Heuristics and policies for online pickup and delivery problems

Master Thesis

Sistema de Informação Geográfica aplicado ao transporte de reclusos

Trabalho de Projeto apresentado como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciência e Sistemas de Informação Geográfica

Comparison of different techniques for mouse transgenesis

RESUMO: O uso de ratinhos transgénicos em neurociências aumentou consideravelmente nos últimos anos devido ao crescente interesse em compreender o cérebro e a necessidade de solucionar situações clínicas do foro neurológico e psiquiátrico. Para esse efeito, diferentes métodos de produção de animais transgénicos têm sido testados. O objectivo desta tese foi comparar métodos de integração aleatória de um transgene no genoma de ratinhos em termos de eficiência, estabilidade da integração do transgene, número de animais e de horas de trabalho necessárias para cada método. Assim, foi comparado o método mais utilizado - microinjecção pronuclear (PNMI) - com duas outras técnicas cujo desempenho foi considerado promissor – a transferência génica através dos testículos por electroporação e transfecção por lentivírus in vivo. As três técnicas foram realizadas usando um gene repórter sob o controlo de um promotor constitutivo, e depois reproduzidas usando um gene de interesse de modo a permitir obtenção de um animal capaz de ser usado em experimentação laboratorial. O transgene de interesse utilizado codifica uma proteína de fusão correspondendo a uma variante da rodopsina (channelrhodopsin) fundida à proteína enhanced yellow fluorescente protein ((EYFP) resultando num produto designado ChR2-EYFP. Este animal transgénico apresentaria expressão deste canal iónico apenas em células dopaminergicas, o que, com manipulação optogenética, tornaria possivel a activação especifica deste grupo de neurónios e, simultaneamente, a observação do impacto desta manipulação no comportamento num animal em livre movimento. Estas ferramentas são importantes na investigação básica em neurociências pois ajudam a esclarecer o papel de grupos específicos de neurónios e compreender doenças como a doença de Parkinson ou a esquizofrenia onde a função de certos tipos de neurónios de encontra alterada. Quando comparados os três métodos realizados verifica-se que usando um gene repórter PMNI resulta em 31,3% de, a de animais transgénicos obtidos, a electroporação de testículos em 0% e a injecção de lentivírus em 0%. Quando usado o gene de interesse, os resultados obtidos são, respectivamente, 18,8%, 63,9% e 0%.--------------ABSTRACT: The use of transgenic mice is increasing in all fields of research, particularly in neuroscience, due to the widespread need of animal models to solve neurological and psychiatric medical conditions. Different methodologies have been tested in the last decades in order to produce such transgenic animals. The ultimate goal of this thesis is to compare different methods of random integration of a transgene in the genome of mice in terms of efficiency, stability of the transgene integration, number of animals required and the labour intensity of each technique. We compared the most used method – pronuclear microinjection (PNMI) – with two other promising techniques – Testis Mediated Gene Transfer (TMGT) by electroporation and in vivo lentiviral transfection. The three techniques were performed using a reporter gene – green fluorescent protein (GFP), whose transcription was driven by the constitutive cytomegalovirus (CMV) promoter. These three techniques were later reproduced using the tyrosine hydroxylase promoter (TH) and the neuronal manipulator, channelrhodopsin-2 fused to the enhanced yellow fluorescent reporter protein (ChR2-EYFP). The transgenic animal we sough to produce would express the light driven channel only in dopaminergic cells, making possible to specifically activate this group of neurons, while simultaneously observe the behaviour in a freely moving animal. This is a very important tool in basic neuroscience research since it helps to clarify the role of specific groups of neurons, map circuits in the brain, and consequently understand neurological diseases such as Parkinson’s disease or schizophrenia, where the function of certain types of neurons is affected. When comparing the three methods, it was verified that using a reporter gene PNMI resulted in 31.3% of transgenic mice obtained, testis electroporation in 0% and lentiviral injection in 0%. When using the gene of interest, the results obtained were, respectively, 18.8%, 63.9% and 0%.

