for controlling VEGF secretion. Our achievements’ unravel Rab proteins’ role in VEGF secretion by RPE cells and are the basis for future studies to better understand RPE molecular secretory machinery.

Epidemiovigilância das infeções por Leishmania spp. no efetivo cinotécnico da Guarda Nacional Republicana e em mesocarnívoros silvestres

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Estudo dos genes DICER1 e C8orf48 em formas familiares de bócio multinodular e cancro da tiróide

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Caracterização funcional das aquaporinas-3 e 7 de mamífero por expressão heteróloga em leveduras

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Bioquímica Estrutural e Funcional

Contribuição para o conhecimento da Leptospirose humana na região do Lobito (Angola): aplicação de métodos de diagnóstico serológico e molecular

A Leptospirose é um problema emergente na Saúde Pública, devido às suas proporções epidemiológicas e pelo aumento da incidência da doença em países industrializados e em desenvolvimento (Meites et al., 2004). A doença tem uma ampla distribuição geográfica e ocorre com maior frequência nas zonas tropicais, subtropicais e temperadas (Vijayachari et al., 2008). Contudo, em algumas regiões desconhece-se a verdadeira prevalência, sendo reportada através de surtos esporádicos (Pappas et al., 2007). As manifestações clínicas inespecíficas da infecção podem ser subdiagnosticadas nas regiões tropicais, onde as doenças febris são comuns e onde podem ser confundidas com doenças mais conhecidas como a Malária, Hepatite Viral, Dengue e outras. Em Angola, o diagnóstico é realizado apenas através da história do paciente e suspeita clínica, dando origem a diagnósticos pouco precisos. Deste modo, é importante o uso de métodos laboratoriais, especialmente testes serológicos específicos, para a confirmação do diagnóstico clínico (Levett, 2001). O objectivo principal deste estudo foi investigar a ocorrência de Leptospirose humana em Lobito (Província de Benguela) e identificar os serovares circulantes de Leptospira interrogans sensu lato (s.l.), utilizando técnicas serológicas e moleculares. Entre Abril e Junho de 2011, após o necessário consentimento informado, fez-se um inquérito clínico-epidemiológico a 141 pacientes (64 homens e 77 mulheres) assistidos no Hospital Geral do Lobito, por cefaleias e febre com diagnóstico desconhecido, dos quais se colheram 141 amostras séricas e 36 amostras de urina. A avaliação serológica foi inicialmente feita no laboratório local através da Técnica de Aglutinação Macroscópica sobre Lâmina (MACROLepto) – teste de rastreio - e, posteriormente confirmada pela Técnica de Aglutinação Microscópica (TAM) - teste de referência - realizado no Laboratório de Leptospirose (IHMT, em Lisboa). Para a detecção de DNA de Leptospira utilizou-se a Reacção da Polimerase em Cadeia (PCR) com primers baseados no gene hap 1. Procedeu-se ainda à sequenciação dos produtos da PCR. As principais manifestações clínicas foram: cefaleias (73,8%), febre (65,2%), mialgias (41,1%) e náuseas (33,3%). Dos dados epidemiológicos observou-se que 131 dos pacientes tiveram contacto com os principais reservatórios de leptospiras, os roedores, e 76 ingeriram água não potável. Os resultados serológicos revelaram no teste MACROLepto: 14 (10%) amostras positivas e 18 (13%) não-conclusivas, sendo os serogrupos Icterohaemorrhagiae (Copenhageni), Australis (Bratislava) e Sejroe os mais comuns. Destas amostras, cinco, foram confirmadas pela TAM (presença de aglutininas anti – L. interrogans s.l.). Paralelamente, o DNA de Leptospira foi detectado em 13+/81 (16%) das amostras séricas e numa amostra de urina. A sequenciação identificou os serovares Copenhageni e Lai, ambos pertencentes ao serogrupo Icterohaemorrhagiae da espécie genómica L. interrogans. Os resultados obtidos mostraram que a maioria dos pacientes, mesmo aqueles que praticavam actividades de menor risco epidemiológico, tiveram contacto com roedores e com águas não potáveis. O estudo também provou que a Leptospirose afectou sobretudo as mulheres adultas, admitindo-se que este achado possa ser comum noutras regiões do País. Por último, ficou demonstrada a existência de Leptospirose na região, o que poderá contribuir para a inclusão da doença na lista de doenças febris em Angola e noutros países tropicais.

