Avaliação de bacteriófagos com atividade antibacteriana em isolados provenientes de doentes com pneumonia associada ao ventilador

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Desenvolvimento de métodos moleculares para a deteção de Trypanosoma spp em glossinas (Diptera: Glossinidae) da República da Guiné Bissau

As moscas do género Glossina são vetores de patologias provocadas por várias espécies de parasita do género Trypanosoma, como a Tripanossomose Humana Africana e as Tripanossomoses Animais. A correta identificação destes tripanossomas é um ponto fulcral quando se procura determinar o risco de doença que determinadas populações de glossinas podem provocar. No presente trabalho foram utilizadas e adaptadas diversas metodologias de diagnóstico molecular, nomeadamente o PCR em tempo real e o PCR-RFLP, que permitiram, através da utilização de primers genéricos, a determinação da carga parasitária e a correta identificação dos tripanossomas presentes no vetor. Os primers denominados Tryp18SF e Tryp18SR foram desenvolvidos especificamente para serem utilizados na identificação das espécies de tripanossoma utilizando PCR em tempo real com metodologia SYBR® Green I e PCR-RFLP. Os primers denominados Tryp18S2F, Tryp18S2R e sonda Tryp18S2P foram desenvolvidos para a quantificação dos parasitas presentes nas amostras utilizando PCR em tempo real com metodologia Taqman®. Foi estudada uma amostra de 762 glossinas provenientes do território da República da Guiné-Bissau, zona atualmente considerada como estando livre de Tripanossomose Humana Africana, mas onde não são realizadas atividades de recenseamento de casos desde o final da ocupação portuguesa. Das 762 glossinas utilizadas, 241 estavam infetadas com tripanossomas, o que representa uma percentagem de infeção geral de 31,6 %. Destas glossinas, 28.63 % encontravam-se infetadas com Trypanosoma grayi, 14.11 % com Trypanosoma congolense, 7.05 % com Trypanosoma vivax e 0.83 % com Trypanosoma brucei brucei, tendo as infeções mistas representado 1.66 %. Não foi possível a identificação conclusiva ao nível da espécie em 48.13 % das amostras positivas, tendo estas ficado consideradas como Trypanosoma spp. Não foram identificados vetores infetados com tripanossomas responsáveis pelas patologias humanas. A utilização de primers genéricos para a identificação permitiu obviar o número de reações necessárias para identificar corretamente o parasita responsável pela infeção, e este trabalho é de resto a primeira descrição da utilização de primers genéricos que permitam a identificação de Trypanosoma grayi. Esta é também a primeira descrição da utilização de PCR em tempo real com metodologia Taqman® para quantificação de tripanossomas, e a sua utilização com primers genéricos aumenta a aplicabilidade em estudos epidemiológicos de grande escala. Palavras-chave: PCR em tempo real; PCR-RFLP; República da Guiné-Bissau; Glossina; Trypanosoma; Tripanossomose.

Transglutaminases de Anopheles gambiae: caracterização molecular, bioquímica e histológica.

A malária é causada por parasitas protozoários do género Plasmodium spp, a sua transmissão aos humanos deve-se à picada infecciosa de mosquitos fêmea do género Anopheles spp, sendo Anopheles gambiae o vector mais eficiente de malária em todo o mundo. O intestino médio do mosquito representa um dos ambientes mais desafiantes à sobrevivência e desenvolvimento do parasita, e é, portanto, também um dos locais mais atraentes para novas estratégias de controlo da malária, pois é onde se observa uma diminuição acentuada na população de parasitas invasores. A transglutaminase (TGM) desempenha um papel importante e diversificado em mamíferos, tais como a coagulação e a formação da barreira epitelial, catalisando o “crosslinking” entre proteínas. Em invertebrados, como Drosophila sp, a proteína TGM mostrou estar envolvida na defesa imunitária. O mosquito A. gambiae tem codificado no seu genoma três TGMs, o gene AGAP009099, já caracterizado, é expresso exclusivamente nas MAGs (glândulas auxiliares masculinas). Os genes AGAP009098 e AGAP009100, cujas funções não foram ainda clarificadas, são expressos ubiquamente e em baixos níveis. No presente trabalho, propõe-se a caracterização das duas proteínas codificadas por estes genes, de forma a identificar o modo como estas proteínas interagem dentro do mosquito, a esclarecer o seu papel na invasão do intestino médio de A. gambiae por Plasmodium spp., o que permitirá averiguar o seu envolvimento ao nível da imunidade inata do mosquito. Foi produzida e purificada a proteína recombinante AgTGM98-1, que se utilizou para a produção de um anticorpo anti-AgTGM98. A atividade de TGM no mosquito não se mostrou estatisticamente significativa entre os estadios larvares, pupas e adultos. A caracterização bioquímica de AgTGM98 e AgTGM100 revelou a possível existência de proteínas do tipo TGM. Através de western blotting, verificou-se uma diminuição de AgTGM98, comparando mosquitos não infetados com infetados por P. berghei, o que sugere alterações na expressão desta proteína face à invasão pelo parasita, o que pode significar o seu envolvimento direto na infeção. Caracterizou-se, por imunohistoquímica (IHC) a localização de AgTGM98 e AgTGM100 em intestinos médios de mosquitos. A proteína AgTGM98 apresentou uma localização membranar, na parte basal do intestino médio e com distribuição ao longo deste. Contrariamente, a AgTGM100 tem uma localização intracelular e uma distribuição presente apenas no proventrículo e zona mais apical do intestino médio durante uma fase da sua existência, sendo com o passar do tempo detectada em todo o intestino médio.