Derivation and consistency checking of models in early software product line engineering

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Engenharia Informática

Expressão e purificação da proteína E3 do vírus chikungunya (CHIKV)

RESUMO: O vírus chikungunya (CHIKV) é um vírus de RNA, com invólucro, da família Togaviridae, transmitido por mosquitos Aedes spp. Distribuído por largas regiões de África e Ásia, causa grandes epidemias de artrite grave. A semelhança de sintomas com outras doenças como a dengue e a malária e a persistência de IgM específicas, dificultam o diagnóstico da infeção por CHIKV. A deteção no sangue de E3, uma glicoproteína viral secretada, a incluir num ensaio imunoenzimático poderá melhorar o diagnóstico nos países onde as técnicas de biologia molecular são de difícil acesso. Para testar a utilidade de E3 num ensaio de diagnóstico, esta deverá ser expressa em quantidade, purificada e usada para produção de anticorpos específicos. Para expressar E3 numa forma solúvel, suscetível de ser purificada num único passo cromatográfico sem proteases, recorreu-se à estratégia da fusão com o domínio de ligação à quitina (CBD)-inteína (IMPACT™ System, NEB). A sequência codificadora de E3 foi amplificada a partir de RNA viral, clonada em pTYB21 e expressa em E. coli como uma proteína de fusão insolúvel de 64 kDa. A expressão a 12ºC induzida por IPTG 0,1 mM aumentou a solubilidade de CBD-inteína-E3. A aplicação de lisados celulares em colunas de quitina originou a retenção de CBD-inteína-E3 na matriz. Porém, a autoclivagem da inteína na coluna, induzida com reagentes tiol, foi pouco eficiente e mesmo a proteína E3 separada não eluiu da coluna. E3 foi ainda expressa em E. coli com uma cauda de seis histidinas (E3[His]6) por clonagem no vetor pET28b(+). Lisados celulares aplicados em colunas de níquel permitiram a eluição de uma proteína de 9 kDa, compatível com a massa molecular estimada para E3[His]6, ainda que com outros contaminantes proteicos. A identidade da proteína de 9 kDa será confirmada pela indução de anticorpos com esta preparação e reatividade daqueles com células infetadas com CHIKV.----------------ABSTRACT: Chikungunya virus (CHIKV) is an enveloped, positive strand RNA virus belonging to the family Togaviridae. Transmitted by Aedes spp mosquitoes, CHIKV causes large epidemics of severe arthritogenic disease in Africa and Asia and represents a serious threat in countries where vectors are present. Symptoms similarity with other diseases, e.g. dengue and malaria, along with CHIKV IgM persistence turns accurate CHIKV diagnosis a difficult task in low-income countries. Detection of E3, a small secreted viral glycoprotein, to be included in an immunoenzymatic test was envisaged as a possible improvement in CHIKV diagnosis. To test the diagnostic value of E3, recombinant E3 should be expressed and purified to generate antibodies. In order to express CHIKV E3 in a soluble form amenable to purification by a single step affinity chromatography, the chitin binding domain (CBD)-intein fusion strategy without proteases (IMPACT™ System, NEB) was employed. The E3 coding sequence was amplified from viral RNA, cloned in pTYB21 and expressed in E. coli ER2566 as an insoluble 64 kDa CBD-intein-E3 fusion protein. Solubility was partially achieved by lowering the expression temperature to 12ºC and the inducer (IPTG) concentration to 0.1 mM. Clarified cell lysate loaded onto a chitin column allowed ligation of the fusion protein but the intein-mediated cleavage efficiency was low and E3 failed to elute from the column as demonstrated by SDS-PAGE. E3 was further expressed with a six histidine tag, E3[His]6, employing the pET System (Novagen). E3[His]6 was expressed in E. coli Rosetta (30ºC, 0.4 mM IPTG) as a 9 kDa protein. Soluble cell extracts in 20-40 mM imidazole, applied onto a nickel column and eluted with 500 mM imidazole yielded a protein preparation enriched in the 9kDa protein. The 9 kDa will be used as antigen to generate antibodies that upon reaction with CHIKV infected cells will confirm its identity.