Resistência a insecticidas em Anopheles gambiae s.l. na Região de Luanda, Angola

Em Angola, a malária é a principal causa de morbilidade e de mortalidade infantil. O controlo de vectores com recurso aos insecticidas representa uma parte importante da estratégia actual para a prevenção da doença. Em Anopheles gambiae s.s., principal vector de malária em África, estão identificadas duas mutações pontuais no gene que codifica os canais de sódio das membranas das células do sistema nervoso, conferindo resistência knockdown (kdr) aos insecticidas piretróides e ao DDT. Também se encontra descrita para esta espécie uma mutação no gene acetilcolinesterase-1 (ace-1), associada à resistência a carbamatos e organofosfatos. Este trabalho teve como principal objectivo avaliar o nível de resistência aos insecticidas em An. gambiae da província de Luanda, Angola e determinar a frequência destas mutações. Foram realizadas colheitas entomológicas em 2009 e 2010, através da prospeção de criadouros larvares. Os insectos capturados foram criados até a emergência do adulto e sujeitos a ensaios de susceptibilidade a insecticidas, através de testes da OMS. A identificação de espécies e formas moleculares do complexo An. gambiae, bem como a pesquisa de mutações no gene ace-1 foram feitas por PCR-RFLP. A pesquisa de mutações no gene kdr foi realizada por PIRA-PCR. Amostras selecionadas de mosquitos (incluindo uma amostra proveniente de uma colheita de adultos) foram ainda genotipadas para 11 loci microssatélites. Os níveis de resistência para a permetrina, DDT e -cialotrina foram elevados, com taxas de mortalidade inferiores a 70% em ambos os anos. Em contraste, as taxas de mortalidade foram sempre acima de 98% para bendiocarb e fenitrotião, indicadoras de susceptibilidade a estes insecticidas. Todas as amostras processadas foram identificadas como An. gambiae s.s., forma molecular M e não se observou a mutação no gene ace-1 associada à resistência. Em ambos os anos, foi detectada apenas a mutação L1014F no locus kdr e a frequência do alelo mutante (TTT) foi bastante elevada. Em 2009, observou-se uma associação entre genótipos homozigóticos para o alelo 1014F e o fenótipo resistente, para os insecticidas piretróides e para o DDT. O polimorfismo dos loci microssatélites analisados foi elevado, com a riqueza alélica a variar entre 5 (45C1) e 20 (H128) e a heterozigotia esperada entre 0,529 (H577) e 0,862 (H249). A análise genética não revelou um grau de parentesco entre os indivíduos que constituíram as amostras estudadas. Este resultado sugere que os elevados níveis de resistência observados não foram influenciados pelo método de colheita de mosquitos que, em certas condições, poderia contribuir para a amostragem de indivíduos aparentados.

Tipagem molecular de isolados clínicos e ambientais do complexo de espécies de Cryptococcus neoformans através do gene fosfolipase B(PLB1) e avaliação da susceptibilidade antifúngica

Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada, presente em animais e humanos, que infecta tanto indivíduos imunocomprometidos como imunocompetentes. A criptococose é uma causa significativa de morbilidade e mortalidade em todo o mundo, sendo a meningoencefalite o sinal mais frequente da doença. Duas espécies estão incluídas no complexo de Cryptococcus neoformans: C. gattii (serotipos B e C) e C. neoformans. Por sua vez, C. neoformans é dividido em duas grandes variedades - var. grubii (serotipo A) e var. neoformans (serotipo D) –, além de incluir estirpes híbridas (serotipo AD). A técnica de RFLP tem sido usada para identificar facilmente os tipos moleculares dos isolados em estudos epidemiológicos. Oito tipos foram descritos: VNI, VNII (ambos correspondentes a estirpes C. neoformans var. grubii), VNIII (estirpes híbridas AD), VNIV (C. neoformans var. neoformans), e VGI-IV (correspondentes a C. gattii). Este trabalho teve como objectivo, caracterizar geneticamente uma colecção de isolados clínicos e ambientais, portugueses e estrangeiros, e avaliar a sua resistência a duas drogas antifúngicas, permitindo comparar os padrões epidemiológicos do complexo de espécies com os encontrados noutras regiões do mundo. A colecção possui 337 isolados de C. neoformans, provenientes de diversos hospitais e regiões, previamente identificados por métodos convencionais de diagnóstico. A determinação dos tipos moleculares foi realizada através do método de RFLP no gene PLB1. Dos 267 isolados analisados, o tipo mais abundante foi VN I (61,42%), seguido por VN III (24,34%). Menos abundantes foram VN IV (10,11%) e VN II (3%), enquanto que VG I foi raro (1,12%). Os restantes tipos moleculares de C. gattii não foram encontrados. Usando o método de difusão em disco, 98 destes isolados foram analisados quanto à susceptibilidade antifúngica. Foi registada resistência ao voriconazol em apenas 3,1% dos isolados testados. Foi encontrada resistência ao fluconazol num elevado número de isolados (32,7%) e susceptibilidade dependendo da dose em 15,3%. Este trabalho, também teve o intuito de correlacionar os resultados anteriores com o tipo molecular. Todavia não foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre qualquer dos tipos moleculares e as CMIs correspondentes ao fluconazol. Porém, os resultados mostram que alguns tipos moleculares são menos susceptíveis do que outros em relação ao voriconazol: VN I e VN IV são mais resistentes do que VN II, e VN I e VN II são mais susceptíveis que VN III. Concluindo, a elevada frequência de VN I está de acordo com resultados obtidos em outros estudos em países Europeus e Sul-Americanos. É notável a abundância de VN III em Portugal, tal como relatado noutros países do Sul da Europa, mas também no Chile, contrariamente a outras regiões do globo. A elevada resistência ao fluconazol é compatível com os resultados documentados em estudos anteriores. Esta investigação é um importante passo na epidemiologia da criptococose e da ocorrência de C. neoformans em Portugal.

Contribuição para o conhecimento da Leptospirose Humana na Região do Lobito (Angola)

