Avaliação da eficiência e produtividade de empresas de base tecnológica em incubadoras: o caso de estudo do Madan Parque

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia e Gestão Industrial

Proteínas recombinantes de Plasmodium Falciparum para deteção de malária por nanoimunoensaios

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Desenvolvimento de dispositivos microfluídicos 3D em papel para utilização em biossensores

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Avaliação da toxicidade do fármaco anti-HIV abacavir: síntese e caracterização estrutural de possíveis biomarcadores

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Bioorgânica

Humoral response towards high density lipoprotein : a new mechanism for atherogenesis

RESUMO:Aterosclerose é uma das principais causas de morbilidade e mortalidade no mundo ocidental. É responsável, direta ou indiretamente, pela maior percentagem de gastos com a saúde na maioria dos países europeus. A “teoria lipídica” da aterosclerose, que se baseia na dislipidemia como causa primária para a doença vascular tem algumas implicações práticas importantes: permite a definição de linhas de orientação e protocolos simples e ainda estabelece alvos terapêuticos que podem ser atingidos na maior parte dos casos com a atual intervenção farmacológica. A associação da aterosclerose com o sistema imunológico (a “teoria imunológica”), forneceu por sua vez novas formas de explorar os mecanismos envolvidos e abriu novas perspetivas para um conhecimento mais completo da doença. No entanto, levanta dificuldades evidentes no que diz respeito às possibilidades terapêuticas. De todos os intervenientes no processo aterosclerótico (bioquímicos, imunológicos e anatómicos), as lipoproteínas de elevada densidade (HDL) são atualmente reconhecidas como um dos fatores mais importantes na aterogénese. Isto é baseado no reconhecimento das múltiplas propriedades anti-aterogénicas das HDL como por exemplo: a anti-oxidante, a anti-inflamatória e a antitrombótica, bem como o seu importante papel na melhoraria da função endotelial. Atualmente, é consensual que as funções anti-aterogénicas das HDL vão além do seu papel no transporte reverso do colesterol (RCT) e a importância das HDL no processo aterosclerótico baseia-se não apenas no seu papel protetor impedindo a formação da placa de ateroma, mas também na estabilização destas, prevenindo a sua ruptura e, consequentemente o evento trombótico. Como fundamentais no processo aterosclerótico estão reconhecidos dois principais conjuntos de eventos: um caracterizado por alterações no metabolismo das lipoproteínas que resultam em lipoproteínas pró-inflamatórias e pró-oxidantes que interagem com os componentes celulares da parede arterial e que conduzem à formação da placa de ateroma; o outro evento é a resposta imunológica desencadeada contra um novo conjunto de antigénios que por sua vez leva à produção de citoquinas pró-inflamatórias. Dada a complexidade da HDL e das suas múltiplas funções estas lipoproteínas tornaram-se um potencial alvo para a resposta auto-imune, e cujas consequências podem explicar algumas das associações identificados em estudos clínicos e epidemiológicos. Contudo esta interação entre o sistema imunológico e HDL nunca foi exaustivamente estudada. Portanto, pomos a hipótese de que em condições oxidativas e pró-inflamatórias, um aumento do antigénio (HDL) conduz a um consequente acréscimo na produção de anticorpos anti-HDL (aHDL) responsáveis pela alteração quantitativa e / ou qualitativa das HDL. O conceito de que estes anticorpos podem contribuir tanto para a evolução a longo prazo do processo aterosclerótico, como para o desencadeamento de eventos clínicos pode também explicar a heterogeneidade encontrada em cada doente e nos grandes estudos clínicos, no que diz respeito aos fatores de risco e outcomes clínicos. Para além disso, a confirmação desta hipótese pode permitir explicar porque é que as intervenções terapêuticas atualmente em desenvolvimento para aumentar os níveis de HDL, não conseguem mostrar a tão esperada redução do risco vascular. O objetivo geral desta tese foi identificar e caracterizar a resposta humoral contra os componentes da HDL, e avaliar possíveis mecanismos que possam contribuir para a modificação das propriedades anti-aterogénicas das HDL. Para alcançar este objetivo investigou-se: 1) A presença de anticorpos aHDL em doentes com lúpus eritematoso sistémico (SLE) e em doentes com manifestações clínicas de aterosclerose, como os doentes com doença arterial coronária (CAD), acidente vascular cerebral isquémico (IS) e diabetes tipo 2; 2) Os principais alvos antigénicos dentro do complexo das HDL e a associação entre os títulos de anticorpos aHDL e diferentes características clínicas destas doenças; 3) As modificações das funções normais associadas às HDL, em particular da função anti-oxidante e anti-inflamatória; 4) A atividade biológica dos anticorpos aHDL isolados do soro de doentes através de um conjunto de experiências in vitro de inibição da atividade da paraoxonase 1 (PON1) e da expressão de moléculas de adesão em culturas de células endoteliais. Para tal foi necessário estabelecer um método de isolamento dos anticorpos. Os anticorpos aHDL isolados do soro de doentes foram utilizados de forma a identificar as potenciais alterações dos sistemas celulares utilizados; 5) O efeito de fármacos usados no tratamento das dislipidemias, em particular o ácido nicotínico e as estatinas, na variação dos títulos de anticorpos aHDL através de ensaios clínicos randomizados, controlados com placebo e em dupla ocultação. Os métodos utilizados neste trabalho incluíram: técnicas imunológicas (como por exemplo, enzyme-linked immunoabsorbent assay - ELISA, ensaio imunoturbidimetrico e cromatografia de imuno-afinidade) técnicas bioquímicas (tais como a quantificação de atividade enzimática por espectrofotometria e por luminescência), experiências com cultura de células e citometria de fluxo. Os nossos resultados mostram que: 1) A presença de anticorpos aHDL, e mais especificamente anticorpos contra alguns do seus principais componentes como a apolipoproteína A-I (ApoA-I, principal apolipoproteína presente nas HDL) e a PON1 (o enzima que mais contribui para a propriedade anti-oxidante das HDL), quer em doentes com doenças auto-imunes, como o SLE, quer em doentes com manifestações clínicas de aterosclerose, como CAD, IS e diabetes tipo 2. Os doentes apresentaram títulos de anticorpos IgG aHDL, aApoA-I e aPON1 significativamente mais elevados do que controlos saudáveis com a mesma idade e sexo. 2) A correlação positiva estatisticamente significativa entre os títulos de aHDL e aApoA-I e aPON1 sugere que estes sejam dois dos principais alvos antigénicos dentro do complexo das HDL. Os anticorpos encontrados nestes doentes estão associados com a diminuição da atividade da PON1 e a uma redução da capacidade anti-oxidante total (TAC) do soro, um aumento dos biomarcadores de disfunção endotelial (como por exemplo dos metabolitos do óxido nítrico - NO2- e NO3-, as moléculas de adesão vascular e intracelular - VCAM-1 e ICAM-1 e os níveis de 3-nitrotirosina). Nos doentes com SLE os títulos destes estão associados a um aumento do dano cardiovascular e à atividade global da doença avaliados pelas escalas SLICC/ACR DI e BILAG score, respetivamente. Enquanto que nos doentes com diabetes tipo 2 estes anticorpos estão associados com um aumento dos níveis de glicemia em jejum (FGP) e hemoglobina glicada (HbA1c). 