Extração e estudo das proteínas da goma da alfarroba com vista à sua clarificação

O objectivo primordial deste trabalho foi efectuar a extracao e o estudo das proteinas da Goma da Alfarroba ou Locust Bean Gum (LBG) com vista a sua clarificacao e purificacao. Para atingir este objectivo em primeiro lugar estudou-se o teor de etanol que se deveria utilizar numa suspensao aquosa de LBG, uma vez que a LBG e um polissacarido que hidrata facilmente com agua e consequentemente origina solucoes altamente viscosas que impossibilitam a realizacao de tecnicas de extracao de proteinas. Para isso estudou-se o comportamento da LBG em suspensoes aquosas com 10% (p/v) de LBG e diferentes concentracoes de etanol, designadamente 10% (v/v), 20% (v/v), 30% (v/v) e 40% (v/v). Com este estudo concluiu-se que seria necessario utilizar uma concentracao de 40% (v/v) de etanol a 96% em cada suspensao de LBG a 10% (p/v) para conseguir evitar a sua hidratacao excessiva. Assim, todas as extracoes neste trabalho foram realizadas de acordo com estas condicoes. Posteriormente com vista a extracao das proteinas da LBG testaram-se diferentes tratamentos, designadamente tratamentos alcalinos, acidos e com detergentes. Segundo a bibliografia consultada para os tratamentos alcalinos, realizaram-se estas extracoes com hidroxido de sodio (NaOH) com concentracoes de 0,025 M, 0,05M, 0,1M e 0,2M. Estes tratamentos foram iniciados com uma concentracao de NaOH a 0,2M, contudo apos analise dos resultados verificou-se que esta originou uma LBG com uma coloracao mais amarela do que a LBG bruta (inicial) apresentava. Sendo a ideia final a clarificacao da goma este nao foi um resultado desejavel e como tal testaram-se concentracoes inferiores de NaOH, acima referidas. No final concluiu-se que todas estas extracoes efetuadas com NaOH originavam uma LBG mais amarela do que a LBG bruta e que assim este nao seria o tratamento mais adequado para o objectivo pretendido. Como tal prosseguiram-se os estudos com um tratamento acido, que atraves de consulta bibliografica se iniciou com acido sulfurico (H2SO4). O tratamento acido iniciou-se com uma concentracao de H2SO4 de 0,1M, testando-se posteriormente tambem uma extracao com H2SO4 com concentracao de 0,05M. No final destas extracoes verificou-se que a LBG obtida em ambas apresentava uma coloracao mais clara do que a LBG bruta, o que representava, numa primeira analise, um bom resultado. Por fim efectuaram-se extracoes solido-liquido com diferentes detergentes, designadamente com Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 65, Tween 80, Tween 85, Triton X-100, Triton X-114 e SDS todos a uma concentracao de 0,1% (v/v) a excepcao do Tween 65 em que foi utilizada uma concentracao de 0,1% (p/v), porque a temperatura ambiente este detergente e solido. No final destas extracoes concluiu-se que na maioria dos casos a LBG apresentava uma coloracao mais clara do que a LBG bruta. Para quantificar as proteinas extraidas atraves de cada um dos tratamentos acima mencionados utilizaram-se dois metodos, o metodo de Bradford para quantificar as proteinas presentes nos sobrenadantes das extracoes e o metodo de Kjeldahl para quantificar as proteinas ainda presentes na LBG apos as extracoes. Analisando os resultados obtidos por estes metodos concluiu-se que a extracao efetuada com Tween 80, em que se efectuou uma lavagem adicional a LBG durante a filtracao com uma solucao de agua destilada e etanol a 40% (v/v), foi a que apresentou melhores resultados. Assim, foi com esta amostra proteica que se prosseguiram os estudos as proteinas. Para realizar os estudos as proteinas extraidas efectuou-se uma eletroforese em SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) com o intuito de verificar o estado da amostra. Analisando os geles obtidos constatou-se que a amostra se encontrava em boas condicoes. Deste modo realizou-se uma eletroforese bidimensional (2 – D) das proteinas extraidas da LBG. Nesta tecnica, como se desconheciam que tipo de proteinas se encontravam presentes na amostra utilizou-se uma banda de pH para a Focagem Isoelectrica (1a Dimensao) entre 3 e 10 e a separacao por Peso Molecular (2a Dimensao) foi efetuada em SDS-PAGE. Analisando os geles obtidos concluiu-se que a maioria das proteinas presentes nesta amostra apresentam pontos isoelectricos na gama de pH entre 5 e 6 e tem pesos moleculares entre 40 e 60 kDa. Pode-se entao concluir que o objectivo deste trabalho foi apenas parcialmente atingido uma vez que se conseguiu extrair e estudar algumas das caracteristicas das proteinas presentes na LBG, mas nao se alcancou a sua clarificacao.

Automatic processing of bidimensional images of ''omic'' expression blobs

In this work, a comprehensive review on automatic analysis of Proteomics and Genomics images is presented. Special emphasis is given to a particularly complex image produced by a technique called Two-Dimensional Gel Electrophoresis (2-DE), with thousands of spots (or blobs). Automatic methods for the detection, segmentation and matching of blob like features are discussed and proposed. In particular, a very robust procedure was achieved for processing 2-DE images, consisting mainly of two steps: a) A very trustworthy new approach for the automatic detection and segmentation of spots, based on the Watershed Transform, without any foreknowledge of spot shape or size, and without user intervention; b) A new method for spot matching, based on image registration, that performs well for either global or local distortions. The results of the proposed methods are compared to state-of-the-art academic and commercial products.

