Marcadores biológicos de tabagismo : determinação de cutoff points

VII - CONSIDERAÇÕES FINAIS Este estudo desenvolveu-se devido facto de tanto quanto nos é dado a conhecer não terem sido determinados cutoff points de diferenciação entre fumadores e não fumadores em Portugal. Segundo vários autores é importante que estes valores sejam determinados em cada país devido às suas particularidades de prevalência do tabagismo e exposição involuntária ao fumo do tabaco. Foram também estudadas as variáveis que estão associadas e que influenciam os níveis do COex, da COHb, da cotinina plasmática e da cotinina urinária. De forma a cumprir os objectivos definidos, utilizou-se uma amostra de 102 indivíduos (53 fumadores e 49 não fumadores), tendo sido o tipo de amostragem não probabilística de conveniência. A dimensão da amostra e o tipo de amostragem são duas das limitações do estudo, uma vez que esta amostra não é representativa da população fumadora e não fumadora portuguesa, o que impede de generalizar os resultados nela obtidos à totalidade da população. Outra limitação identificada é o facto de não se terem encontrado estudos nacionais de características semelhantes a esta investigação, o que faz com que não seja possível comparar os resultados obtidos com estudos que tivessem utilizado amostras idênticas. Por essa razão a discussão de resultados foi efectuada considerando estudos internacionais cujas suas amostras para além de serem de maior dimensão os seus indivíduos possuem características particulares (prevalência do tabagismo e exposição involuntária ao fumo do tabaco) que dificultam a comparação dos resultados. Nos estudos internacionais muitas vezes não são estudadas as variáveis caracterizadoras dos hábitos tabágicos, o que leva mais uma vez à impossibilidade de relacionar correctamente os nossos resultados com outros obtidos por diferentes autores. Devido ao interesse dos resultados obtidos, seria importante que este estudo, tivesse continuidade, mas com algumas modificações que foram impossíveis de realizar no contexto em que se desenvolveu esta investigação. De forma a generalizar os resultados seria ideal utilizar uma amostra representativa da população fumadora e não fumadora nacional, o que permitiria ficar a conhecer mais fidedignamente os cutoff points de diferenciação entre fumadores e não fumadores em Portugal. Esta informação seria de grande utilidade para caracterizar correctamente os hábitos tabágicos dos indivíduos, permitindo reconhecer em que casos é necessário intervir para cessar os hábitos tabágicos e ainda nas consultas de cessação tabágica para um apropriado follow-up dos sujeitos. Outro aspecto em que esta investigação poderia ser complementada, diz respeito às variáveis caracterizadoras dos hábitos tabágicos, isto porque de acordo com a análise de regressão linear multivariada, através do modelo proposto, uma grande percentagem da variabilidade dos marcadores biológicos de tabagismo ficou por explicar, assim sendo seria importante estudar também outras variáveis, e construir outro modelo que explicasse de forma ainda mais expressiva a variabilidade dos biomarcadores. Sugerem-se como outras variáveis a ser estudas aquelas que estão relacionadas com as características inalatórias de cada indivíduo (número, frequência, profundidade, duração e percentagem de cigarros consumido e desperdiçado). Também a exposição involuntária ao fumo do tabaco deveria ser melhor caracterizada, acrescentando às variáveis analisadas neste estudo, outras que caracterizassem de forma mais precisa o tipo de exposição a que os indivíduos podem estar sujeitos no seu dia a dia (domiciliária, laboral e ambiental). Idealmente deveriam conhecer-se o número de cigarros que são fumados na proximidade dos indivíduos, assim como saber quais as características dos espaços fechados sobretudo no que respeita às condições de ventilação. É importante que surjam trabalhos a nível nacional relacionados com os marcadores de tabagismo, porque o tabagismo representa um problema de saúde pública sobre o qual é necessário intervir. É importante caracterizar correctamente os biomarcadores de tabagismo de forma a determinar a real prevalência do tabagismo e avaliar medidas preventivas e políticas de saúde pública. Actualmente decorridos 3 anos da aprovação da Lei 32/2007 em que foram aprovadas as normas de protecção dos cidadãos da exposição involuntária ao fumo do tabaco, a avaliação dos marcadores biológicos pode desempenhar um papel preponderante para caracterizar o impacto da implicação da Lei, uma vez que estes reflectem a exposição activa e passiva ao fumo do tabaco.