3) Após se ter estabelecido um método de isolamento dos anticorpos que permite isolar quantidades significativas de anticorpos do soro de doentes sem perder a sua especificidade, foi identificada a capacidade dos anticorpos isolados do soro de doentes inibirem de uma forma dependente da concentração a atividade da PON1 até um máximo de 70% no caso dos doentes com SLE e ente 7-52% no caso dos anticorpos isolados de doentes com CAD e IS. 4) O efeito anti-inflamatório das HDL na inibição da produção de VCAM-1 induzida por citoquinas (como o TNF-) foi revertido em mais de 80% pelos anticorpos aHDL isolados do soro de doentes. 5) A angiogenesis induzida por HDL através do aumento do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) foi anulada em 65% pelos anticorpos aHDL isolados do soro de doentes. 6) Os atuais agentes farmacológicos disponíveis para aumentar as concentrações de HDL-C estão associados a um aumento dos títulos de anticorpos.-------- ABSTRACTAtherosclerosis is the major cause of morbidity and mortality in the western world. It is also responsible, directly or indirectly, for the highest percentage of health costs in most European countries. Despite the use of new technologies for the diagnosis of vascular disease and regardless of the major advances in treatment, the atherosclerosis-related clinical burden is still raising. The “lipid theory” of atherogenesis, which identifies dyslipidemia as the primary cause of this vascular disease has some important practical implications: it allows the definition of simple guidelines and establishes therapeutic targets which can be generally met with current pharmacologic intervention. The association between atherosclerosis an the immune system (the immune concept) has in turn provided new ways of exploring the mechanisms involved in this condition and has opened new perspectives in the understanding of the disease. However, it raises obvious difficulties when it comes to treatment options. Of all the players (biochemical, immunological and anatomical) involved in this matter, high-density lipoproteins (HDL) are currently recognised as one of the most important factors in atherogenesis. This is based on the recognition of HDL's multiple anti-atherogenic properties: anti-oxidant, anti-inflammatory and antithrombotic, as well as its capacity to improve endothelial function. Nowadays, it is widely recognized that the anti-atherogenic functions of HDL go beyond reverse cholesterol transport (RCT), and the importance of HDL is based not just on its ability to reduce atheroma formation but also on its ability to stabilise plaques, therefore preventing their rupture and ultimately thrombosis. Two main set of events have been recognised as fundamental in atherogenesis: one, characterized by lipoprotein metabolism alterations, resulting in pro-inflammatory and pro-oxidative lipoproteins, which interact with the normal cellular elements of the arterial wall leading to atheroma formation; the other, the immune cellular response towards new sets of antigens which lead to the production of pro-inflammatory cytokines. Given to HDL complexity and multiple functions this lipoprotein has became a potential target for an auto-immune response, the consequences of which may explain some of the association identified in epidemiological and clinical studies, though the interaction between the immune system and HDL has never been thoroughly addressed. Therefore, we hypothesized that under oxidative and pro-inflammatory conditions, the increase in the antigen (HDL) would lead to a consequent increase in the production of anti-HDL (aHDL) antibodies be responsible for quantitative and/or qualitative changes of HDL. The concept that these antibodies may contribute either to the long-term evolution of atherosclerosis or to the triggering of clinical events may also explain the heterogeneity found in individual patients and in large cohorts regarding risk factors and clinical outcomes. Moreover this may be a major breakthrough in understanding why therapeutic interventions that increase HDL levels, failed to show the anticipated reduction in vascular risk. The overall aims of this thesis were to identified and characterize the humoral response towards HDL components and to evaluate the possible mechanisms that may contribute to the modifications of the anti-atherogenic properties of HDL. To achieve this objective we investigated: 1) the presence of aHDL antibodies in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) and in patients with atherosclerosis-related clinical events, such as coronary artery disease (CAD), ischemic stroke (IS) and type 2 diabetes; 2) the association between the titres of aHDL antibodies and different clinical features of these diseases; 3) the modifications of the anti-atherogenic properties of HDL; 4) the biologic effect of aHDL antibodies isolated from serum of patients on the anti-oxidant and anti-inflammatory properties of HDL; 5) the effect of different pharmacologic treatments for dyslipidemia on the prevalence and activity of aHDL antibodies. The methodologies used in this work included immunologic-related techniques (e.g. enzyme-linked immunoabsorbent assay – ELISA, immunoturbidimetric immunoassay and immunoaffinity chromatography), biochemical techniques (enzymatic assays with quantification by spectrophotometry and luminescence methods), cell culture experiments and flow cytometry. Our results indicate that: 1) The titres of IgG aHDL, anti-apolipoprotein A-I (aApoA-I) and anti-paraoxonase 1 (aPON1) antibodies were higher in patients with SLE, CAD, IS and type 2 diabetes when compared with age and sex matched healthy controls. 2) The antibodies found in these patients were associated with decreased PON1 activity, (the enzyme responsible for most of the anti-oxidant effect of HDL), reduced total anti-oxidant capacity (TAC) of serum and increased biomarkers of endothelial dysfunction (nitric oxide metabolites, adhesion molecules, nitrotyrosine). In patients with SLE the antibody titres were associated with an increase in disease-related cardiovascular damage and activity whereas in patients with type 2 diabetes they were directly related with the fasting glucose plasma (FGP) levels and the glycosylated haemoglobin (HbA1c). 3) The antibodies isolated from serum of our patients, directly inhibited HDL-associated PON1 activity in a dose dependent way ranging from 7 to 52%. 4) The anti-inflammatory effect of HDL, measured by the percentage of inhibition of the cytokine-induced production of vascular adhesion molecules (VCAM-1), was reduced in more than 80% by aHDL antibodies isolated from our patients. 5) The HDL-induced angiogenesis by increasing vascular endothelial growth factor (VEGF) levels was abrogated in 65% by the antibodies isolated from serum of patients. 6) The current available pharmacologic agents for increasing HDL-C concentrations were associated with an increase in the titres of IgG aApoA-I antibodies. This increase was higher in the extended release niacin when compared to statins probably due to their dampening effect on oxidative stress. In conclusion, aHDL antibodies are present in different pathologic conditions. aHDL antibodies represent a family of self-reacting immunoglobulins, of which ApoA-I and PON1 might be the most relevant targets. These antibodies are biologically active, interfering with the HDL anti-oxidant and anti-inflammatory properties and, consequently, with the atherosclerotic process. The pathogenic potential of these antibodies may lead to the identification of a new biomarker for vascular disease, whilst presenting itself as a novel target for a different treatment approach which may redefine the treatment strategies and clinical trials design for HDL interventions in the future.