A Leptospirose é um problema emergente na Saúde Pública, devido às suas proporções epidemiológicas e pelo aumento da incidência da doença em países industrializados e em desenvolvimento (Meites et al., 2004). A doença tem uma ampla distribuição geográfica e ocorre com maior frequência nas zonas tropicais, subtropicais e temperadas (Vijayachari et al., 2008). Contudo, em algumas regiões desconhece-se a verdadeira prevalência, sendo reportada através de surtos esporádicos (Pappas et al., 2007). As manifestações clínicas inespecíficas da infecção podem ser subdiagnosticadas nas regiões tropicais, onde as doenças febris são comuns e onde podem ser confundidas com doenças mais conhecidas como a Malária, Hepatite Viral, Dengue e outras. Em Angola, o diagnóstico é realizado apenas através da história do paciente e suspeita clínica, dando origem a diagnósticos pouco precisos. Deste modo, é importante o uso de métodos laboratoriais, especialmente testes serológicos específicos, para a confirmação do diagnóstico clínico (Levett, 2001). O objectivo principal deste estudo foi investigar a ocorrência de Leptospirose humana em Lobito (Província de Benguela) e identificar os serovares circulantes de Leptospira interrogans sensu lato (s.l.), utilizando técnicas serológicas e moleculares. Entre Abril e Junho de 2011, após o necessário consentimento informado, fez-se um inquérito clínico-epidemiológico a 141 pacientes (64 homens e 77 mulheres) assistidos no Hospital Geral do Lobito, por cefaleias e febre com diagnóstico desconhecido, dos quais se colheram 141 amostras séricas e 36 amostras de urina. A avaliação serológica foi inicialmente feita no laboratório local através da Técnica de Aglutinação Macroscópica sobre Lâmina (MACROLepto) – teste de rastreio - e, posteriormente confirmada pela Técnica de Aglutinação Microscópica (TAM) - teste de referência - realizado no Laboratório de Leptospirose (IHMT, em Lisboa). Para a detecção de DNA de Leptospira utilizou-se a Reacção da Polimerase em Cadeia (PCR) com primers baseados no gene hap 1. Procedeu-se ainda à sequenciação dos produtos da PCR. As principais manifestações clínicas foram: cefaleias (73,8%), febre (65,2%), mialgias (41,1%) e náuseas (33,3%). Dos dados epidemiológicos observou-se que 131 dos pacientes tiveram contacto com os principais reservatórios de leptospiras, os roedores, e 76 ingeriram água não potável. Os resultados serológicos revelaram no teste MACROLepto: 14 (10%) amostras positivas e 18 (13%) não-conclusivas, sendo os serogrupos Icterohaemorrhagiae (Copenhageni), Australis (Bratislava) e Sejroe os mais comuns. Destas amostras, cinco, foram confirmadas pela TAM (presença de aglutininas anti – L. interrogans s.l.). Paralelamente, o DNA de Leptospira foi detectado em 13+/81 (16%) das amostras séricas e numa amostra de urina. A sequenciação identificou os serovares Copenhageni e Lai, ambos pertencentes ao serogrupo Icterohaemorrhagiae da espécie genómica L. interrogans. Os resultados obtidos mostraram que a maioria dos pacientes, mesmo aqueles que praticavam actividades de menor risco epidemiológico, tiveram contacto com roedores e com águas não potáveis. O estudo também provou que a Leptospirose afectou sobretudo as mulheres adultas, admitindo-se que este achado possa ser comum noutras regiões do País. Por último, ficou demonstrada a existência de Leptospirose na região, o que poderá contribuir para a inclusão da doença na lista de doenças febris em Angola e noutros países tropicais.

Revisão do género Lavandula presente em Portugal Continental

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Bioquímica

Ultrassonografia torácica : impacto no diagnóstico e estadiamento do cancro do pulmão