A technology diffusion perspective of Enterprise Resource Planning across European Small and Medium Enterprises: from determinants to Use to Value

Tese apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Gestão de Informação

T cell Maturation and Regulatory T Cell Differentiation:From the Thymus to the Periphery

Immunological tolerance, that is, the failure to mount an immune response to an otherwise immunogenic molecule, is one of the fundamental questions in immunology. The fact that lymphocytes express antigen receptors that are generated randomly and have the potential to recognize any conceivable antigen, adds another puzzle to the physiology of immunological tolerance. The other side of the coin, the general absence of immune responses to self antigens, is ensured by a tight regulation and several selection steps during T and B cell differentiation. One of these processes is the differentiation of regulatory T cells (Treg). While developing in the thymus, T cell clones bearing receptors with high affinity/avidity to antigens present at the time of differentiation may be eliminated by apoptosis or, alternatively, express Foxp3 and become Treg. Treg are key players in the regulation of immunological tolerance since humans and mice with complete loss of function variants of this gene develop fatal autoimmune conditions early in life.(...)

Estudo da expressão génica da Legionella pneumophila estirpe paris após co-cultura em Acanthamoeba castellanii

RESUMO: A Legionella é um bacilo Gram-negativo que replica dentro de protozoários como Acanthamoeba castellanii (A. castellanii) e no interior de macrófagos alveolares humanos, podendo resultar numa pneumonia grave. A Legionella em meio líquido tem um ciclo de vida bifásico, apresentando traços replicativos na fase exponencial e expressando factores transmissíveis na fase estacionária. Estudos recentes demonstraram que a Legionella precisa de assegurar um tempo preciso no seu ciclo de vida para efectuar com êxito a infecção das células hospedeiras. Muitos modelos de estudo foram desenvolvidos a fim de aumentar o conhecimento sobre o ciclo de vida intracelular e identificar os genes necessários para a modulação da célula hospedeira. Embora o conhecimento sobre a interacção bactéria-hospedeiro ainda seja limitado, parece que esta interacção gera um conjunto de características de virulência permitindo que a bactéria infecte células fagocíticas humanas e cause doença. O objectivo do presente projecto de investigação foi investigar e seleccionar genes críticos para a infecciosidade da Legionella pneumophila estirpe Paris (Lp Paris), desenhar e optimizar uma técnica de PCR em tempo real para o estudo da expressão génica e comparar o perfil de expressão da Lp Paris antes e depois da co-cultura em A. castellanii. Os resultados mostraram que oito dos 12 genes em estudo alteraram a sua expressão relativa após co-cultura em A. castellanii quando os ensaios foram realizados com culturas de Lp Paris na fase estacionária precoce (cinco foram induzidos e três reprimidos) Quando os ensaios foram realizados com culturas de Lp Paris na fase estacionária tardia 11 genes apresentaram repressão na sua expressão relativa. Analisando os resultados, concluímos que o perfil de expressão de Lp Paris foi modificado pela interacção com A. castellanii, no entanto essa mudança foi dependente da fase do seu ciclo de vida.-------ABSTRACT: Legionella is a pathogenic Gram-negative bacterium that replicates not only within aquatic protozoa like Acanthamoeba castellanii (A. castellanii), but also within human alveolar macrophages, which can result in a severe pneumonia. Legionella has a biphasic life cycle in broth, where exponential phase cultures display replicative traits and stationary bacteria express transmissive factors. Recent studies demonstrated that for successful infection of host cells, Legionella needs to ensure a precise timing of its life cycle. Many models of study were developed in order to learn about the intracellular life cycle and to identify the genes necessary for the host cell modulation. Although knowledge about the bacteria-host interaction is still limited, it appears that this interaction generate a pool of virulence traits, allowing the bacterium to infect human phagocytic cells and cause disease. The purpose of the present study was to investigate and select de critical genes for the infectivity of Legionella pneumophila strain Paris (Lp Paris), design and optimize a real time PCR technique for gene expression study and compare the expression profile of Lp Paris before and after co- culture of A. castellanii. The results show that eight of 12 genes in study changed its relative expression after coculture in A. castellanii when we performed the intracellular assays with early stationary phase Lp Paris cultures (five were induced and tree were repressed). When we performed the intracellular assays with late stationary phase Lp Paris cultures 11 genes showed a repressed relative expression. Analysing the results, we conclude that the expression profile of Lp Paris was modified by interaction with A. castellanii but this change was dependent of the timing of its life cycle.