Estudo de acidificação de um composto de resíduos verdes alcalino

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia do Ambiente – Perfil de Engenharia Sanitária

A relevância do factor de transcrição Yap5 de Saccharomyces cerevisiae na resposta ao excesso de ferro

A capacidade que os organismos possuem de alterar os seus padrões de expressão de genes em resposta a alterações no meio ambiente é essencial para a sua viabilidade. A levedura Saccharomyces cerevisiae, em particular, possui um programa complexo e muito flexível de expressão de genes quando exposta a mudanças agressivas do seu meio ambiente. As células mantêm a sua homeostase através de mecanismos coordenados de regulação de vários factores de transcrição, cada um desempenhando funções específicas. Neste trabalho foi estudada a relevância do factor de transcrição da família Yap de S. cerevisiae, o Yap5, na destoxificação do excesso de ferro na célula. Os resultados obtidos neste trabalho mostram que após a incubação com elevadas quantidades de sulfato de ferro, embora o potencial de transactivação do Yap5 aumente, os níveis da proteína diminuem, sendo esta diminuição dependente da concentração de ferro. Demonstrámos também que embora a expressão do gene CCC1 (que codifica para o único transportador vacuolar de ferro conhecido) seja dependente do Yap5 em condições de excesso de ferro, os níveis basais de expressão deste gene são suficientes para a sobrevivência nessas condições. Observámos ainda que, ao contrário do que acontece em Schizosaccharomyces pombe, o factor de transcrição Hap4, não parece estar envolvido nesta regulação. Através de delecções sequenciais da região promotora do CCC1, verificámos que os níveis de expressão ditados por uma região de 58pb a montante do codão de iniciação, ATG, são suficientes para a célula sobreviver sob concentrações elevadas de ferro. Verificámos ainda que a região 3’UTR do gene é importante para a sobrevivência celular. Nessa região, identificámos uma estrutura em forma de “hairpin” que poderá estar envolvida na regulação do gene.

