Autophagy in hypothalamic cells: role of Neuropeptide Y

Dissertação de mest.Ciências Biomédicas. Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Univ. do Algarve, 2011

Efeitos a posteriori dos défices hídricos sobre a actividade fotossintética: mecanismos de fotoprotecção e sistema enzimático antioxidante

Tese de dout., Biologia (Fisiologia Vegetal), Faculdade de Engenharia dos Recursos Naturais, Univ. do Algarve, 2005

Aguardentes de medronho

A aguardente de medronho, muitas vezes designada apenas por medronho, é um destilado que continua a ser produzida, essencialmente de forma artesanal. A sua produção, tudo indica, ter iniciado em Monchique, no século X, pelos Árabes. A qualidade deste destilado passou por fases polémicas, principalmente pela escassez de mão-de-obra. Depois de um período de investigação laboratorial e de trabalho com produtores locais, envolvendo várias Instituições da região, a qualidade da aguardente de medronho foi paulatinamente melhorando. O controlo de qualidade das aguardentes é feito, essencialmente, recorrendo a técnicas cromatografias e espetrofotométricas. Técnicas que permitem diferenciar não só a qualidade, como criar o perfil de cada tipo de aguardente. O Algarve produz também aguardente de figo, alfarroba, mel, vínica, bagaceira e desde 2009 aguardente de batata-doce de Aljezur. Podem ainda encontrar-se pequenas produções de aguardente de alperce ou de ameixa. Presentemente a grande maioria das aguardentes de medronho produzidas no Algarve apresentam os seus parâmetros de qualidade em conformidade com a legislação em vigor (regulamento (CE) nº nº110/2008 de 15 de Janeiro e Decreto-Lei nº 238/2000 de 26 de Setembro). Existindo já um vasto conjunto destas bebidas que mereciam uma diferenciação superior ao estabelecido pela atual legislação, que é ainda bastante permissiva nomeadamente em relação à acidez total, cujo máximo permitido é de 200 g/hl de álcool puro (a.p), (expresso em ácido acético), quando deveria ser de 30 ou em relação ao teor em acetato de etilo, que permite teores de 300 g/hl (a.p), quando não deveria ultrapassar 150. A aposta no envelhecimento ainda é fraca, mas com grande potencial de desenvolvimento. Em Monchique alguns produtores continuam a manter um estágio de 3 meses em pipas, essencialmente, de madeira de castanho. Noutras localidades, muito timidamente, surge um ou outro produtor a experimentar o uso de pipas de carvalho. A grande aposto dos últimos anos na região tem sido na produção de aguardentes preparadas com mel e principalmente nos licores.

Estudo da deterioração da amêijoa-boa Ruditapes decussatus (Linnaeus, 1758)

Dissertação de mest., Tecnologia de Alimentos, Instituto Superior de Engenharia, Univ. do Algarve, 2013

Efeitos da embalagem em ar, sob vácuo e em atmosfera modificada sobre a qualidade de filetes de peixe-porco Balistes capriscus

Dissertação de mest, Tecnologia de Alimentos, Instituto Superior de Engenharia, Univ. do Algarve, 2013

O fruto de Monstera deliciosa: caracterização físico-química e potencial para produção de aguardente

Dissertação de mest., Tecnologia de Alimentos, Instituto Superior de Engenharia, Univ. do Algarve, 2012

Avaliação do potencial da Salicornia ramosissima para saladas frescas ou em pó (sal verde)

Dissertação de mest., Tecnologia dos Alimentos , Instituto Superior de Engenharia, Univ. do Algarve, 2013