RESUMO:RESUMO: Nos últimos anos a ultrassonografia emergiu como um instrumento importante no diagnóstico da patologia torácica. O progresso tecnológico possibilitou a conceção de novos equipamentos como a ecoendoscopia brônquica radial e linear. Verificou-se, igualmente, o aparecimento de indicações para a realização de ecografia transtorácica. Uma das principais doenças impulsionadoras da técnica ultrassonográfica no tórax foi o cancro do pulmão, primeira causa de morte oncológica a nível mundial. A aplicabilidade e conhecimento do papel dos ultrassons no âmbito do diagnóstico e estadiamento do cancro do pulmão não se encontram esgotados, persistindo focos de controvérsia e dúvida científica que se pretendem esclarecer. A presente tese foi organizada em cinco capítulos: o primeiro abordou de forma geral e introdutória o estado da arte referente à ultrassonografia torácica, cancro do pulmão e a sua conjugação; o segundo destacou os principais objetivos; o terceiro sumarizou a metodologia utilizada; o quarto englobou os cinco estudos publicados, descritos subsequentemente, e o quinto incluiu uma discussão concisa, as principais conclusões e perspetivas futuras. O primeiro estudo avaliou a rentabilidade diagnóstica, segurança e curva de aprendizagem num coorte de 179 doentes submetidos a ecoendoscopia brônquica linear. De acordo com as indicações para este procedimento os doentes foram subdivididos em três grupos: (1) diagnóstico, (2) diagnóstico e estadiamento e (3) estadiamento. Para o primeiro, segundo e terceiro grupos a sensibilidade da ecoendoscopia foi 86.1%, 86.7% e 95% respetivamente e a precisão técnica foi 87.5%, 93.1% e 97.7% respetivamente. O treino originou um aumento progressivo do número de locais puncionados por doente, com menor duração e sem complicações, comprovando a eficácia e segurança do método quando realizado na população Portuguesa por broncologistas com experiência. O segundo estudo foi conduzido para averiguar a eficácia e custo da ecoendoscopia brônquica linear realizada através da via aérea e/ou esófago no diagnóstico de lesões sugestivas de neoplasia do pulmão, após ineficácia das técnicas convencionais. Nos doentes incluídos prospetivamente alcançou-se um diagnóstico definitivo em 106 casos (87.6%). A sensibilidade global para o diagnóstico de cancro do pulmão foi 89.8%, a especificidade foi 100%, o valor preditivo positivo foi 100%, o valor preditivo negativo foi 20% e a precisão foi 90.1%. Esta estratégia ultrassonográfica abrangente evitou intervenções cirúrgicas diagnósticas em doentes anteriormente submetidos a broncoscopia flexível ou punção aspirativa transtorácica guiada por tomografia computorizada, proporcionando uma redução significativa dos custos. No terceiro estudo investigou-se a viabilidade e papel da conjugação da ecoendoscopia brônquica linear com técnicas moleculares na avaliação de antigénios tumorais e padrões de metastização ganglionar em doentes com cancro do pulmão de não-pequenas células (CPNPC). Os marcadores citoqueratina 19 (CK-19), antigénio carcinoembrionário (CEA), molécula de adesão celular epitelial (EPCAM), sialyl-Lewis X e CD44 foram determinados nos aspirados ganglionares de 33 doentes com neoplasia e 17 controlos 10 Ultrassonografia através de citometria de fluxo (CF) e reação em cadeia da polimerase em tempo real (RTPCR). Os doentes com CPNPC possuíam um compartimento celular epitelial significativamente aumentado e com marcação superior de CK-19 comparativamente ao grupo de controlo. O compartimento imune foi também analisado nestas amostras e revelou-se alterado no CPNPC com aumento da população de monócitos e diminuição das subpopulações linfocitárias. Os transcriptos de CK-19, CEA e EPCAM estavam elevados nos doentes com cancro do pulmão, identificando-se uma correlação positiva entre estes marcadores e o tamanho da lesão primária. Concluiu-se que a identificação de CK-19, CEA e EPCAM nas amostras obtidas por ecoendoscopia e avaliadas por CF e RTPCR foi viável, podendo auxiliar na deteção de metástases ganglionares no CPNPC. O quarto estudo envolveu a combinação da ecoendoscopia brônquica radial com uma criosonda para o diagnóstico de lesões pulmonares sólidas periféricas. Foi determinada a viabilidade, rentabilidade diagnóstica, tamanho das amostras e segurança do método. Lesões inferiores a 40mm foram localizadas por ultrassonografia sendo os doentes randomizados para a realização de biópsias transbrônquicas com pinça seguidas por criosonda ou vice-versa. Nos 39 casos incluídos a lesão foi visualizada pela minisonda em 31 doentes (79.5%), com 80.6% de prevalência de cancro do pulmão na amostra. A rentabilidade diagnóstica da pinça de biópsia foi 61.3% e da criosonda foi 74.2%. O tamanho do tecido adquirido pelas criobiópsias foi significativamente maior do que o alcançado por pinça (11.17mm2 vs. 4.69mm2, p<0.001). Ocorreu um único caso de hemorragia moderada, controlada através de medidas conservadoras. As biópsias transbrônquicas com criosonda sob orientação de ecoendoscopia radial foram seguras e eficazes na obtenção de amostras histológicas. O quinto estudo determinou o valor diagnóstico da ecografia transtorácica na identificação de malignidade em doentes com derrame pleural de natureza indeterminada. Foram examinados de forma prospetiva 154 doentes. Os resultados clínicos e radiológicos de cada caso foram ocultados ao executante do exame que gerou imagens estáticas e vídeos ultrassonográficos relevantes. Estes foram posteriormente visualizados, sendo as suas características classificadas por revisores independentes e comparadas com o diagnóstico definitivo. Em 66 casos o diagnóstico foi de derrame pleural maligno (68.2% com cancro do pulmão) e em 67 de derrame benigno. A ecografia torácica obteve 80.3% de sensibilidade, 83.6% de especificidade, 81.2% de valor preditivo negativo e 82.8% de valor preditivo positivo na deteção de malignidade. A nodularidade pleural ou diafragmática, espessamento pleural superior a 10mm e sinal de swirling foram significativamente diferentes (p<0.001) sendo sugestivos de derrame maligno. A existência de nodularidade pleural e ausência de broncograma aéreo ecográfico aumentaram a probabilidade de malignidade (OR 29.0 e OR 10.4, respetivamente). A ecografia transtorácica permitiu diferenciar derrame pleural maligno do benigno. A existência de nódulos pleurais constituiu o fator discriminador mais relevante. Em conclusão, os resultados desta tese possibilitam uma melhor compreensão do papel da ecoendoscopia brônquica (linear e radial) e ecografia transtorácica no diagnóstico e estadiamento do cancro do pulmão, com implicações e aplicabilidade na prática clínica.