Evaluation of pathogenic potential of Aeromonas spp. strains using in vitro methodologies

Dissertation to obtain a Master Degree in Molecular Genetics and Biomedicine

Envelhecimento ativo, capacidade funcional e atividade física: análise de fatores que contextualizam o processo de envelhecimento e sua percepção por parte de pessoas idosas

RESUMO: O envelhecimento populacional saudável ocupa parte da agenda do processo do envelhecimento humano, retratando uma preocupação social com repercussões nas economias societárias. O processo de envelhecimento, quando abordado fora do paradigma do envelhecimento saudável, desconsidera socialmente o potencial humano das pessoas idosas, promovendo a segregação e motivando atitudes de preconceito e discriminação, além de desperdiçar a experiência, o saber, a cultura e a capacidade de participação da pessoa idosa como contributo para a sociedade a que ela está inserida. O foco central da Política Nacional de Saúde do Idoso brasileira se inscreve na promoção de um envelhecimento saudável, nomeadamente por meio da manutenção da capacidade funcional ao valorizar a autonomia, a independência física e a integridade mental da pessoa idosa. O desafio para a viabilização do processo de envelhecimento ativo e bem-sucedido consiste na maximização das capacidades, potencialidades e recursos pessoais, comunitários e políticos. Pressupõe, também, uma concepção ampliada de viver, contextualizada no contínuo da vida, capaz de externar a preocupação com a saúde e o bem-estar, integrando as pessoas em fase de envelhecimento no contexto do ciclo de vida. Diante do exposto, a presente investigação objetivou conhecer os determinantes de envelhecimento ativo e bem-sucedido, numa população em processo de envelhecimento e relacioná-los com as ―práticas/conteúdos‖ e representações / significados‖ sobre o envelhecimento, as atividades físicas e a capacidade funcional. A investigação foi estruturada em três estudos: no primeiro foi criado e testado o instrumento ―Envelhecimento ativo, capacidade funcional e atividade física‖, na cidade de Lisboa, Portugal, e posteriormente realizada sua adaptação cultural e linguística do português de Portugal para o do Brasil. No segundo foi feita uma pesquisa observacional do tipo survey, descritiva e exploratória com o objetivo de conhecer as relações esteabelecidas entre o envelhecimento bem-sucedido, ativo, a atividade física e a capacidade funcional de uma população em processo de envelhecimento; e no terceiro momento foi realizado um estudo de cariz qualitativo com o objetivo de captar as percepções e comportamentos dos entrevistados diante do fato de se sentirem ou não pessoas idosas ou envelhecidas. Foram adotados os seguintes referenciais teóricos: envelhecimento ativo, envelhecimento bem sucedido, concepção muldidimensional do processual do envelhecimento (determinantes pessoais, familiares, sociais, psicocomunicacionais, econômicos e de saúde), atividade física e capacidade funcional e abordados à luz do perfil demográfico e da experiência das realidades européias, americana e brasileira. Foram triagulados métodos e técnicas (entrevista individual gravada, mensurações e questionário). Participaram pessoas com 60 anos de idade ou mais vinculadas que frequentam dois programas públicos destinados às pessoas idosas na cidade de Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil e foram excluidas as participações de pessoas com dependência para atividades da vida diária, para as atividades instrumentais da vida diária e com alteração do nível de consciência. Amostra aleatória estratificada composta por 326 participantes na qual foram realizadas mensurações e amostra por tipicidade construída a partir da base amostral composta de 87 participantes na qual foi realizada entrevista individual gravada. Atendidos todos os requisitos éticos e legais de pesquisa envolvendo seres humanos, segundo legislação brasileira. Aplicada Análise Fatorial e selecionados 11 fatores com 31 variáveis que contemplaram os determinantes do processo de envelhecimento ativo. Realizado reajustamento da análise fatorial,por questão de coerência conceptual, sendo selecionado oito fatores nomeados de acordo com o referencial teórico adotado que resultou em 25 variáveis que abordaram a participação em atividades e acesso aos serviços de saúde; à atividade física; à convivência, interação e avaliação do contato social; à escolaridade e renda; à saúde percebida e ao voluntariado. Utilizado como marcador para a atividade aeróbia o perfil da sobrecarga da atividade física semanal em consonância com diretrizes e recomendações de atividades aeróbias de intensidade moderada para as pessoas idosas. Identificado que 60,7% dos entrevistados realizam atividade física insuficiente. Os indicadores antropométricos utilizados evidenciaram