Biogeoquímica do manganês, ferro, cobre e cádmio em sedimentos da Ria Formosa

A Ria Formosa é uma laguna costeira de características mesotidais, situada na costa Sul de Portugal, que apresenta pronunciadas variações sazonais de temperatura e radiação luminosa. As extensas zonas intertidais desta laguna são inundadas pela maré duas vezes por dia ficando, por isso, também sujeitas a flutuações semidiurnas de temperatura, pressão e radiação luminosa. Estas condições podem afectar os equilíbrios físico-químicos existentes no sedimento. Foi elaborado um esquema de amostragem de sedimentos em suspensão e de fundo em diversos locais da zona intertidal da Ria Formosa em duas escalas de tempo distintas: (a) uma escala sazonal, com o objectivo de estudar a influência das variações anuais de temperatura e os mecanismos por si desenvolvidos na composição elementar dos sedimentos; (b) ao longo de alguns minutos durante a inundação dos sedimentos pela água da maré, com objectivo de estudar o efeito da maré nos equilíbrios físico-químicos existentes no interior do sedimento. Nos sedimentos recolhidos sazonalmente foi medida a temperatura, o pH e o potencial redox, determinado o conteúdo em matéria orgânica e os teores de Al, Si, Mn, Fe, Cu e Cd na fracção sólida. Na água intersticial foram determinadas as concentrações de Mn(II), Fe, Cu e Cd totais dissolvidos. Nas amostras de água intersticial colhidas durante a inundação dos sedimentos foram determinadas as concentrações de Cl-, Mn(II), Fe(II), Fe(III), Cu e Cd totais dissolvidos. A variação do teor de cloretos na água intersticial indicou que a inundação dos sedimentos intertidais pela maré causa infiltração da água através da superfície do sedimento e movimentos de água intersticial no seu interior. Estes movimentos de fluídos ocorreram preferencialmente nas camadas de maior permeabilidade. As alterações ao equilíbrio dinâmico da água intersticial foram mais intensas nos primeiros 28 minutos de inundação, diminuindo ao longo do tempo. Os processos físicos acima referidos provocaram a exportação de Mn(II), Fe(III), Cu e Cd totais dissolvidos da água intersticial para a coluna de água e simultaneamente induziram a oxidação das espécies reduzidas de manganês e de ferro. O Mn(II) foi oxidado a Mn(IV) na camada superficial dos sedimentos e, também, exportado para a coluna de água. A oxidação do Fe(II) a Fe(III) ocorreu, por sua vez, no interior do sedimento numa curta escala de tempo (<7 min.), saindo para a coluna de água uma pequena porção de Fe(III). Estas alterações, provocadas pela inundação dos sedimentos intertidais, mascararam eventuais variações sazonais das concentrações de Mn e Fe na fracção intersticial dos sedimentos. Os perfis de Cu e Cd totais dissolvidos na água intersticial mostraram a existência de várias zonas de mobilização nos primeiros 4 cm de sedimento. A mobilização de Cu não apresentou uma variação sazonal enquanto que as concentrações de Cd mostraram um incremento no Verão. Neste período, o cálculo de fluxos difusivos indicou uma intensificação dos processos de transferência destes metais através da interface sedimento-água relativamente aos existentes no interior do sedimento. Os fluxos difusivos de Cu foram uma ordem de grandeza inferiores ao transporte advectivo associado à inundação pela maré, enquanto que para o Cd as estimativas dos fluxos difusivos e do transporte advectivo foram comparáveis. Em suma, os resultados obtidos mostraram que a distribuição destes elementos na água intersticial é reflexo do regime de transporte-reacção induzido pela inundação dos sedimentos intertidais, sendo para o Fe mais importantes os processos de reacção, enquanto que para o Mn, Cu e Cd os transportes advectivos são mais rápidos do que as reacções. Com base nestes resultados é proposto um modelo para os ciclos de Mn, Fe, Cu e Cd nas zonas intertidais de lagunas costeiras.

Dietary biodiesel-derived crude glycerol in gilthead seabream juveniles (Sparus aurata): effects on growth performance and metabolism