Métodos de auscultação não destrutivos aplicados na avaliação da capacidade de carga de infraestruturas ferroviárias

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Civil – Perfil Estruturas e Geotecnia

Soluções de pregagens para a estabilização de taludes: uma contribuição para o seu dimensionamento

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Civil - Perfil Estruturas e Geotecnia

Validação de metodologia para deteção de Bacillus cereus em arroz e produtos à base de cereais

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Tecnologia e Segurança Alimentar

Utilidade da tomografia computorizada cardíaca na avaliação da doença coronária

RESUMO: Apesar de toda a evolução farmacológica e de meios complementares de diagnóstico possível nos últimos anos, o enfarte agudo do miocárdio e a morte súbita continuam a ser a primeira manifestação da aterosclerose coronária para muitos doentes, que estavam previamente assintomáticos. Os exames complementares de diagnóstico tradicionalmente usados para avaliar a presença de doença coronária, baseiam‐se na documentação de isquémia do miocárdio e por este motivo a sua positividade depende da presença de lesões coronárias obstrutivas. As lesões coronárias não obstrutivas estão também frequentemente implicadas no desenvolvimento de eventos coronários. Apesar de o risco absoluto de instabilização por placa ser superior para as lesões mais volumosas e obstrutivas, estas são menos prevalentes do que as placas não obstrutivas e assim, por questões probabilísticas, os eventos coronários resultam com frequência da rotura ou erosão destas últimas. Estudos recentes de imagiologia intracoronária avançada forneceram evidência de que apesar de ser possível identificar algumas características de vulnerabilidade em placas associadas ao desenvolvimento subsequente de eventos coronários, a sua sensibilidade e especificidade é muito baixa para aplicação clínica. Mais do que o risco associado a uma placa em particular, para o doente poderá ser mais importante o risco global da sua árvore coronária reflexo da soma das probabilidade de todas as suas lesões, sendo que quanto maior for a carga aterosclerótica maior será o seu risco. A angio TC cardíaca é a mais recente técnica de imagem não invasiva para o estudo da doença coronária e surgiu nos últimos anos fruto de importantes avanços na tecnologia de TC multidetectores. Estes avanços, permitiram uma progressiva melhoria da resolução espacial e temporal, contribuindo para a melhoria da qualidade dos exames, bem como uma significativa redução da dose de radiação. A par desta evolução tecnológica, foi aumentando a experiência e gerada mais evidência científica, tornando a angio TC cardíaca cada vez mais robusta na avaliação da doença coronária e aumentando a sua aplicabilidade clínica. Mais recentemente apareceram vários trabalhos que validaram o seu valor prognóstico, assinalando a sua chegada à idade adulta. Para além de permitir excluir a presença de doença coronária e de identificar a presença de estenoses significativas, a angio TC cardíaca permite identificar a presença de lesões coronárias não obstrutivas, característica impar desta técnica como modalidade de imagem não invasiva. Ao permitir identificar a totalidade das lesões ateroscleróticas (obstrutivas e não obstrutivas), a 18 angio TC cardíaca poderá fornecer uma quantificação da carga aterosclerótica coronária total, podendo essa identificação ser útil na estratificação dos indivíduos em risco de eventos coronários. Neste trabalho foi possível identificar preditores demográficos e clínicos de uma elevada carga aterosclerótica coronária documentada pela angioTC cardíaca, embora o seu poder discriminativo tenha sido relativamente modesto, mesmo quando agrupados em scores clínicos. Entre os vários scores, o desempenho foi um pouco melhor para o score de risco cardiovascular Heartscore. Estas limitações espelham a dificuldade de prever apenas com base em variáveis clínicas, mesmo quando agrupadas em scores, a presença e extensão da doença coronária. Um dos factores de risco clássicos, a obesidade, parece ter uma relação paradoxal com a carga aterosclerótica, o que pode justificar algumas limitações da estimativa com base em scores clínicos. A diabetes mellitus, por outro lado, foi um dos preditores clínicos mais importantes, funcionando como modelo de doença coronária mais avançada, útil para avaliar o desempenho dos diferentes índices de carga aterosclerótica. Dada a elevada prevalência de placas ateroscleróticas identificáveis por angio TC na árvore coronária, torna-‐se importante desenvolver ferramentas que permitam quantificar a carga aterosclerótica e assim identificar os indivíduos que poderão eventualmente beneficiar de medidas de prevenção mais intensivas. Com este objectivo, foi desenvolvido um índice de carga aterosclerótica que reúne a informação global acerca da localização, do grau de estenose e do tipo de placa, obtida pela angio TC cardíaca, o CT--‐LeSc. Este score poderá vir a ser uma ferramenta útil para quantificação da carga aterosclerótica coronária, sendo de esperar que possa traduzir a informação prognóstica da angio TC cardíaca. Por fim, o conceito de árvore coronária vulnerável poderá ser mais importante do que o da placa vulnerável e a sua identificação pela angio TC cardíaca poderá ser importante numa estratégia de prevenção mais avançada. Esta poderá permitir personalizar as medidas de prevenção primária, doseando melhor a sua intensidade em função da carga aterosclerótica, podendo esta vir a constituir uma das mais importantes indicações da angio TC cardíaca no futuro.---------------- ABSTRACT Despite the significant advances made possible in recent years in the field of pharmacology and diagnostic tests, acute yocardial infarction and sudden cardiac death remain the first manifestation of coronary atherosclerosis in a significant proportion of patients, as many were previously asymptomatic. Traditionally, the diagnostic exams employed for the evaluation of possible coronary artery disease are based on the documentation of myocardial ischemia and, in this way, they are linked to the presence of obstructive coronary stenosis. Nonobstructive coronary lesions are also frequently involved in the development of coronary events. Although the absolute risk of becoming unstable per plaque is higher for more obstructive and higher burden plaques, these are much less frequent than nonobstructive lesions and therefore, in terms of probability for the patient, coronary events are often the result of rupture or erosion of the latter ones. Recent advanced intracoronary imaging studies provided evidence that although it is possible to identify some features of vulnerability in plaques associated with subsequente development of coronary events, the sensitivity and sensibility are very limited for clinical application. More important than the individual risk associated with a certain plaque, for the patient it might be more important the global risk of the total coronary tree, as reflected by the sum of the diferent probabilities of all the lesions, since the higher the coronary Atherosclerotic burden, the higher the risk for the patient. Cardiac CT or Coronary CT angiography is still a young modality. It is the most recente noninvasive imaging modality in the study of coronary artery disease and its development was possible due to important advances in multidetector CT technology. These allowed significant improvements in temporal and spatial resolution, leading to better image quality and also some impressive reductions in radiation dose. At the same time, the increasing experience with this technique lead to a growing body of scientific evidence, making cardiac CT a robust imaging tool for the evaluation of coronary artery disease and increased its clinical indications. More recently, several publications documented its prognostic value, marking the transition of cardiac CT to adulthood. Besides being able to exclude the presence of coronary artery disease and of obstructive lesions, Cardiac CT allows also the identification of nonobstructive lesions, making this a unique tool in the field of noninvasive imaging modalities. By evaluating both obstructive and nonobstructive lesions, cardiac CT can provide for the quantification of total coronary atherosclerotic burden, and this can be useful to stratify the risk of future coronary events. In the present work, it was possible to identify significant demographic and clinical predictors of a high coronary atherosclerotic burden as assessed by cardiac CT, but with modest odds ratios, even when the individual variables were gathered in clinical scores. Among these diferent clinical scores, the performance was better for the Heartscore, a cardiovascular risk score. This modest performance underline the limitations on predicting the presence and severity of coronary disease based only on clinical variables, even when optimized together in risk scores, One of the classical risk factors, obesity, had in fact a paradoxical relation with coronary atherosclerotic burden and might explain some of the limitations of the clinical models. On the opposite, diabetes mellitus was one of the strongest clinical predictors, and was considered to be a model of more advanced coronary disease, useful to evaluate the performance of diferent plaque burden scores. In face of the high prevalence of plaques that can be identified in the coronary tree of patients undergoing cardiac CT, it is of utmost importance to develop tools to quantify the total coronary atherosclerotic burden providing the identification of patients that could eventually benefit from more intensive preventive measures. This was the rational for the development of a coronary atherosclerotic burden score, reflecting the comprehensive information on localization, degree of stenosis and plaque composition provided by cardiac CT – the CT-LeSc. This score may become a useful tool to quantify total coronary atherosclerotic burden and is expected to convey the strong prognostic information of cardiac CT. Lastly, the concept of vulnerable coronary tree might become more important than the concept of the vulnerable plaque and his assessment by cardiac CT Might become important in a more advance primary prevention strategy. This Could lead to a more custom-made primary prevention, tailoring the intensity of preventive measures to the atherosclerotic burden and this might become one of the most important indications of cardiac CT In the near future.