índices de sobrepeso e de obesidade tanto entre os homens quanto entre as mulheres. Houve correlação do índice de massa corporal (IMC) com as medidas efetuadas segundo as faixas etárias. A análise inferencial possibilitou relacionar os determinantes do envelhecimento ativo, as medidas antropométricas e as variáveis sociodemográficas (escolaridade e idade), sendo obtidos os seguintes destaques: 1) à medida em que a idade aumenta, diminuem os níveis de prática da atividade física, dos contatos com as pessoas para conversar (das relações de convivência), dos trabalhos de voluntariado e das relações familiares e intergeracionais; 2) foi identificado um alinhamento conceptual dos diferentes determinantes concorrentes para um envelhecimento ativo à luz da prática da atividade física com a convivência e interação com os familiares e com auto-avaliação positiva da saúde percebida e atividade física; 3) quanto maior a idade menor os anos de escolaridade; 4) a diminuição da área transversa do braço e do IMC à medida que a idade aumenta, retratou diminuição da adiposidade corporal que está associada à perda da massa magra. A categorização do discurso dos 87 entrevistados permitiu captar a percepção do processo de envelhecimento por dois critérios antagônicos: preservação da autonomia e presença da deterioração. Foi caracterizado o sistema de crenças dos participantes com 1090 emissões de crenças. Houve tendência do sistema de crenças à centralidade com 638 (58,6%) crenças retratando concepções e situações difíceis de serem modificadas por processos educacionais. Os resultados obtidos diagnosticaram e reiteraram a tendência de incremento numérico de pessoas com 60 anos de idade ou mais na cidade brasileira de Juiz de Fora. Embora o estatuto do idoso esteja alicerçado em princípios do envelhecimento saudável e ativo ficou evidenciado a necessidade de estratégias para implementá-la com vistas a impactos sociais, econômicas e de saúde na perspectiva da prática de atividade física e da preservação da capacidade funcional. Constituem contribuição da presente investigação: 1) fundamentos teóricos e informação sobre juiz-foranos com 60 anos de idade ou mais segundo dimensões social, econômica, cultural e espiritual numa concepção ampliada de saúde; 2) abordagem do envelhecimento de forma processual e integrada, multidimensional e articulada com o ciclo da vida; 3) diagnóstico do grau de autonomia dos participantes permitindo subsidiar decisões para melhorar a capacidade funcional dos mesmos; 4) processo investigativo utilizando modelos teóricos que permitiram estabelecer um diagnóstico local e contextualizar o processo de envelhecimento para os participantes e 5) sobrecarga semanal de atividade física e os indicadores antropométricos dos participantes a ponto de subsidiar parâmetros de indicação terapêutica para manutenção da capacidade funcional.-------- ABSTRACT: The populational healthy aging holds part of the process of the human aging agenda, portraying a social concern with the repercussion in societary economies. The aging process when addressed out of the healthy aging paradigm socially disregard the human potential of the elderly, promoting segregation and motivating acts of prejudice and discrimination, in addition to the waste of experience, knowledge, culture and the participatory capacity of an older person in contributting to the society they are a part of. The Brazilian National Health Policy for the Elderly has its main focus in promoting the healthy aging, namely through the maintenance of the functional capacity by valuing the autonomy, physical independence and the mental integrity of the elderly person. The challenge of enabling the process of a successful and active aging lays in maximazing the capabilities, potencialities and personal, communitary and political resources. It infers additionaly a broad view of living, contextualized in the continuum of life, able to express concern with health and well-being, integrating the people in aging phase to the context of the life cycle. Hence, this research aimed to learn the determinants of active and successful aging in a population in aging process and relate them with the "practices/contents" and "representations/meanings" about aging, the physical activities and functional capacity. The investigation was structured in three studies: in the first it was developed and tested the instrument "Active Aging, Functional Capacity and Physical Activity" in the city of Lisboa, Portugal, and afterwards it was culturally and linguistically adapted from Portugal Portuguese to Brazilian Portuguese. The second study was an observational research with survey, descriptive and exploratory methods which aimed to learn the relations established between the successful aging, active aging, the physical activity and the