Avaliação económica da vacinação contra o vírus do papiloma humano 16 e 18 (CERVARIX®) : análise de custo-utilidade e custo-efetividade em mulheres dos 26 aos 55 anos em Portugal

RESUMO - O cancro do colo útero representa um importante problema de saúde pública em Portugal: é o terceiro cancro mais frequente nas mulheres entre os 15 e os 44 anos, originando a morte de 346 mulheres anualmente. Contudo, esta patologia é altamente evitável, nomeadamente, através da imunização contra a infeção HPV, que é a causa necessária para o desenvolvimento do cancro. A elevada prevalência da infeção em mulheres mais velhas sugere que a vacinação poderá ser uma estratégia custo-efetiva mesmo numa faixa etária superior. Para que seja racionalmente ponderada a comparticipação da vacina nestas mulheres é necessária a realização de um estudo fármaco-económico que comprove o custo-efetividade desta intervenção, já que o seu financiamento atual prevê apenas as mulheres não abrangidas pelo Programa Nacional de Vacinação, dos 18 aos 25 anos. Os objetivos do trabalho são realizar uma revisão da literatura sobre estudos de avaliação económica relativos à prevenção do CCU e avaliar a relação de custo-efetividade de vacinar mulheres contra o HPV entre os 26 e os 55 anos em comparação com a prática clínica corrente, em Portugal. É utilizado o Modelo Global Cervarix® e realiza-se uma análise de custo-utilidade e de custo-efetividade. Os resultados demonstraram que a vacinação em mulheres dos 26 aos 45 anos poderá ser uma opção custo-efetiva, permitindo um aumento de anos de vida, uma diminuição dos casos e mortes por CCU e um incremento de QALYs. O RCEI variou entre 7.914€/QALY e 29.049€/QALY com a vacinação aos 26 e aos 45 anos, respetivamente, para a alternativa de vacinação mais rastreio versus a situação atual de rastreio organizado e oportunístico, em Portugal.

Identificação de genoespécies do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.) circulantes na fauna ixodideológica em portugal

Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Microbiologia Médica

Pesquisa de assinaturas de selecção de malária na região do gene humano TPI (triosefosfato isomerase)

A malária continua a ser a maior causa de doença e mortalidade no Mundo, sobretudo no continente Africano. Das cinco espécies do parasita causador de malária em humanos, Plasmodium falciparum é a mais letal. Em termos evolutivos a malária é um fenómeno recente com cerca de 10 000 anos, período onde tem atuado como importante pressão seletiva no genoma humano, contribuindo para a seleção de inúmeros polimorfismos que propiciam maior resistência ao protozoário parasita. Apesar da interação entre o parasita e o hospedeiro ser foco de inúmeros estudos, é bastante complexa e ainda está longe de ser totalmente compreendida, nomeadamente os fatores de suscetibilidade/resistência à infeção ou à doença. Este estudo teve como principal objetivo contribuir para o estudo dos polimorfismos eritrocitários associados à proteção contra a infeção malárica grave, centrando-se no gene TPI que codifica uma enzima glicolítica. Foi selecionada uma amostra populacional Africana (Moçambique) agrupada de acordo com a gravidade da doença (grupos clínicos). Fez-se o rastreio dos exões do gene TPI por SSCP, na busca de alterações no padrão de migração dos produtos amplificados, indiciadores de alterações na sequência nucleotídica que pudessem ser assinaturas de eventuais efeitos evolutivos exercidos pela malária; caracterizaram-se as variantes do promotor do gene TPI: -5A>G, -8G>A e -24T>G; e analisou-se o polimorfismo intrónico 2262 situado no intrão 5. Esta análise permitiu identificar o polimorfismo -8G>A como possível marcador associado à proteção contra a malária, observando-se diferenças estatisticamente significativas entre doentes com malária grave e não-grave [P = 0,032; OR = 0,230 (CI95%: 0,049-1,081)], quando associado ao haplótipo -5G/-8A/2262G. Através de um estudo de microssatélites nas regiões adjacentes ao gene TPI, estimou-se a antiguidade dos polimorfismos -5G>A e -8G>A, tendo-se obtido a idade de ~20 mil anos e ~14 mil anos, respetivamente. Ao nível bioquímico, o polimorfismo -8G>A poderá estar associado à acumulação celular de metilglioxal citotóxico, um potente inibidor da proliferação parasitária.