Avaliação funcional e farmacológica do corpo carotídeo do rato no envelhecimento

Resumo: O corpo carotídeo gera o quimiorreflexo à hipoxia, tendo por objectivo principal a homeostase dos gases do sangue. Esta tese testou a hipótese da função destes quimiossensores não se deteriorar ao longo da idade. In vivo, em ratos anestesiados, foram estudados os efeitos da idade nas respostas cardiorespiratórias a dois tipos de estímulos diferentes: a isquemia carotídea e a manipulação farmacológica de dois neurotransmissores com efeitos opostos nos quimiorreceptores, a adenosina e a dopamina. O modelo de isquemia carotídea corresponde à oclusão bilateral da artéria carótida comum, durante períodos de 5 a 15 s, o que determina um efeito excitatório na ventilação que é abolido pela secção bilateral dos nervos do seio carotídeo. No estudo farmacológico foram analisadas as respostas cardio-respiratórias à adenosina e à dopamina exógenas na presença e na ausência de antagonistas selectivos para os receptores A2A e D2, respectivamente. In vitro, no corpo carotídeo, foi quantificado o efeito de diferentes concentrações de oxigénio no conteúdo do segundo mensageiro comum à activação dos receptores A2A e D2, o cAMP. Em conjunto, estes resultados demonstraram que no rato o controlo da ventilação pelo corpo carotídeo se mantém inalterado ao longo da idade.--------------------- ABSTRACT: The carotid body initiates reflexes aimed principally at the homeostatic maintenance of blood gas tensions. This thesis tested the hypothesis of the function of these quimiossensores not deteriorate through age. In vivo, in anesthetized rats, we studied the effects of age on cardiorespiratory responses to two different types of stimuli: carotid ischemia and pharmacological manipulation of neurotransmitters with two opposite effects on chemoreceptors, adenosine and dopamine. The model of carotid ischemia corresponded to bilateral occlusion of common carotid artery, during periods of 5 to 15 s, which determines an excitatory effect on ventilation that is abolished by bilateral section of carotid sinus nerve. The pharmacological study analyzed the cardiorespiratory responses to exogenous adenosine and dopamine in the presence and absence of selective antagonists for the A2A and D2 receptors, respectively. In vitro, at the carotid body, it was quantified the effect of different concentrations of oxygen in the content of the common second messenger for the activation of A2A and D2 receptors, the cAMP. Together, these results showed that in rats the control of ventilation by carotid body remains unchanged through age.

The role of complex chromosome translocations in leukemia

Resumo A tumorigénese é um processo de transformação celular que se desenrola tipicamente em várias etapas. Os diferentes níveis de evolução tumoral resultam da acumulação sucessiva de mutações genéticas numa célula normal que lhe conferem uma vantagem selectiva no respectivo meio tecidular. As mutações podem manifestar-se sob a forma de alterações nucleotídicas pontuais ao nível da sequência de DNA, levando a uma desregulação da função proteíca ou à formação de proteínas não-funcionais, ou através de alterações cromossómicas numéricas ou estruturais. Na leucemia, por exemplo, os genes híbridos que resultam de translocações cromossómicas desempenham um importante papel no processo tumorigénico. Estes genes são transcritos sob a forma de um RNA mensageiro de fusão, o qual é traduzido numa proteína híbrida com função oncogénica. Frequentemente, os subtipos de doença leucémica estão associados com translocações cromossómicas que envolvem 2 pontos de quebra recorrentes e específicos. É disto exemplo a leucemia mielóide crónica, em que uma translocação recíproca entre os cromossomas 9 e 22 conduz à formação de um gene de fusão BCR-ABL1. Em diferentes subtipos de doença, existe também uma pequena proporção de casos que apresenta translocações cromossómicas complexas, que envolvem um ou mais pontos de quebra adicionais em outras localizações genómicas além das que estão implicadas na formação dos genes de fusão. Por vezes, os pontos de quebra estão também associados a delecções extensas de