In the European Union the turn towards renewable energy sources has increased the production of biodiesel from rapeseed oil, leaving glycerol (also known as glycerin) as a valuable by-product. For every litre of biodiesel produced, approximately 79 g of crude glycerol are generated. As the biodiesel production grows, the quantity of crude glycerol generated will be considerable and its utilization will become an urgent topic. One possibility is the use of crude glycerol on animal feeds. Glycerol has been evaluated as a dietary energy source for several farm animals, including fish. A study was undertaken to assess the effect of dietary biodiesel-derived glycerol (from rapeseed oil) on the overall growth performance, digestive capacity and metabolic nutrient utilization in juvenile gilthead seabream fed a low fishmeal level diet. Two practical diets were formulated to be isonitrogenous (crude protein, 45.4% DM), isolipidic (18.5% DM) and isoenergetic (gross energy, 21.3 kJ/g DM). The control diet (CTRL) was formulated with intermediate levels of marine-derived proteins (19%). In the same basal formulation, 5% glycerol (GLY) was incorporated at the expenses of wheat. Each dietary treatment was tested in triplicate tanks over 63 days, with 20 gilthead seabream (Sparus aurata), with a mean initial body weight (IBW) of 27.9  0.12 g. At the end of the trial, fish fed the CTRL diet reached a final body weight of 84.3  2.2 g (more than 3-fold increase of initial body weight). Fish fed the GLY diet showed a significantly higher (P<0.05) growth, expressed in terms of final body weight and specific growth rate. Voluntary feed intake was similar between the two treatments, but both feed efficiency and protein efficiency ratio were significantly improved (P<0.05) in fish fed the GLY diet. Dietary glycerol had no effect (P>0.05) on the apparent digestibility of protein. In comparison to the control treatment, dietary glycerol significantly improved (P<0.05) protein and fat retention. Activities of digestive enzymes were significantly affected by the various dietary treatments. Fish fed the GLY diet showed an enhanced activity of alkaline phosphatase (ALP) and pepsin, while activities of lipase and leucine-alanine peptidase (LAP) were little affected by dietary glycerol. Fish show the ability to use crude glycerol as a dietary energy substrate.

Compostagem e caracterização de resíduos vegetais para utilização como substratos hortícolas

O objectivo deste trabalho foi estudar a utilização de 5 compostos de resíduos de origem vegetal, como componentes de substratos hortícolas. Estudaram-se os processos de compostagem de bagaço de azeitona, bagaço de uva, polpa de alfarroba, casca de eucalipto e casca de pinheiro, caracterizaram-se os compostos obtidos e testou-se a sua aptidão agronómica, como substratos para viveiro de tomate (Lycopersicum esculentum Mill.) em placas alveoladas e cultura de pelargónio (Pelargonium x hortorum) em vaso. Após uma preparação prévia, que em alguns dos resíduos vegetais constou de moenda, suplemento de azoto e aumento do teor de humidade, efectuou-se a sua compostagem em caixas com 1200 L de capacidade, isoladas termicamente, com arejamento por volteio manual. Depois foram analisadas as suas características físicas e químicas e testados na sua aptidão como constituintes únicos de substratos e em misturas com turfa de sphagnum. A maioria dos processos de compostagem apresentou uma evolução habitual da temperatura, com a máxima aproximando-se ou ultrapassando 60 oC. Como excepções, verificou-se um período de compostagem muito longo em bagaço de azeitona; o atraso da fase termofílica em polpa de alfarroba e, na 1ª compostagem de casca de pinheiro, a temperatura não alcançou a zona termofílica. A maioria dos resíduos manifestaram uma acentuada resistência à degradação durante a compostagem, à excepção da polpa de alfarroba e da casca de eucalipto. Contudo, a nível físico-químico e químico registaram-se evoluções acentuadas, sobretudo nas variáveis relacionadas com alterações da superfície das partículas, como por exemplo, a capacidade de troca catiónica. Outras variáveis apresentaram uma evolução interessante para o acompanhamento do processo e o conhecimento do grau de estabilidade do composto final. Foi apreciável o efeito proporcionado pela adição de lamas de estação de tratamento de águas residuais urbanas, como suplemento azotado, a nível das propriedades físicas dos compostos, do aumento da velocidade do processo de compostagem e do enriquecimento dos compostos em macro e micronutrientes. A compostagem não conduziu à melhoria significativa das propriedades físicas dos materiais, excepto em casca de eucalipto. Os compostos caracterizaram-se fundamentalmente por uma reduzida capacidade de retenção de água e uma elevada capacidade de arejamento. Os compostos obtidos com incorporação de lamas apresentaram os valores mais baixos de capacidade de arejamento, mesmo assim dentro dos limites satisfatórios e, os valores mais altos de capacidade de retenção de água. Na cultura em placas alveoladas, o comportamento de muitas das misturas com compostos não se diferenciou do da testemunha, observando-se uma flutuação sazonal do comportamento das misturas nos dois viveiros de cada ano, associada às condições ambientais mais exigentes do ponto de vista da disponibilidade de água. Observou-se um maior número de correlações significativas entre as características dos substratos e as variáveis relativas ao crescimento das plantas nos viveiros efectuados mais tarde, sob condições de maior evapotranspiração. As plantas obtidas no segundo viveiro de tomate foram instaladas em cultura. As características das plantas do viveiro, apresentaram elevada correlação com as respectivas produções obtidas no campo, evidenciando a importância da qualidade das plantas de viveiro, na produção. Nos ensaios de pelargónio em vaso, também se observaram comportamentos idênticos ao da testemunha em muitas das misturas com compostos. Observou-se no 2º ensaio, um maior número de tratamentos com resultados idênticos aos da testemunha, resultante das condições de menor exigência hídrica, as quais fizeram sobressair menos as diferenças de propriedades físicas das misturas. Contudo, a diferença de crescimento obtido em algumas misturas, atribuiu-se também à interferência da continuidade capilar entre o vaso de papel com a estaca enraizada e a mistura em estudo. O trabalho presente mostrou que é possível obter compostos a partir de resíduos orgânicos, com boas características e a preço competitivo para utilização como substratos hortícolas. O processo de compostagem sendo um elemento chave, é fácil de controlar se houver uma regulação eficaz do arejamento e do teor de humidade durante o processo. Apesar de alguns resíduos, como a polpa de alfarroba, serem caros, se tomarmos em consideração o custo da sua eliminação, poderão conduzir a substratos comercialmente viáveis. Em condições ambientais que favoreçam uma maior evapotranspiração ou, em culturas com maior exigência hídrica, pode ser aconselhável a mistura dos compostos estudados com turfa de sphagnum pouco decomposta para melhorar a capacidade de retenção de água.