Deteção de Neisseria gonorrhoeae em amostras de urina de utentes de uma consulta de venereologia

Introdução: A vigilância epidemiológica dos agentes infeciosos é fundamental como atividade de controlo das doenças sexualmente transmissíveis. A gonorreia é uma das infeções sexualmente transmissíveis (IST) mais comum e é causada pela bactéria Neisseria gonorrhoeae. Os dados sobre os diferentes microrganismos causadores de IST são escassos em Portugal e a vigilância tradicional não é suficiente. Em muitos casos de infeção por N. gonorrhoeae, os pacientes são tratados empiricamente através de uma abordagem sindromática por vezes sem recurso a análises laboratoriais que confirmem a infeção e, além disso, existem os casos assintomáticos que contribuem para a contínua propagação da infeção por N. gonorrhoeae. A gonorreia é tratável e curável mas não está disponível uma vacina. Consequentemente, o controlo desta doença depende da identificação e tratamento de indivíduos infetados e dos seus contactos na rede de transmissão. Por outro lado, quando é efetuada cultura os resultados apresentam ocasionalmente falsos negativos, devido às características exigentes de crescimento da N. gonorrhoeae in vitro ou à automedicação prévia do doente. Objetivos: Avaliar a ocorrência de infeções por Neisseria gonorrhoeae entre utentes de uma consulta de venereologia, nos primeiros seis meses de 2011. Métodos: Estudo transversal. Amostragem consecutiva, cálculo do número de amostras pela fórmula de Wald para um nível de confiança de 95% e um erro de previsão de 3,3%. Foram analisadas 145 amostras de urina utilizando técnicas de amplificação de ácidos nucleicos com alvos diferentes. A identificação de Neisseria gonorrhoeae foi efetuada pela deteção de uma sequência do pseudogene porA de N. gonorrhoeae por técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real e pela deteção de uma sequência do gene ccpB de N. gonorrhoeae por técnica de PCR. Critérios de exclusão: recusa em participar ou apresentar problemas para o entendimento do consentimento livre e informado. Resultados: Foi detetada Neisseria gonorrhoeae em 8 doentes – 5,5 % de prevalência global. A prevalência entre indivíduos com infeção sexualmente transmissível prévia (n = 35) foi significativamente mais elevada (p = 0,032). Neste grupo detetou-se N. gonorrhoeae em 4 doentes (11,43 %). Em doentes com queixas de exsudado uretral (n = 29), foi detetada N. gonorrhoeae em seis (20,69 %), demonstrando que a prevalência entre os indivíduos com este sintoma é, também, significativamente mais elevada (p = 0,001). A coinfecção com Clamydia trachomatis foi observada em 1,4 % dos casos (2/145). A percentagem de casos assintomáticos foi de 12,5 % (1/8). As técnicas de PCR utilizadas neste estudo demonstraram-se igualmente especificas para a deteção de N. gonorrhoeae e ambas mais sensíveis relativamente à cultura. Neste estudo as estirpes isoladas em cultura apresentaram resistência a penicilina em 25 % dos casos, 37,5 % a tetraciclinas e 12,5 % eram produtoras de β-lactamases. Conclusões: A prevalência determinada neste estudo encontra-se superior ao esperado. Os resultados deste estudo indicam a existência de um importante problema de saúde pública e a necessidade de considerar a implementação de rastreios em grupos específicos de população. Este estudo confirma que as técnicas de PCR com os alvos porA e ccpB são satisfatórias para a deteção de Neisseria gonorrhoeae em amostras de urina. Apesar da percentagem de estirpes resistentes a tetraciclinas e penicilina ser elevada não foram demonstradas resistências a fluoroquinolonas ou cefalosporinas nas estirpes estudadas.

Fatores que influenciam a adesão à terapêutica antirretroviral : a perceção dos enfermeiros de um serviço de infeciologia

RESUMO - A investigação no âmbito da infeção por VIH/SIDA tem tido avanços notáveis, nomeadamente no que se refere à evolução da terapêutica antirretroviral, sendo atualmente o único meio de controlar a doença. Nesta área, a compreensão da problemática da adesão torna-se importante para as instituições e para os profissionais de saúde, quer pelas taxas de morbilidade e mortalidade associadas à doença, quer pelos problemas de saúde pública e pelos gastos financeiros das organizações de saúde. A adesão ao regime terapêutico é um conceito que engloba tanto o cumprimento da prescrição medicamentosa, como dos comportamentos promotores de saúde. O presente estudo teve como objetivo identificar como os enfermeiros, a desempenhar funções num serviço de infeciologia, percecionam a adesão à terapêutica antirretroviral, por indivíduos portadores de VIH/SIDA. Participaram neste estudo nove enfermeiras a desempenhar funções no serviço de Medicina 1/Infeciologia/HDI do Hospital Fernando Fonseca, EPE, que reuniam os critérios definidos. Como metodologia para a identificação da perceção dos enfermeiros realizou-se um estudo qualitativo e utilizou-se uma entrevista semi-estruturada. Da análise das entrevistas, resultaram diferentes áreas temáticas. Os resultados obtidos evidenciam a importância atribuída à adesão à terapêutica antirretroviral e demostram que o acompanhamento dos doentes pelos profissionais e instituições de saúde permite o desenvolvimento de estratégias promotoras de adesão. Verifica-se que é ainda necessário percorrer um longo caminho, de forma a se obterem resultados ótimos de adesão. Contudo, os resultados obtidos no presente estudo são um incentivo para o desenvolvimento de estratégias de adesão e para a melhoria da gestão da qualidade.