material genético que se pensa terem uma função importante na tumorigénese. No entanto, o papel destas regiões genómicas no desenvolvimento tumoral não tem sido um motivo recorrente de estudo. Neste contexto, o objectivo desta dissertação foi o de determinar o potencial papel tumorigénico de alterações génicas adicionais ocorridas nos pontos de quebra de translocações cromossómicas complexas. Para a prossecução do objectivo proposto, foram estudados 5 rearranjos cromossómicos distintos associados com diferentes tipos de doença hematológica maligna, nomeadamente a leucemia linfoblástica aguda de células B (2 casos), leucemia mielóide aguda, neoplasma mieloproliferativo e síndrome mielodisplásico/neoplasma ieloproliferativo, não classificável. O mapeamento dos pontos de quebra foi efectuado utilizando a hibridação fluorescente in situ e diferentes metodologias de biologia molecular, tendo como base a informação inicial da análise citogenética. Em casos seleccionados, o papel dos novos genes candidatos foi avaliado in vitro utilizando modelos de linhas celulares, nomeadamente no que respeita às funções de controlo da proliferação celular e de regulação transcricional. De entre os 5 casos estudados, quatro deles evidenciaram translocações complexas envolvendo 3 cromossomas, nomeadamente t(12;21;5)(p13;q22;q13), t(12;6;15)(p13;p24~25;q22), t(9;11;19)(p22;q23;p13) e t(X;20;16)(p11;q13;q23). No caso remanescente, foi observada uma translocação dicêntrica dic(9;12)(p11;p11) acompanhada de delecções extensas em ambos os pontos de quebra. Nos casos com t(12;21;5) e t(9;11;19) as translocações estavam associadas com a presença de genes de fusão recorrentes, nomeadamente TV6(12p13)-RUNX1(21q22) e TLL(11q23)-MLLT3(9p22), indicando que se tratavam de rearranjos complexos das translocações t(12;21) e t(9;11) associadas com a leucemia linfoblástica aguda de células B e a leucemia mielóide aguda, respectivamente. O papel dos pontos de quebra adicionais foi estudado em detalhe no caso com t(9;11;19). Através da metodologia de long distance inverse-polymerase chain reaction, foram identificados os pontos de quebra na sequência de DNA dos 3 cromossomas envolvidos na translocação. Além dos pontos de quebra nos genes MLL e MLLT3, foi observado que o local de quebra no cromossoma 19 interrompeu a sequência de um novo gene, designado CCDC94,conduzindo à sua haplo-insuficiência nas células com t(9;11;19). Através de ensaios de reverse transcription-polymerase chain reaction verificámos que o gene CCDC94 é expresso ubiquitariamente em tecidos humanos normais. A análise informática da sequência prevista da proteína CCDC94 indicou uma elevada identidade de aminoácidos com a proteína cwf16, envolvida na regulação do ciclo celular da levedura Schizosaccharomyces pombe. Através da clonagem do DNA complementar de CCDC94 em vectores de expressão, e após a transfecção destes em culturas de linhas celulares in vitro, observámos que este gene codifica uma proteína de localização exclusivamente nuclear. A expressão ectópica da proteína CCDC94 diminuiu a progressão do ciclo celular e a proliferação das células em cultura. Inversamente, a supressão do transcrito do gene CCDC94 através de interferência de RNA conduziu a um aumento significativo da proliferação celular, confirmando que CCDC94 regula negativamente a proliferação e a progressão do ciclo celular. Estes resultados mostram que os pontos de quebra adicionais, presentes em translocações cromossómicas complexas em leucemia, podem resultar na haplo-insuficiência de genes controladores dos mecanismos proliferativos, cooperando desta forma com a acção das proteínas de fusão para proporcionar ao clone leucémico uma proliferação celular descontrolada. Nos restantes 3 casos estudados não foram identificados genes de fusão. Ao invés, todos aqueles apresentaram delecções de extensão variável associadas com os pontos de quebra cromossómicos. No caso com t(12;6;15), identificámos uma delecção de 1.2 megabases de DNA na banda 12p13 que resultou na eliminação de 9 genes incluindo ETV6 e CDKN1B. O gene ETV6 codifica um factor de transcrição que é essencial para a formação das diferentes linhagens hematopoiéticas na