Sequênciação e análise do genoma de um presumível flavivírus isolado de Aedes (Ochlerotatus) Caspius

O género Flavivirus (Flaviviridae) inclui mais de setenta vírus com genoma a RNA de cadeia simples, muitos dos quais são importantes agentes patogénicos para o Homem e os outros animais. A maioria dos flavivírus pode ser transmitidos por carraças, mosquitos ou, aparentemente, restringir-se a vertebrados (Cook e Holmes, 2006). No entanto, um grupo de flavivírus designados “não clássicos”, não parece ter hospedeiro vertebrado conhecido. Estes últimos são comumente colocados junto à raiz de árvores filogenéticas do género Flavivirus, sendo frequentemente isolados em mosquitos, justificando a sua designação de vírus específicos de insectos (ISF, do inglês insect-specific flaviviruses) (Farfan-Ale et al., 2009). A classificação dos ISF como flavivírus tem sido suportada por semelhanças ao nível da sua organização genómica, perfil de hidropatia proteica, locais de clivagem conservados da sequência da poliproteína que codificam, e domínios enzimáticos. No entanto, são distintos em termos antigénicos, partilhando o mesmo nível de distância genética quando comparados com outros membros do género que quando comparados com outros dois outros géneros da família Flaviviridae (Cook e Holmes, 2006; Gould et al., 2003). Esta tese apresenta uma caracterização inicial, que inclui a obtenção da sequência genómica quase completa, de um novo ISF. Este vírus, com a designação proposta de OCFVPt, foi isolado de mosquitos adultos classificados como Aedes (Ochlerotatus) caspius (Pallas, 1771), os quais são encontrados em densidades elevadas nas zonas costeiras estuarinas dos distritos de Faro e Setúbal (Almeida et al., 2008). Este vírus replica rapidamente na linha celular C6/36 (derivada de Aedes albopictus), e, como esperado, não replica em células Vero. Contrariamente a outros ISF, o OCFVPt aparentemente causa efeito citopático óbvio em células C6/36, as quais, depois de infectadas, rapidamente se separam do suporte sólido da placa de crescimento, ficando pequenas e redondas. Análises por microscopia electrónica de secções finas de células C6/36 48h após infecção com OCFVPt revelaram uma hiperplasia nuclear acentuada com aumento do espaço entre as cisternas da membrana nuclear, no qual podem ainda ser encontradas vesículas de várias dimensões. O genoma do OCFVPt tem, no mínimo, 9.839 nt e codifica para uma única poliproteína com as caraterísticas normalmente associadas aos membros do género Flavivirus. As árvores filogenéticas geradas após alinhamento de sequências virais mostram que o OCFVPt forma, juntamente com HANKV (Huhtamo et al., 2012) um grupo monofilético distinto dentro da radiação dos ISF.