Identificação de indicadores moleculares de bem-estar durante o cultivo de dourada (Sparus aurata, Linnaeus 1758), utilizando técnicas de proteómica

Dissertação de Mestrado, Biologia Marinha, Especialização em Biotecnologia Marinha, Faculdade de Ciências do Mar e do Ambiente, Universidade do Algarve, 2008

Comportamentos do líder inovador no sector do turismo

Tese de dout., Psicologia das Organizações, Faculdade de Ciências Humanas e Sociais, Univ. do Algarve, 2008

Estudo do efeito de contaminantes na espécie sentinela, a amêijoa Ruditapes decussatus, por intermédio da análise da expressão proteica: aplicação à monitorização do meio marinho

Tese dout., Ciências e Tecnologias do Ambiente, 2009, Universidade do Algarve

A proteomic study of the effects of nutrient restriction in utero on postnatal metabolism

It is widely recognized that protein restriction in utero may cause metabolic and endocrine adaptations, which may be of benefit to the neonate on a short-term basis but may cause adverse long-term conditions such as obesity, Type 2 diabetes, metabolic syndrome, hypertension and cardiovascular diseases. Adequate foetal and early post natal nutrient and energy supply is therefore essential for adult animal health, performance and life span. In this project it was investigated the progressive adaptations of the hepatic proteome in male mink offspring exposed to either a low protein (FL) or an adequate protein (FA) diet in utero fed either on a low protein (LP) or on an adequate (AP) diet from weaning until sexual maturity. Specifically, the aim was to determine the metabolic adaptations at selected phases of the animal’s first annual cycle and establish the metabolic priorities occurring during those phases. The three different morphological stages studied during the first year of development included, end of bone growth at 4 months of age, maximal fat accretion at 6 months of age and sexual maturity at 12 months of age. A reference proteome of mink liver coming from these different animal groups were generated using 2D electrophoresis coupled to MALDI-TOF analysis and the way in which dietary treatment affect their proteome was established. Approximately 330 proteins were detected in the mink liver proteome. A total of 27 comparisons were carried out between all different animal groups which resulted in 20 differentially expressed proteins. An extensive survey was conducted towards the characterization of these proteins including their subcellular localization, the biological processes in which they are involved and their molecular functions. This characterization allowed the identification of proteins in various processes including the glycolysis and fatty acid metabolism. The detailed analysis of the different dietary treatment animal groups was indicative of differences in metabolism and also to changes associated with development in mink.

Deteção automática de eventos em sinais Doppler de fluxo sanguíneo

Os sinais de fluxo sanguíneo são sinais aleatórios que, além de variarem de individuo para individuo, variam também consoante o ciclo cardíaco em análise. Sendo o diagnóstico de patologias cardiovasculares fortemente baseado em sinais de ultrassom Doppler representados em forma de espectrograma, e tendo em consideração que o ruído do tipo speckle é parte integrante dos sinais ultrassónicos, torna-se vital a pesquisa de métodos de eliminação desse tipo de ruído e de caracterização precisa dos parâmetros desses sinais biomédicos por forma a melhorar a qualidade do diagnóstico clínico. Com esta tese pretende-se desenvolver uma ferramenta computacional que possibilite a extração automática dos parâmetros pico sistólico, fim de diástole e de outros eventos clinicamente relevantes de sinais Doppler de fluxo sanguíneo, com especial atenção ao sinal proveniente da artéria carótida. Esta investigação vem na continuidade de um projeto realizado anteriormente no Grupo de Processamento de Sinal Biomédico da Universidade do Algarve, no qual foi desenvolvido um sistema de redução de ruído de espectrogramas Doppler. Este sistema de remoção de ruído será aqui aplicado e melhorado. Para a deteção e extração automática de parâmetros clínicos, foi desenvolvido um algoritmo que recebe um sinal de Doppler e que tem como saída o espectrograma livre de ruído e os valores dos parâmetros clínicos calculados. O algoritmo desenvolvido está dividido em três partes principais. A primeira, consiste na transformada do sinal para os domínios tempo-frequência para a criação do espectrograma e na aplicação de uma metodologia de remoção do ruído do tipo speckle do espectrograma. A fase seguinte é a criação de um sinal bidimensional a partir do espectrograma, o qual é criado para possibilitar a sua caraterização. Por último, desenvolveu-se uma fase dedicada à caracterização do sinal, tendo como principais funções a deteção dos eventos clínicos de pico sistólico, fim de diástole, índice de pulsação, índice de resistência e ratio sístole-diástole. A refinação de atuação de cada uma das três partes mencionadas pode ser ajustada pelo utilizador, tendo para o efeito sido desenvolvido uma interface gráfica na qual a interação do utilizador com o programa global é facilitada. Versatilidade e eficácia do algoritmo desenvolvido foram demonstradas pelos resultados obtidos com três sinais de Doppler de diferentes origens: um de origem clínica, um sinal de fluxo em artéria carótida simulado experimentalmente recorrendo a phantoms, e um sinal de fluxo simulado computacionalmente. Para cada um destes sinais são apresentados os valores das variáveis considerados preferenciais para o ajuste ao respetivo sinal e os respetivos espetros de ruído reduzido. Os resultados da extração automática dos parâmetros clínicos dos três sinais, comprovou a utilidade clínica do algoritmo desenvolvido.