medula óssea, enquanto CDKN1B é traduzido numa proteína responsável por bloquear a entrada das células na fase G1 do ciclo celular e,consequentemente, por travar a proliferação celular. Neste contexto, os resultados obtidos indicam que a perda simultânea de ETV6 e de CDKN1B, através de uma translocação cromossómica complexa, constituiu uma acção cooperativa na leucemogénese. A mesma noção pode aplicar-se ao caso com dic(9;12), no qual pelo menos 2 genes que codificam para factores de transcrição importantes na linhagem hematopoiética, PAX5 no cromossoma 9 e ETV6 no cromossoma 12, estavam deleccionados como resultado do rearranjo cromossómico. Dado que o factor de transcrição PAX5 regula negativamente a expressão do gene FLT3, que desempenha uma função pró-proliferativa, é expectável que a haplo-insuficiência de PAX5 no caso com dic(9;12) terá tido como consequência uma elevação dos níveis de expressão de FLT3, contribuindo deste modo para uma proliferação celular aumentada. A t(X;20;16) foi identificada num doente com trombocitémia essencial (TE), uma doença que está intimamente relacionada com alterações de vias intracelulares reguladas por citocinas. Neste caso, através da utilização de um array genómico, identificámos a presença de pequenas delecções associadas com os pontos de quebra nos cromossomas 16 e 20. No cromossoma 16 apenas um gene, MAF, estava deleccionado, enquanto no cromossoma 20 a delecção tinha abrangido 3 genes. Dos genes deleccionados, dois deles, NFATC2 (20q13) e MAF (16q23), codificam proteínas que operam como reguladores transcricionais de citocinas hematopoiéticas. Dado que NFATC2 se localiza numa região que constitui um alvo frequente de delecções em neoplasmas ieloproliferativos, incluindo a trombocitémia essencial,efectuámos um estudo detalhado do papel deste gene na proliferação megacariocítica e na regulação da expressão de uma citocina hematopoiética (GM-CSF), implicada na maturação das diferentes linhagens mielóides. Utilizando um modelo de linha celular de trombocitémia essencial, verificámos que a supressão do transcrito do gene NFATC2 in vitro, por interferência de RNA, estava associada com um aumento da proliferação celular. Em concordância, o bloqueio da activação da proteína NFATC2 através de um inibidor específico da sua interacção com a calcineurina, conduziu a um aumento da proliferação celular in vitro. Utilizando a PCR quantitativa em tempo real, detectou-se um aumento da produção do RNA de GM-CSF em ambos os ensaios celulares, indicando que o factor de transcrição NFATC2 pode regular negativamente a expressão de GM-CSF em células de trombocitémia essencial. No geral, estes resultados mostram que a redução dos níveis fisiológicos do transcrito NFATC2, ou a redução da respectiva actividade proteica, estão relacionados com a proliferação de megacariocitos através do aumento da produção de GM-CSF. De acordo com estes resultados, verificámos que as células dos doentes com TE apresentam níveis mais baixos do transcrito NFATC2 do que a população normal. Dado que o factor de transcrição MAF desempenha igualmente um papel como regular transcricional de citocinas, é plausível que a haplo-insuficiência dos genes NFATC2 e MAF, resultante do rearranjo cromossómico complexo t(X;20;16), teve um efeito cooperativo importante na patogénese da trombocitémia essencial através da alteração do padrão normal de expressão das citocinas hematopoiéticas. Em síntese, efectuámos nesta dissertação um estudo citogenético de 4 translocações cromossómicas complexas incluindo t(12;21;5), t(12;6;15), t(9;11;19) e t(X;20;16), e de uma translocação dicêntrica dic(9;12), associadas com diferentes neoplasmas hematológicos. Em casos seleccionados efectuámos também um estudo molecular detalhado das regiões dos pontos de quebra. Esta análise permitiu-nos identificar 2 genes, CCDC94 no cromossoma 19 e NFATC2 no cromossoma 20, cuja haplo-insuficiência pode promover o aumento da proliferação celular das células leucémicas. A partir destes estudos podem ser retiradas 2 noções principais: (i) Os pontos de quebra adicionais, que ocorrem em translocações complexas associadas com a formação de genes de fusão, podem ter