functional capacity of a population in aging process; and the third comprised a qualitative study with the objective to collect the understanding and behavior of the interviewees based on the fact of either they saw themselves as elder or aged person or not. As theoretical framework were explored: active aging, successful aging, multidimensional concept of aging process (personal, familial, social, psycho-communicational, economic determinants), physical activity and functional capacity and explored based in demographic profile and in the European, American a Brazilian realities. Performed triangulation of methods and tecniques (recorded individual interviews, measurements and questionnaires). Participants were aged 60 or older included in two public services for the elderly population in the city of Juiz de Fora, Minas Gerais, Brazil and were excluded persons with dependency in both daily activities and instrumental daily activities and the persons with altered level of conciousness. Stratified ramdon sample of 326 participants in which were performed the measurements and typicality sample constructed from the sample basis of 87 participants whereupon the recorded individual interview was performed. Conforming to all the ethical and legal requirements of research with human beings according to the Brazilian legislation. Applied Factor Analysis and selected 11 factors and 31 variables that convey the determinants of the active aging process. Executed reajustment of factor analysis, for conceptual coherence, being selected eight factors named accordingly to the theoretical framework that resulted in 25 variables which approached the participation in activities and access to health care services; to physical activity; to coexistence, interaction and evaluation of social contact; to scholarity and income; to perceived health and volunteering. Used as marker to aerobic activity the profile of weekly physical activity overload in accordance with guidelines and reccomendations for moderate-intensity aerobic activities for older people. Identified that 60,7% of interviewees practice enough physical activity. Anthropometric markers evidence overweight and obesity levels both within men and women. There was correlation between body mass index (BMI) and measures carried out according to age ranges. The inferential analysis allowed relating the active aging determinants, the anthropometric measurements and sociodemographic variables (scholarity and age), obtaining the following highlights: 1) to the extent that age increases, lowers the levels of physical activity practice, of contact with people to talk to (social relationships), of volunteering work and familial and intergenerational relationships; 2) it was identified a conceptual alignment of diferent determinants concurrent to an active aging in light of the physical activity practice with the relationship and interaction of family and with positive self-assessment of perceived health and physical activity; 3) the older the person, lower are scholarity levels; 4) the decrease of the cross-sectional area of the arm and BMI as the age increases portrayed decreased adiposity of the body that is associated with loss of lean body mass. The categorization of the speech of 87 interviewees allowed to collect the understanding of the aging process by two opposite criteria: preservation of autonomy and existance of decline. It marked the belief system of participants with 1090 beliefs expressed. With tendency of the belief system to centrality with 638(58,6%) beliefs showing concepts and dificult situations to be changed through educational processes. The results diagnosed and reiterated the tendency of increase in the number of people aged 60 or older in the Brazilian city of Juiz de Fora. Although the elderly statute is built upon principles of healthy and active aging it was evident the need of strategies to implement it aiming at social, economic and health impacts in the perspective of physical education and preservation of the functional capacity. Constitute contributions of this study: 1) theoretical fundaments and data about Juiz de Fora citizens aged 60 or more according to social, economic, cultural and spiritual dimensions in a broad concept of health; 2) approach of aging in a procedural and integrative, multidimensional manner, articulated with the life cycle; 3) diagnosis of degree of autonomy of participants enabling decisions on how to improve their functional capacities; 4) investigative process using theoretical models which permit to stablish a local diagnosis and contextualize the aging process of participants and 5) weekly overload of physical activity and anthropometric indexes of participants as to subsidize parameters to therapeutic indication to the maintainence of functional capacity.