Estimativa dos custos das infeções nosocomiais da corrente sanguínea relacionadas com o cateter venoso central no Centro Hospitalar de Lisboa Ocidental

RESUMO - Introdução: As Infeções nosocomiais da corrente sanguínea associada a cateter venoso central (INCS-CVC) provocam um aumento das despesas hospitalares, traduzindo num aumento dos dias de internamento, consumo de antibióticos e de meios complementares de diagnóstico e terapêutica (MCDT). O presente estudo pretende avaliar os custos das INCS-CVC nos serviços de internamento do CHLO, no ano de 2012. Metodologia: Realizou-se um estudo retrospetivo de caso-controlo para determinar os custos adicionais inerentes às INCS-CVC. Foram identificados, em 2012, 32 doentes com infeção e 31 sem infeção. Os controlos foram extraídos da população tendo igual grupo diagnóstico Homogéneo (GDH), idade, sexo, serviço e duração de internamento e presença de CVC. As principais fontes de informação foram os registos da Comissão Controlo de Infeção (CCI) e do processo clinico eletrónico (PCE). A estimativa dos custos teve em consideração a duração de internamento, consumo de antibióticos e de MCDT. Resultados: A idade média dos casos e controlos foi de 66 e 69, respetivamente (p=0,432), 50% dos casos e 51,6% dos controlos eram do sexo masculino. Um total de 22 casos foi comparado com 22 controlos. A duração média de internamento dos casos e controlos foi de 70,8 e 36,6 dias, respetivamente (p=0,000). Em média o custo adicional por doente com antibióticos foi de 256€ (p=0,001). Nos casos o consumo de análises clinica foi 2,5 vezes superior e de exames imagiológicos 2 vezes superior aos controlos. O custo total médio adicional por doente foi de 20.737,6€. Conclusão: A ocorrência de INCS-CVC resultou num aumento significativo de utilização de recursos hospitalares e consequentemente num aumento dos custos hospitalares.

Programa TARV : análise do triénio 2007-2009

RESUMO - Enquadramento: O ambiente hospitalar é a principal porta de introdução de novos fármacos no hábito de prescrição e os números atuais apontam para gastos na ordem dos mil milhões de euros, justificados pelo maior consumo de medicamentos de cedência gratuita e obrigatória em farmácia hospitalar, nos quais se destaca a terapêutica anti-retrovírica para a infeção VIH/SIDA. O acesso universal à terapêutica disponível permitiu reduzir significativamente a morbilidade e mortalidade associadas à infeção VIH/SIDA conduzindo a sociedade a encará-la como uma doença crónica. Em Portugal, esta problemática tem vindo a ser uma preocupação constante e crescente no domínio das políticas públicas e em 2007, foi introduzido um modelo experimental de financiamento aos prestadores de cuidados de saúde a doentes naive com infeção VIH/SIDA (Programa TARV) que se destina ao pagamento de cuidados prestados em regime de ambulatório. A conceção deste programa de contratualização foi idealizada no âmbito da gestão integrada da doença e, para 2012, prevê-se o seu alargamento a todas as unidades hospitalares e a todos os doentes com infeção VIH/SIDA em tratamento. Objetivos: Descrição e análise do Programa TARV (2007-2009) com a determinação dos principais esquemas terapêuticos utilizados; apuramento do custo médio anual da despesa em medicamentos anti-retrovíricos, por doente; análise evolutiva dos indicadores de adesão e efetividade; e avaliação do processo de contratualização das Instituições em Programa. Metodologia: Foi disponibilizada pela ACSS a base de dados do Programa TARV com a informação recolhida à data de Abril de 2012. O período temporal em análise corresponde aos anos do Programa TARV com faturação emitida à data de Março de 2012: A base de dados encontra-se dividida em três ficheiros cuja informação foi submetida a tratamento estatístico recorrendo à aplicação SPSS (v.14) e Microsoft Excel (v.2007). Resultados e Conclusões: O Programa TARV tem tido um bom desempenho no que se refere à promoção no acesso dos doentes com infeção VIH/SIDA à terapêutica anti-retrovírica. Os principais esquemas terapêuticos para o tratamento de doentes naive vão ao encontro das guidelines terapêuticas e a estimativa realizada apurou custos médios anuais de acompanhamento dos doentes inferiores ao preço compreensivo aplicado no Programa TARV. Os resultados revelam a existência de diferenças significativas entre a produção realizada e a produção contratualizada, assumindo um valor correspondente a 31% do montante global disponibilizado para financiamento do Programa TARV. Por último, face às limitações encontradas, refere-se que modelo de SI utilizado na recolha, processamento e monitorização da informação sobre os doentes em Programa TARV não é o mais adequado para tratar o volume de informação gerado.