como consequência a desregulação de genes controladores da proliferação celular (e.g., CCDC94); (ii) As translocações complexas caracterizadas pela ausência de genes de fusão recorrentes poderão estar preferencialmente associadas com a presença de delecções, envolvendo um ou mais genes, nos pontos de quebra; nestas situações, serão necessários pelo menos 2 genes com funções celulares semelhantes (e.g., NFATC2 e MAF) ou complementares (e.g., ETV6 e CDKN1B) para, quando deleccionados, promoverem de forma cooperativa a leucemogénese. Nestes termos, o modelo de alterações genéticas sequenciais que caracteriza o desenvolvimento do cancro pode ser substituído por um modelo em que vários genes-alvo são simultaneamente desregulados pela formação de uma translocação cromossómica complexa, evitando deste modo a necessidade de ocorrência de alterações genéticas subsequentes.----------------------ABSTRACT: Tumourigenesis is a multistep process which results from the accumulation of successive genetic mutations in a normal cell. In leukemia for instance, recurrent translocations play a part in this process by generating fusion genes which lead to the production of hybrid proteins with an oncogenic role. However, a minor subset of chromosomal translocations referred to as complex or variant involves extra breakpoints at variable genome locations in addition to those implicated in the formation of fusion genes. We aimed to describe in this work the role, if any, of genes located at extra breakpoint locations or which are affected by breakpoint-adjacent deletions through the study of 5 leukemia patients.Two of the patients presented with TV6(12p13)-RUNX1(21q22) and MLL(11q23)- MLLT3(9p22) fusion genes as a result of a t(12;21;5) and a t(9;11;19), respectively. Detailed molecular characterization of the extra breakpoint at chromosome 19 in the latter case revealed that a novel ubiquitously expressed gene, CCDC94, with a potential role in cell cycle regulation, was disrupted by the breakpoint. We demonstrated using in vitro cellular assays that this gene codifies for a nuclear protein which negatively regulates cell cycle progression. These data shows that extra breakpoint locations of complex translocations may result in haplo-insufficiency of critical proliferation genes, thereby cooperating with the generation of hybrid proteins to provide unrestrained cell proliferation. In the other 3 patients there were reakpoint-associated deletions which precluded the formation of putative fusion genes. In a case with a t(12;6;15) we characterized a deletion at 12p13 which eliminated ETV6 and 8 other genes including CDKN1B. These findings indicate that concomitant loss of ETV6 and CDKN1B, which encodes a cyclin-dependent kinase inhibitor responsible for blocking entry of cells into the G1 phase of the cell cycle, acted cooperatively to promote leukemogenic proliferation. The same notion applied to a case with a dic(9;12) in which 2 genes encoding hematopoietic transcription factors - ETV6 and PAX5 (9p13)- were deleted as a result of breakpoint-adjacent deletions. Similarly, we found that 2 transcription factor genes involved in the regulation of cytokine expression, NFATC2 (20q13) and MAF (16q23), were involved in deletions contiguous to the breakpoints in a patient with a t(X;20;16). In vitro suppression of NFATC2 mRNA or inhibiton of NFATC2 protein activity enhanced cell proliferation as a result of an increase in the production of a myeloid-lineage stimulating hematopoietic cytokine, GM-CSF. These results suggest that haplo-insufficiency of NFATC2 and MAF genes had a cooperative effect in inducing cell proliferation as a result of a disregulation of cytokine production. Two main conclusions may be drawn from our studies: (i) In complex translocations associated with the production of fusion genes, additional breakpoints may cooperate in tumourigenesis by targeting genes that control cell proliferation; (ii) In complex translocations associated with small breakpoint-adjacent deletions, at least 2 genes with similar or complementary functions need to be deregulated to promote tumourigenesis.

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