Avatars and the «Imitation Game» – can machines smile?

Considering Alan Turing’s challenge in «Computing Machinery and Intelligence» (1950) – can machines play the «imitation game»? – it is proposed that the requirements of the Turing test are already implicitly being used for checking the credibility of virtual characters and avatars. Like characters, Avatars aim to visually express emotions (the exterior signs of the existence of feeling) and its creators have to resort to emotion codes. Traditional arts have profusely contributed for this field and, together with the science of anatomy, shaped the grounds for current Facial Action Coding System (FACS) and their databases. However, FACS researchers have to improve their «instruction tables» so that the machines will be able, in a near future, to be programmed to carry out the operation of recognizing human expressions (face and body) and classify them adequately. For the moment, the reproductions have to resort to the copy of real life expressions, and the presente smile of avatars comes from mirroring their human users.

The internationalization of Vila Galé to the South of Brazil

A Work Project, presented as part of the requirements for the Award of a Masters Degree in Management from the NOVA – School of Business and Economics

Role of Notch signaling on the differentiation of early lymphoid progenitors cells: a view throughout the development of the embryonic chicken thymus and spleen

Dissertação para a obtenção do grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

A system’s approach to cache hierarchy-aware decomposition of data-parallel computations

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Informática

Cohesion decay: quantitative analysis of partial sister chromatid cohesion

Cell division is a highly dynamic process where sister chromatids remain associated with each other from the moment of DNA replication until the later stages of mitosis, giving rise to two daughter cells with equal genomes. The “molecular glue” that links sister DNA molecules is called cohesin, a tripartite ring-like protein complex composed of two Structural Maintenance of Chromosome proteins (Smc1 and Smc3) bridged by a kleisin subunit Rad21/Scc1, that together prevent precocious sister chromatid separation. Accumulating evidence has suggested that cohesion decay may be the cause of segregation errors that underlie certain human pathologies. However it remains to be determined how much cohesin loss abolishes functional sister chromatid cohesion. To answer these questions, we have developed different experimental conditions aiming to titrate the levels of cohesin on mitotic chromosomes in a precise manner. Using these tools, we will determine the minimal amount of cohesin needed to confer functional cohesion. The approaches described here take advantage of a system in Drosophila melanogaster where the Tobacco Etch Virus (TEV) protease can cleave the Rad21 subunit of cohesin leading to precocious sister chromatid separation. Firstly, we tried to express different levels of TEV protease to obtain partial loss of cohesion. However, this approach has failed to produce systematic different levels of sister chromatid separation. Most of the work was therefore focused on a second strategy, for which we established strains with different levels of cohesin sensitive/cohesin resistant to TEV protease. Strains containing different amounts of functional cohesin (TEV resistant) were tested by in vitro cleavage and by in vivo injections in embryos for their ability to promote sister chromatid cohesion. Our results reveal that removal of half of the cohesin complexes does not impair chromosome segregation, implying that chromosome cohesion is less sensitive to cohesin amounts than previously anticipated.