Identificação das fontes de contaminação fecal nas águas superficiais do Rio Tejo

As águas são potenciais vias de infeção, pois servem como veículos para disseminação de possíveis microrganismos patogénicos que podem levar a surtos. Por isso é importante manter os ambientes aquáticos livres de microrganismos. Para isso é necessário a constante monitorização desses ambientes. Isto é realizado através da utilização de microrganismos indicadores (FIB), que sugerem o nível de poluição fecal da água. Porém, tem sido demonstrado que os FIB possuem graves falhas na identificação de certos tipos de microrganismos, como por exemplo, os vírus, assim como na identificação da fonte de contaminação fecal. A partir disso surgiu o Microbial Source Tracking (MST), que tem como objetivo principal a identificação específica do hospedeiro ou ambiente causador da contaminação fecal. Neste estudo foram utilizadas uma combinação de diferentes métodos, sendo a maioria destas técnicas moleculares, para fornecer uma nova abordagem prática, viável e integrável a partir da utilização das amostras ambientais retiradas do Rio Tejo. Para isso foram efetuadas colheitas totalizando 73 amostras em quatro pontos diferentes no rio Tejo: VFX, MPN, ALC e Belém. Nestes pontos foram analisados quantitativamente os marcadores bacteriológicos E. coli e EF; os considerados potenciais indicadores de vírus, CS e Bacteriófagos de GB-124 e marcadores moleculares HAdV, mtDNA humano, bovino, suíno e de aves de consumo humano. Foram encontradas positividades para todos os pontos, com 99% para E. coli, 97% para EF, 99% para CS, 1% para Bacteriófagos de GB-124, 40% para HAdV, 90% para mtDNA humano, 92% mtDNA bovino, 58% mtDNA suíno, 37% mtDNA de aves de consumo humano. Estes marcadores foram também correlacionados, e devido à fraca correlação encontrada, os resultados indicam que as informações fornecidas pelos indicadores bacteriológicos e CS são diferentes das informações obtidas pelos indicadores moleculares.

