Caracterização funcional das aquaporinas-3 e 7 de mamífero por expressão heteróloga em leveduras

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Bioquímica Estrutural e Funcional

As aquaporinas (AQPs) são proteínas intrínsecas de membrana, fisiologicamente importantes, que transportam água (aquaporinas ortodoxas) e também, em alguns casos, outros pequenos solutos como o glicerol (aquagliceroporinas). Em mamíferos, treze aquaporinas (AQP0-AQP12) são conhecidas até à data, sendo diferencialmente expressas em diversas células e tecidos. Recentemente, foram encontradas evidências em ratinhos e posteriormente em humanos obesos, que a deficiência da AQP7 está relacionada com obesidade por causar hipertrofia dos adipócitos. Além desta e de outras patologias associadas às restantes AQPs, verificou-se ainda que a AQP3 facilita a migração e proliferação das células epidérmicas, o que indica um importante papel na carcinogénese cutânea. Face à diversidade de patologias associadas à disfunção das diferentes aquaporinas, este trabalho pretendeu criar um sistema de expressão heteróloga, na levedura Saccharomyces cerevisiae, ideal para caracterizar funcionalmente aquaporinas, em particular a AQP3 e AQP7, bem como testar o efeito de compostos capazes de modular a sua actividade. Para esse efeito, a partir da estirpe de S. cerevisiae YSH 1770 foram criadas duas estirpes que sobre-expressam individualmente as aquaporinas de mamífero AQP3 e AQP7. Após a expressão e confirmação da sua localização celular, procedeu-se à caracterização da sua função através da determinação dos coeficientes de permeabilidade à água e ao glicerol e das respectivas energias de activação do transporte, utilizando a técnica de interrupção brusca de fluxo e medindo a variação do volume celular após a aplicação de um gradiente de pressão osmótica com soluto impermeante (sorbitol para permeabilidade à água) ou permeante (glicerol para permeabilidade ao glicerol). O efeito de um inibidor específico para aquagliceroporinas, o Auphen, mostrou um decréscimo do transporte de água e do transporte de glicerol das estirpes transformadas, validando este sistema de expressão heteróloga como modelo celular para o rastreio de compostos moleculares e de mecanismos de regulação de aquaporinas.