Carbon dots: nanopartículas de carbono fluorescentes para marcação e visualização de células

A imagiologia por fluorescência é uma técnica extremamente útil em investigação biomédica. Actualmente existe uma vasta gama de fluoróforos disponíveis para marcação por fluorescência. Contudo estes marcadores possuem limitações que condicionam a sua aplicação em sistemas biológicos. As nanopartículas de carbono fluorescentes (CNPs) constituem uma recente classe de marcadores fluorescentes com elevada biocompatibilidade. O objectivo deste trabalho consistiu em produzir de CNPs através de métodos simples, a sua caracterização e aplicação como marcadores celulares para visualização de células em microscopia de fluorescência. Inicialmente foram produzidas nanopartículas (NPs) seguindo métodos mencionados na literatura. Seguidamente foram produzidas CNPs a partir de PAA, por via hidrotérmica, e a partir da carbonização de grãos de cortiça para as quais foi feito um estudo do efeito da variável temperatura de carbonização. Das amostras produzidas, nove foram devidamente estudadas. A espectroscopia de absorção no UV-Vis revelou perfis de absorção característicos para este tipo de NPs. A emissão de fluorescência das CNPs caracterizadada por espectroscopia de fluorescência evidenciou comportamentos emissivos típicos destas NPs tais como dependência do máximo de emissão com o comprimento de onda de excitação. A intensidade da fluorescência das CNPs sintetizadas por via hidrotérmica é, em geral, maior com rendimentos quânticos de fluorescência a variar entre 4 e 11%. Os rendimentos quânticos das CNPs produzidas por carbonização variam entre 2 e 5%. As imagens de microscopia electrónica demonstram que as CNPs possuíam formas esféricas. Os tamanhos determinados por SEM, TEM e DLS revelaram que as dimensões das NPs caem entre os 2 e 150nm. Por DRX constatou-se que as CNPs possuem uma estrutura atómica desorganizada. A análise FTIR mostrou que as amostras de CNPs produzidas a partir de macromoléculas pelo método hidrotérmico possuíam uma grande quantidade de precursor não degradado. Para as restantes CNPs foi verificada a presença de grupos funcionais polares que lhes conferem solubilidade em meio aquoso. Com 1H-RMN verificou-se uma diminuição de grupos alifáticos e aumento de grupos aromáticos nas CNPs de cortiça carbonizada, com o aumento da temperatura de carbonização. O potencial ζ da amostra obtida com maior temperatura de carbonização foi -25,7mV. Nos estudos in vitro realizados apenas as NPs produzidas a partir de ácido cítrico e etilenodiamina por via hidrotérmica marcaram eficazmente as linhas celulares de osteoblastos e de fibroblastos. A eficiência da marcação aparenta ser dependente do tempo de incubação com CNPs.

Thomsen-Friedenreich antigens in bladder cancer: evaluation of their prognostic value