Princípios de terapêutica antibiótica na doença crítica

RESUMO: A infeção é frequente durante a doença crítica, quer como causa da doença crítica quer como complicação da sua evolução. Paradoxalmente, os avanços da medicina moderna aumentaram eles próprios o risco de infeção, ao permitir a sobrevida até idades avançadas, ao criar um novo grupo de doentes imunodeprimidos, nomeadamente doentes tratados com fármacos que interferem com as suas defesas naturais (corticóides, citostáticos), ao aumentar o tempo de vida de hospedeiros com comorbilidades debilitantes. Os antibióticos são um dos elos essenciais no tratamento da infeção. Contudo o seu uso também promove a seleção e crescimento de bactérias resistentes. Para além disso as doses convencionais de antibióticos foram selecionadas numa altura em que a resistência era um fenómeno raro e podem não ser atualmente as mais adequadas. Existe hoje muita evidência acumulada que os doentes críticos sofrem alterações da sua farmacocinética (PK) que podem facilitar a ocorrência de falência terapêutica ou de toxicidade tanto por sub como por sobredosagem de antibióticos. Essas alterações são complexas e difíceis de estudar. Finalmente, também a farmacodinâmica (PD) dos antibióticos pode estar alterada nesta população, podendo haver necessidade de ajustar os alvos terapêuticos de forma individual. O objetivo deste trabalho foi investigar a relação entre a terapêutica antibiótica, as suas características PK e PD, a carga bacteriana e o prognóstico dos doentes críticos. O plano de investigação incluiu: 1. Dados da epidemiologia portuguesa de doentes críticos com infeção; 2. Avaliação da relação entre a carga bacteriana, o tempo até ao início do tratamento antibiótico e o prognóstico dos doentes críticos; 3. Avaliação da evolução da PK durante o tratamento da infeção; 4. Um estudo multicêntrico para avaliação da eficácia da terapêutica com um β- lactâmico doseado de acordo com a relação PK/PD. Na introdução é descrita a importância dos antibióticos, a sua origem e o problema crescente das resistências bacterianas relacionadas com o seu emprego e abuso. É salientada a importância de racionalizar a posologia, de acordo com os conceitos de PK e de PD. No Capítulo 1 são apresentados dados de epidemiologia portuguesa de infeção em doentes críticos, sobretudo retirados de dois estudos prospetivos, observacionais, os quais incluíram mais de 50% da capacidade de internamento em cuidados intensivos existente em Portugal. No Capítulo 2 são descritos os conceitos de PK e as suas alterações nos doentes críticos. De seguida são revistos os conceitos de PD de antibióticos e a sua aplicação a esta população, em particular durante as infeções graves (Capítulo 3). Nos capítulos seguintes são aprofundadas estas alterações da PK nos doentes críticos e as suas causas, de forma a destacar a importância da monitorização da concentração dos antibióticos. São apresentados os dados duma revisão sistemática de PK de antibóticos nesta população (Capítulo 4), pormenorizadas as alterações da PD que comprometem a eficácia da terapêutica antibiótica, facilitam o desenvolvimento de resistências e podem levar a falência terapêutica (Capítulo 5). Consequentemente a compreensão global destas alterações, da sua relevância clínica e a revisão da evidência disponível facilitou o desenvolvimento do próprio plano global de investigação (Capítulos 6 e 7). No Capítulo 6.1 são descritos os antibióticos tempo-dependente e a importância de aumentar o seu tempo de perfusão. Foi desenhado um estudo multicêntrico para comparar a eficácia e segurança da perfusão contínua da piperacilina tazobactam (um antibiótico β-lactâmico associado a um inibidor de β-lactamases) com a mesma dose do antibiótico, administrado em dose convencional, intermitente. A importância de dosear corretamente os antibióticos concentração-dependente foi também avaliada num estudo a primeira dose dos aminoglicosídeos (Capítulo 6.2). Outras estratégias para melhorar os resultados assistenciais dos doentes infetados são abordadas no Capítulo 7, em particular a importância da terapêutica antibiótica precoce, a avaliação da carga bacteriana e a compreensão da variação da PK ao longo do tratamento da infeção. Foi desenvolvido um algoritmo de abordagem terapêutica que incluiu estas alterações da PK e da PD nos doentes críticos. Finalmente no Capítulo 8 são descritos mecanismos de desenvolvimento das resistências bacterianas bem como estratégias para a sua abordagem. O Capítulo final (Capítulo 9) aponta um plano para futuras áreas de trabalho. O elemento chave identificado neste trabalho de investigação é o reconhecimento da variabilidade significativa da PK dos antibióticos durante a doença crítica, a qual condiciona a sua posologia. Estas alterações estão relacionadas com a própria gravidade da doença e tendem a diminuir ao longo do seu tratamento. No entanto nem a gravidade da doença nem as características individuais as permitem prever de forma aceitável pelo que a utilização duma posologia universal, independente da situação clínica concreta, pode ser inadequada. As estratégias para melhorar os resultados assistenciais dos doentes críticos infetados devem ser baseadas na individualização da posologia antibiótica de acordo com os princípios da PK e da PD, preferencialmente apoiadas em doseamentos da sua concentração. ------------------------------------ ABSTRACT: Infection commonly occurred during critical illness, either as a cause or complicating the course of the disease. Advances in medicine had paradoxically increase the risk of infection, both by improving survival to older ages and by introducing a new group of immunosuppressed patients, those who are treated with drugs that interfere with their natural defenses (corticosteroids, cytostatics) and those who survived longer with aggressive diseases. Antibiotics are of paramount importance for treating infection. However the use of these drugs also promote the selection and growth of resistant bacteria. Furthermore conventional antibiotic doses were calculated for less severe patients during a time when resistance was rare. Nowadays there is increasing evidence that critically ill patients experiment altered pharmacokinetics (PK) that may lead to therapeutic failure and/or drug toxicity. Equally, such PK alterations are complex and challenging to investigate. Finally pharmacodynamics (PD) may also be different in this population and antibiotic targets may need to be tailored to the individual patient. The aim of this research was to investigate the relationship between antibiotic therapy, its PK and PD, bacterial burden and critically ill patients outcomes. The research plan comprised of: 1. Epidemiological portuguese data of critically ill infected patients; 2. Relationship between burden of bacteria, time until the start of antibiotics and patient outcomes; 3. Evaluation of PK during treatment of infection; 4. A multicentre study evaluating PK guided β-lactam therapy. The introductory chapter outlines the importance of antibiotics, its origins, the problem of increasing bacteria resistance, related to its use and overuse and the importance of rational drug dosing using PK and PD concepts. In Chapter 1 portuguese epidemiological data of infections in critically ill patients is presented, mostly coming from two prospective observational studies, encompassing more than 50% of critically ill beds available in Portugal. Chapter 2 describes the concepts of PK and the changes occurring in critically ill patients. This is followed by a review of the concepts of PD of antibiotics and its application to this population, especially during severe infections (Chapter 3). In the following chapter these changes in antibiotics PK in critical illness are and its causes are detailed, to outline the importance of therapeutic drug monitoring. Data on a systematic review of antibiotics PK in those patients is provided (Chapter 4). The following chapter (Chapter 5) elucidates important changes in PD, that compromises antibiotic therapy, facilitate the occurrence of resistance and may lead to therapeutic failure. Thus, an understanding of the clinical problem and available evidence facilitated the development of a comprehensive research plan (Chapter 6 and Chapter 7). Chapter 6.1 describes time-dependent antibiotics and the importance of extending its perfusion time. A multicenter study was designed to compare the continuous infusion of piperacillin tazobactam (a β-lactam antibiotic) with the same daily dose, prescribed in a conventional, intermittent dose. The importance of correct dosing of antibiotics was also assessed through a study addressing aminoglycoside (a concentration-dependent antibiotic) therapy (Chapter 6.2), focusing on its first dose. Strategies to improve severe infected patients outcomes were addressed in Chapter 7, namely the importance of early antibiotic therapy, assessing the burden of bacteria and understanding changes in antibiotic concentration during the course of infection. An algorithm to include all the described changes in both PK and PD of critically ill patients was developed. Finally in Chapter 8 mechanisms of the increasing resistance of bacteria are described and strategies to address that problem are proposed. The closing chapter (Chapter 9) lays a roadmap for future work. The key finding of this research is the significant variability of the antibiotics PK during critical illness, which makes dosing a challenging issue. These changes are related to the severity of the infection itself and improve through the course of the disease. However neither disease severity nor individual characteristics are useful to predict PK changes. Therefore, the use of a universal dose approach, regardless of the individual patient, may not be the best approach. Strategies to improve patients’ outcomes should be based on tailoring antibiotics to the individual patient, according to PK and PD principles, preferentially supported by therapeutic drug monitoring.