------------- ABSTRACT: In recent years ultrasonography has emerged as an important instrument in the diagnosis of thoracic diseases. Technological progress has enabled the design of new equipment such as radial and linear endobronchial ultrasound. In addition, indications for transthoracic echography were established. One of the main diseases responsible for the progression of chest sonography was lung cancer, the leading cause of cancer mortality worldwide. The applicability and knowledge of the role of ultrasonography in diagnosing and staging lung cancer is not depleted, persisting foci of controversy and scientific doubt that we intend to elucidate. The present thesis was organized into five chapters: the first included a general introduction regarding chest ultrasound, lung cancer and their combination; the second emphasized the main objectives; the third summarized the methodology used; the fourth encompassed the five published studies, subsequently described, and the fifth included a concise discussion, the main findings and future perspectives. The first study evaluated the diagnostic yield, safety and learning curve in a cohort of 179 patients submitted to linear endobronchial ultrasound. According to procedure indications, the patients were divided into three groups: (1) diagnosis, (2) diagnosis and staging, and (3) staging. For the first, second and third groups, endobronchial ultrasound sensitivity was 86.1%, 86.7% and 95% respectively and accuracy was 87.5%, 93.1% and 97.7% respectively. Practise led to an increase number of punctured sites per patient, in a shorter period of time and without complications, proving the safety and efficacy of the method when performed in the Portuguese population by expert echoscopists. The second study was conducted to determine the efficacy and cost of linear endobronchial ultrasound performed through the airway and/or oesophagus for diagnosis of lesions suggestive of lung cancer, after failure of conventional techniques. Of the patients prospectively enrolled a definitive diagnosis was reached in 106 cases (87.6%). The overall sensitivity for the diagnosis of lung cancer was 89.8%, specificity was 100%, positive predictive value was 100%, negative predictive value was 20% and accuracy was 90.1%. In conclusion, this global ultrasonographic strategy avoided diagnostic surgical procedures in patients that had undergone flexible bronchoscopy or computed tomography-guided transthoracic needle aspiration, providing a significant cost reduction. In the third study, the feasibility and role of linear endobronchial ultrasound combined with molecular techniques in the evaluation of tumour antigens and patterns of lymph node metastasis in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) was investigated. Cytokeratin 19 (CK-19), carcinoembryonic antigen (CEA), epithelial cell adhesion molecule (EPCAM), sialyl Lewis-X and CD44 were determined in lymph node aspirates of 33 lung cancer patients and 17 controls, using flow cytometry (FC) and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). In patients with NSCLC the epithelial cell compartment was significantly increased nd showed brighter CK-19 staining, compared to the control group. In NSCLC patients the immune compartment revealed an increased monocyte population and decreased lymphocyte subsets. The transcripts of CK- 19, CEA and EPCAM were higher in lung cancer patients and a positive correlation between these markers and the size of the primary lesion was also found. We concluded that the identification of CK-19, CEA and EPCAM in endobronchial ultrasound samples, using RT-PCR and FC was feasible and might aid in the detection of NSCLC lymph node metastases. The fourth study involved the combination of the radial endobronchial ultrasound with the cryoprobe for diagnosing solid peripheral lung lesions. We determined the feasibility, diagnostic yield, sample size and safety of the method. Lesions less than 40mm were located by ultrasound and forceps or cryobiopsies were performed in a randomized order. Of the 39 cases included, the lesion could be visualized by the miniprobe in 31 patients (79.5%), and lung cancer prevalence was 80.6%. The diagnostic yield of the biopsy forceps was 61.3% and for the cryobiopsy was 74.2 %. Cryobiopsies were significantly larger than forceps biopsies (11.17mm2 vs. 4.69mm2, p<0.001). There was only one case of moderate bleeding that was controlled by conservative measures. Transbronchial cryobiopsies under radial endobronchial ultrasound guidance were safe and effective in obtaining histological samples. The fifth study determined the diagnostic value of transthoracic sonography in predicting malignancy in patients with an undiagnosed pleural effusion. One hundred and fifty four patients were prospectively scanned. Relevant ultrasound images and videos were generated by an operator blinded to clinical and radiological results. These were subsequently visualized, its characteristics classified by independent reviewers and compared to the final diagnosis. A malignant pleural effusion was diagnosed in 66 cases (68.2 % with lung cancer) and a benign effusion in 67 cases. Thoracic ultrasound had a sensitivity of 80.3 %, specificity of 83.6%, negative predictive value of 81.2 % and positive predictive value of 82.8% to detect malignancy. The presence of pleural or diaphragmatic nodularity, pleural thickening greater than 10mm and swirling signal were significantly different (p<0.001 ), being suggestive of malignant effusion. The existence of pleural nodularity and absence of lung air bronchogram were more likely to indicate malignancy (OR 29.0 and OR 10.4, respectively). Transthoracic ultrasonography permits the distinction between malignant and benign pleural effusions. Pleural nodules were the most relevant feature. In conclusion, the results of this thesis provide a better understanding of the role of endobronchial ultrasound (linear and radial) and transthoracic sonography in lung cancer diagnosis and staging, with direct implications and applicability in clinical practice.