RESUMO: Introdução. O cancro de bexiga é uma patologia comum que representa o 6° e o 5° cancro mais incidente em Portugal e na Itália, respetivamente. Em mais de metade dos casos ocorre reincidência durante o primeiro ano, requerendo acompanhamento clínico ao longo da vida. A instilação intravesical de Bacillus Calmette-Guérin (BCG) (uma estirpe atenuada do Mycobacterium bovis) representa uma imunoterapia eficaz no combate ao cancro de bexiga, no entanto, muitos aspetos da interação de BCG com as células tumorais bem como com as células do sistema imunitário permanecem por desvendar. As células tumorais de bexiga expressam frequentemente as formas sialiladas dos antigénios de Thomsen-Friedenreich (TF), i.e., sialil-T (sT) e sialil-Tn (sTn). Contudo ainda se desconhece o significado da sua expressão na malignidade tumoral e se afeta a eficácia da terapêutica BCG. Objetivo do estudo. Investigar o papel dos antigénios sT e sTn no fenótipo maligno de células de cancro de bexiga bem como na resposta mediada pelo sistema imunitário à terapia com BCG. Metodologia. Para tal, foram utilizadas as linhas celulares de cancro da bexiga HT1376 e MCR, geneticamente modificadas por transdução com vetores codificantes para as sialiltransferases ST3GAL1 ou ST6GALNAC1, de forma a expressar homogeneamente os antigénios sT ou sTn respetivamente. Estes modelos celulares foram estudados após confronto com BCG. O nível de BCG internalizado foi avaliado por citometria de fluxo. O perfil global de expressão genética dos modelos celulares antes e após incubação com BCG foi analisado pela tecnologia de microarray. O perfil de citocinas secretadas pelos modelos celulares após incubação com BCG, bem como de macrófagos estimulados pelo secretoma de células de cancro de bexiga que por sua vez foram estimuladas previamente por BCG, foi estudado pelo sistema multiplex de “imuno-esferas”. Resultados. A análise do transcritoma dos modelos celulares revelou que grupos de genes envolvidos em funções específicas foram modulados em paralelo nos dois modelos celulares, após transdução, independentemente da sialiltransferase expressa. Ou seja, em células que expressavam a sialiltransferase ST3GAL1 ou ST6GALNAC1, os genes envolvidos na regulação da segregação cromossómica e na reparação do DNA foram consistentemente regulados negativamente. Genes descritos na literatura como marcadores para o cancro de bexiga foram também modulados. A incubação com BCG resultou numa tendência ao aumento da expressão de genes relevantes na preservação e estabilidade genómica e menor malignidade, no entanto, apenas em células que expressavam sT ou sTn. Entre as dez citocinas testadas, apenas a IL-6 e IL-8 foram expressas pelas linhas celulares de cancro da bexiga, com indução destas após estimulação com BCG, e principalmente em células que expressavam ST3GAL1 ou ST6GALNAC1. Em macrófagos, citocinas inflamatórias, tais como IL-1β, IL-6 e TNFα, e a citocina anti-inflamatória IL-10, foram induzidas apenas pelo secretoma de células de cancro da bexiga confrontadas com BCG, com maior relevância quando estas expressavam ST3GAL1 ou ST6GALNAC1, prevendo a estimulação de macrófagos semelhantes aos de tipo M1 e uma melhor resposta à terapia com BCG. Conclusões. O efeito geral da expressão destas sialiltransferases e dos produtos enzimáticos sT ou sTn nas células de cancro de bexiga conduz a um fenótipo de maior malignidade. Contudo, a maior avidez de estas na produção de citocinas inflamatórias após confronto com BCG, bem como a maior capacidade de estimulação de macrófagos, predirá uma resposta à terapia com BCG mais eficaz em tumores que expressem os antigénios de TF sialilados. Tais conclusões são totalmente concordantes com os nossos mais recentes dados clínicos obtidos em colaboração, que mostram que em doentes com cancro de bexiga que expressam sTn respondem melhor a terapia BCG. ----------ABSTRACT: Background. Bladder cancer is a common malignancy representing the 6th and the 5th most incident cancer in Portugal and in Italy, respectively. More than half of the cases relapse within one year, requiring though a lifelong follow-up. Intravesical instillation of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) (an attenuated strain of Mycobacterium bovis) represents an effective immunotherapy of bladder cancer, although many aspects of the interaction of BCG with cancer cells and host immune cells remain obscure. Bladder cancer cells often express the sialylated forms of the Thomsen-Friedenreich (TF), i.e., sialil-T (sT) e sialil-Tn (sTn). However, it’s still unknown the sense of such expression in tumour malignancy and in the BCG therapy efficacy. Aim of the study. To investigate the role of the sT and sTn antigens on the malignant phenotype of bladder cancer cells and the immune mediated response to BCG therapy. Experimental. We have utilized populations of the bladder cancer cell lines HT1376 and MCR, genetically modified by transduction with the sialyltransferases ST3GAL1 or ST6GALNAC1 to express homogeneously sT or sTn antigens. The level of BCG internalized was assessed by flow cytometry. The whole gene expression profile of BCG-challenged or unchallenged bladder cancer cell lines was studied by microarray technology. The profile of cytokines secreted by BCG-challenged bladder cancer cells and that of macrophages challenged by the secretome of BCG-challenged bladder cancer cells was studied by multiplex immune-beads assay. Results. Transcriptome analysis of the sialyltransferase-transduced cells revealed that groups of genes involved in specific functions were regulated in parallel in the two cell lines, regardless the sialyltransferase expressed. Namely, in sialyltransferase-expressing cells, genes involved in the proper chromosomal segregation and in the DNA repair were consistently down-regulated, while genes reported in literature as markers for bladder cancer were modulated. BCG-challenging induced a tendency to up-regulation of the genes preserving genomic stability and reducing malignancy, but only in cells expressing either sT or sTn. Among the ten cytokines tested, only IL-6 and IL-8 were expressed by bladder cancer cell lines and up-regulated by BCG-challenging, mainly in sialyltransferases-expressing cells. In macrophages, inflammatory cytokines, such as IL-1β, IL-6 and TNFα, and the antinflammatory IL-10 were induced only by the secretome of BCG-challenged bladder cancer cells, particularly when expressing either sialyltransferase, predicting the stimulation of M1-like macrophages and a better response to BCG therapy. Conclusions. The general effect of the expression of the two sialyltransferases and their products in the bladder cancer cells is toward a more malignant phenotype. However, the stronger ability of sialyltransferase expressing cells to produce inflammatory cytokines upon BCG-challenging and to stimulate macrophages predicts a more effective response to BCG in tumours expressing the sialylated TF antigens. This is fully consistent with our recent clinical data obtained in collaboration, showing that patients with bladder cancer expressing sTn respond better to BCG therapy.

Cellular reprogramming strategies for degenerative disorders involving the retinal pigment epithelium