Comportamento biológico "in vitro" de "novas espécies" de Leishmania no Velho Mundo

As leishmanioses são um grupo de doenças causadas pelo parasita protozoário Leishmania sp. Na Bacia mediterrânica, Leishmania infantum, é a principal espécie causadora de leishmaniose visceral, a forma mais severa da doença, sendo L. major um dos agentes etiológicos da leishmaniose cutânea. Apesar de se considerar que estes parasitas têm uma reprodução essencialmente clonal, nos últimos 20 anos tem vindo a ser descrita a recombinação genética entre diferentes estirpes e espécies, com ocorrência de híbridos naturais, quer no Velho quer no Novo Mundo. Recentemente, em Portugal, foram isoladas e identificadas pela primeira vez, estirpes híbridas de L. infantum/L. major. O presente estudo teve como principais objetivos, a pesquisa de “novas espécies” de Leishmania e a análise do comportamento “in vitro” de estirpes parentais e híbridas de L. infantum e L. major. Numa primeira parte do trabalho efetuou-se a cultura e pesquisa de DNA de Leishmania sp., em amostras de sangue medular de 229 cães provenientes de uma região endémica de Portugal, utilizando diferentes marcadores moleculares (kDNA, ITS1 e SSU rRNA) e protocolos de PCR. Não foi encontrado DNA de espécies híbridas, tendo-se no entanto, identificado DNA de Leishmania sp. em 45,85% (105/229) das amostras, incluindo cães sem sinais clínicos. Na segunda parte do trabalho, realizaram-se diversos ensaios “in vitro” com estirpes híbridas naturais L. infantum/L. major e parentais L. infantum e L. major. Em condições normais de crescimento, observou-se um padrão de crescimento distinto para cada estirpe estudada. Em condições de “stress” oxidativo, destacou-se uma diferença significativa entre as duas estirpes híbridas estudadas. Em condições de “stress” nutricional, as estirpes não apresentaram diferenças entre si. Após avaliação da suscetibilidade das estirpes na presença de Anfotericina B, todas se mostraram suscetíveis, com concentrações inibitórias (CI50) entre 0.21 e 1.15 μg/mL. Após infeção em linhas celulares monocíticas, não se verificaram diferenças estatisticamente significativas na taxa e intensidade de infeção das estirpes híbridas em comparação às putativas parentais. Os resultados obtidos, contribuíram para um melhor conhecimento sobre o comportamento biológico destas estirpes híbridas naturais L. infantum/L. major. Estas demonstraram um comportamento “in vitro” intermédio, relativamente às estirpes parentais. Estes resultados poderão servir de base para o desenvolvimento de outros estudos com estas “novas espécies”, nomeadamente estudos de patogenicidade “in vivo” e o papel de biomarcadores de virulência, que permitam um potencial prognóstico da infeção e avaliação do seu risco epidemiológico.

Leptospirose e Fasciolose: Interacções imunológicas no polimorfismo do quadro clínico dos doentes de São Miguel (Açores)