Fotoionização de moléculas e átomos

Este trabalho, no âmbito da física atómica e molecular, é essencialmente um estudo experimental, por fotoionização, da estrutura electrónica de moléculas e átomos de elevada instabilidade, relevantes na indústria, atmosfera terrestre e astrofísica. Os estudos de física molecular compreendem a caracterização em fase gasosa, à temperatura ambiente e a decomposição térmica controlada até 1100 K, por fotoionização com radiação de ultravioleta de vácuo usando a fonte de He I (21.22 eV), das seguintes moléculas: azidoformato de metilo, N3COOCH3; azidoformato de etilo, N3COOCH2CH3; azidoacetato de etilo, N3CH2COOCH2CH3; azidoetanol, N3CH2CH2OH;2-azidopropionitrilo, CH3CH(N3)CN; e 3-azidopropionitrilo, N3CH2CH2CN. Os resultados de espectroscopia de fotoelectrões, para cada uma destas moléculas, são comparados com os resultados do estudo de pirólise pela técnica de isolamento em matriz de azoto molecular, à temperatura de 12 K, assistida por espectroscopia de infravermelho. Os compostos intermediários e produtos finais observados permitem propor mecanismos de decomposição térmica para cada um dos sistemas. A interpretação e atribuição das bandas espectrais relativas a cada molécula têm por base os cálculos ab initio (HF e MP2) e de funcional da densidade (BLYP e B3LYP) das propriedades moleculares dos seus confórmeros de equilíbrio. A radiação de sincrotrão de ultravioleta de vácuo é usada nos estudos, por fotoionização, do oxigénio e azoto atómicos e dos radicais OH e OD, os quais são produzidos in situ por descarga de microondas e/ou reacção rápida átomo molécula. Para cada um destes sistemas, apresentam-se medidas da secção eficaz parcial de fotoionização, σ i, e do parâmetro de assimetria, β. Nestes estudos é usada a radiação da estação de trabalho 4.2 do Sincrotrão Elettra, em Itália.