RESUMO: A reprogramação celular permite que uma célula somática seja reprogramada para outra célula diferente através da expressão forçada de factores de transcrição (FTs) específicos de determinada linhagem celular, e constitui uma área de investigação emergente nos últimos anos. As células somáticas podem ser experimentalmente manipuladas de modo a obter células estaminais pluripotentes induzidas (CEPi), ou convertidas directamente noutro tipo de célula somática. Estas descobertas inovadoras oferecem oportunidades promissoras para o desenvolvimento de novas terapias de substituição celular e modelos de doença, funcionando também como ferramentas valiosas para o estudo dos mecanismos moleculares que estabelecem a identidade celular e regulam os processos de desenvolvimento. Existem várias doenças degenerativas hereditárias e adquiridas da retina que causam deficiência visual devido a uma disfunção no tecido de suporte da retina, o epitélio pigmentar da retina (EPR). Uma destas doenças é a Coroideremia (CHM), uma doença hereditária monogénica ligada ao cromossoma X causada por mutações que implicam a perda de função duma proteína com funções importantes na regulação do tráfico intracelular. A CHM é caracterizada pela degenerescência progressiva do EPR, assim como dos foto-receptores e da coróide. Resultados experimentais sugerem que o EPR desempenha um papel importante na patogénese da CHM, o que parece indicar uma possível vantagem terapêutica na substituição do EPR nos doentes com CHM. Por outro lado, existe uma lacuna em termos de modelos in vitro de EPR para estudar a CHM, o que pode explicar o ainda desconhecimento dos mecanismos moleculares que explicam a patogénese desta doença. Assim, este trabalho focou-se principalmente na exploração das potencialidades das técnicas de reprogramação celular no contexto das doenças de degenerescência da retina, em particular no caso da CHM. Células de murganho de estirpe selvagem, bem como células derivadas de um ratinho modelo de knockout condicional de Chm, foram convertidos com sucesso em CEPi recorrendo a um sistema lentiviral induzido que permite a expressão forçada dos 4 factores clássicos de reprogramação, a saber Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Estas células mostraram ter equivalência morfológica, molecular e funcional a células estaminais embrionárias (CES). As CEPi obtidas foram seguidamente submetidas a protocolos de diferenciação com o objectivo final de obter células do EPR. Os resultados promissores obtidos revelam a possibilidade de gerar um valioso modelo de EPR-CHM para estudos in vitro. Em alternativa, a conversão directa de linhagens partindo de fibroblastos para obter células do EPR foi também abordada. Uma vasta gama de ferramentas moleculares foi gerada de modo a implementar uma estratégia mediada por FTs-chave, seleccionados devido ao seu papel fundamental no desenvolvimento embrionário e especificação do EPR. Conjuntos de 10 ou menos FTs foram usados para transduzir fibroblastos, que adquiriram morfologia pigmentada e expressão de alguns marcadores específicos do EPR. Adicionalmente, observou-se a activação de regiões promotoras de genes específicos de EPR, indicando que a identidade transcricional das células foi alterada no sentido pretendido. Em conclusão, avanços significativos foram atingidos no sentido da implementação de tecnologias de reprogramação celular já estabelecidas, bem como na concepção de novas estratégias inovadoras. Metodologias de reprogramação, quer para pluripotência, quer via conversão directa, foram aplicadas com o objectivo final de gerar células do EPR. O trabalho aqui descrito abre novos caminhos para o estabelecimento de terapias de substituição celular e, de uma maneira mais directa, levanta a possibilidade de modelar doenças degenerativas da retina com disfunção do EPR numa placa de petri, em particular no caso da CHM.---------------ABSTRACT: Cellular reprogramming is an emerging research field in which a somatic cell is reprogrammed into a different cell type by forcing the expression of lineage-specific transcription factors (TFs). Cellular identities can be manipulated using experimental techniques with the attainment of pluripotency properties and the generation of induced Pluripotent Stem (iPS) cells, or the direct conversion of one somatic cell into another somatic cell type. These pioneering discoveries offer new unprecedented opportunities for the establishment of novel cell-based therapies and disease models, as well as serving as valuable tools for the study of molecular mechanisms governing cell fate establishment and developmental processes. Several retinal degenerative disorders, inherited and acquired, lead to visual impairment due to an underlying dysfunction of the support cells of the retina, the retinal pigment epithelium (RPE). Choroideremia (CHM), an X-linked monogenic disease caused by a loss of function mutation in a key regulator of intracellular trafficking, is characterized by a progressive degeneration of the RPE and other components of the retina, such as the photoreceptors and the choroid. Evidence suggest that RPE plays an important role in CHM pathogenesis, thus implying that regenerative approaches aiming at rescuing RPE function may be of great benefit for CHM patients. Additionally, lack of appropriate in vitro models has contributed to the still poorly-characterized molecular events in the base of CHM degenerative process. Therefore, the main focus of this work was to explore the potential applications of cellular reprogramming technology in the context of RPE-related retinal degenerations. The generation of mouse iPS cells was established and optimized using an inducible lentiviral system to force the expression of the classic set of TFs, namely Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. Wild-type cells, as well as cells derived from a conditional knockout (KO) mouse model of Chm, were successfully converted into a pluripotent state, that displayed morphology, molecular and functional equivalence to Embryonic Stem (ES) cells. Generated iPS cells were then subjected to differentiation protocols towards the attainment of a RPE cell fate, with promising results highlighting the possibility of generating a valuable Chm-RPE in vitro model. In alternative, direct lineage conversion of fibroblasts into RPE-like cells was also tackled. A TF-mediated approach was implemented after the generation of a panoply of molecular tools needed for such studies. After transduction with pools of 10 or less TFs, selected for their key role on RPE developmental process and specification, fibroblasts acquired a pigmented morphology and expression of some RPE-specific markers. Additionally, promoter regions of RPE-specific genes were activated indicating that the transcriptional identity of the cells was being altered into the pursued cell fate. In conclusion, highly significant progress was made towards the implementation of already established cellular reprogramming technologies, as well as the designing of new innovative ones. Reprogramming into pluripotency and lineage conversion methodologies were applied to ultimately generate RPE cells. These studies open new avenues for the establishment of cell replacement therapies and, more straightforwardly,raise the possibility of modelling retinal degenerations with underlying RPE defects in apetri dish, particularly CHM.