O arquipélago dos Açores apresenta nove ilhas vulcânicas, sendo São Miguel a maior e mais populosa. Nesta região insular portuguesa, a Leptospirose é uma zoonose endémica, que afeta acidentalmente o Homem por contacto direto ou indireto com leptospiras patogénicas. Clinicamente, esta patologia apresenta diversos sintomas que podem ser semelhantes a uma gripe ou evoluir até um quadro fulminante, daí a necessidade de um diagnóstico preciso com confirmação laboratorial. A Fasciolose é outra importante doença zoonótica nos Açores que tem sido descrita como endémica neste arquipélago, causada pelo parasita Fasciola hepatica. A infeção humana pode ocorrer devido ao consumo de vegetais e/ou águas contaminados. O diagnóstico não é fácil, pois a infeção pelo parasita pode apresentar uma larga variedade de quadros clínicos. O objetivo deste estudo é contribuir para a clarificação de uma possível interação imunológica, ao nível da resposta humoral observada em indivíduos com diagnóstico clínico de Leptospirose e/ou Fasciolose, em pacientes da ilha de São Miguel que apresentam um quadro clínico e epidemiológico comum a ambas as patologias, contribuindo para um melhor diagnóstico diferencial. A amostra utilizada no estudo é composta por 280 soros de indivíduos residentes na ilha de São Miguel, que foram analisados entre 2005 e 2010 pela TAM (Técnica de Aglutinação Microscópica), para deteção de aglutininas anti-Leptospira interrogans s.l.. Nas amostras de soro com resultado positivo e inconclusivo pela TAM foi aplicada a técnica de rastreio micro-ELISA para o estudo da Fasciolose. Aplicou-se ainda a técnica de Imunoeletrodifusão (IED), como técnica confirmatória, nos soros com resultado positivo e em alguns inconclusivos (n=118) para a técnica micro-ELISA. Os resultados da TAM, previamente conhecidos, para o total de indivíduos estudados foram os seguintes: 124 (44,3%) negativos, 73 (26,1%) inconclusivos e 83 (29,6%) positivos. Estes soros foram submetidos ao teste micro-ELISA, tendo-se obtido 31,1% (n=87) resultados positivos, 31,4% (n=88) resultados inconclusivos e 37,5% (n=105) com resultado negativo para Fasciolose. Foram analisados os inquéritos clínico-epidemiológicos estabelecido para o estudo da Leptospirose humana em São Miguel para as amostras anteriormente referidas, verificando-se que os homens lavradores em idade ativa são o grupo com mais casos positivos para ambas as patologias. Além disso, os sinais e sintomas mais comuns nos doentes com resultado positivo para as duas doenças são semelhantes aos de uma gripe, e analiticamente foi notório que as transaminases, a FA/γGT (apenas nos doentes com Leptospirose) e a leucocitose tinham níveis elevados. Os resultados revelaram uma provável coinfeção em 36 doentes. A técnica de IED foi positiva em 28 amostras de soro, sendo que cinco tiveram resultado positivo para as três técnicas utilizadas. Estes resultados são promissores, demonstrando uma possível relação entre Leptospirose e Fasciolose, sendo que os respetivos agentes etiológicos partilham nichos ecológicos, o que justifica igualmente algumas semelhanças nos aspetos sociodemográficos e clínico-epidemiológicos na população afetada.

Impacto da crise no volume e perfil de internamento de doentes com VIH-SIDA em Portugal Continental : análise temporal 2001-2012

RESUMO - Contexto: O início da crise económica em Portugal no ano de 2009 colocou o país numa grave recessão económica aliada a diversas medidas de austeridade. Como consequência assistiu-se, ao nível nacional, uma diminuição do PIB, aumento do desemprego e assim como uma série de restrições orçamentais em várias áreas, nomeadamente a da saúde. Apesar de existir inúmeros estudos que avaliaram o impacto das recessões económicas na saúde os resultados são controversos e não existe um consenso quanto a esta associação. No que se refere às doenças infeciosas o número de estudos é bastante mais reduzido. O objetivo deste estudo foi o de analisar o impacto da crise atual no volume e perfil de internamento de doentes com VIH/SIDA, de forma a complementar a escassa evidência existente neste domínio. Metodologia: Foram analisados 53,296 episódios de internamento nos hospitais do SNS entre o ano de 2001 e 2012, cujo diagnóstico principal é a infeção pelo VIH/SIDA. Considerou-se o ano de 2009 como o ano inicial da crise. Através de regressões multivariadas avaliou-se o impacto da crise no volume de doentes internados, duração de internamento, número de co-morbilidades, risco de ser admitido via urgência e risco de mortalidade no internamento. Adicionalmente repetiu-se a análise por região NUTS II de Portugal Continental (Norte, Alentejo, LVT, Centro e Algarve). Resultados: A crise não teve impacto no volume de doentes internados. No entanto, após o ano de 2009, registou-se uma diminuição de 5.6% na duração de internamento; um aumento de 1.6% no número de co-morbilidades; um aumento de 11.1% no risco de ser admitido via urgência e um aumento de 8.6% do risco de mortalidade no internamento. As análises por região permitiram verificar que as regiões mais afetadas pela crise foram a região LVT e a região Norte. Conclusão: A crise em Portugal não teve impacto na incidência de internamentos por VIH/SIDA. Porém o aumento do número de co-morbilidades, do risco de ser admitido via urgência e do risco de mortalidade no internamento parece refletir um agravamento da severidade dos casos após o ano de 2009. Adicionalmente a diminuição da duração de internamento com o efeito da crise poderá refletir tanto aumento da eficiência dos cuidados prestados ou ao contrário, uma diminuição da sua qualidade.