A satisfação dos utentes idosos nos cuidados continuados no Algarve

A presente investigação tem como objetivo geral conhecer o grau de satisfação dos utentes idosos internados nas Unidades Média Duração e Reabilitação (UMDR) e nas Unidades de Longa Duração e Manutenção (ULDM) do Algarve da Rede Nacional de Cuidados Continuados Integrados (RNCCI). A amostra é constituída por 91 idosos com idades compreendidas entre os 65 e os 91 anos internados em Unidades de Média Duração e Reabilitação e em Unidades de Longa Duração e Manutenção no Algarve. Quanto à metodologia delineada para esta investigação, esta assentou numa investigação de teor quantitativo, transversal e exploratório. Sendo esta investigação um estudo exploratório e transversal, os instrumentos utilizados para avaliação da satisfação dos utentes idosos foram o questionário sócio-demográfico e a construção de uma escala de avaliação da satisfação. Para análise dos resultados foram utilizados os testes estatísticos: teste t, o teste não paramétrico, Kruskal Wallis e o SPSS – versão 19. Os resultados obtidos permitem concluir que os utentes das UMDR e ULDM se encontram satisfeitos com a qualidade da prestação dos cuidados que lhes são prestados e com o internamento. De entre os resultados obtidos destaca-se, ainda, a identificação de três fatores principais responsáveis pela satisfação dos utentes internados nas UMDR e ULDM: 1) “ambiente físico, segurança e acolhimento profissional”; 2) “apoio familiar e social”; e 3) “informação e processo terapêutico”.

Extração e estudo das proteínas da goma da alfarroba com vista à sua clarificação

O objectivo primordial deste trabalho foi efectuar a extracao e o estudo das proteinas da Goma da Alfarroba ou Locust Bean Gum (LBG) com vista a sua clarificacao e purificacao. Para atingir este objectivo em primeiro lugar estudou-se o teor de etanol que se deveria utilizar numa suspensao aquosa de LBG, uma vez que a LBG e um polissacarido que hidrata facilmente com agua e consequentemente origina solucoes altamente viscosas que impossibilitam a realizacao de tecnicas de extracao de proteinas. Para isso estudou-se o comportamento da LBG em suspensoes aquosas com 10% (p/v) de LBG e diferentes concentracoes de etanol, designadamente 10% (v/v), 20% (v/v), 30% (v/v) e 40% (v/v). Com este estudo concluiu-se que seria necessario utilizar uma concentracao de 40% (v/v) de etanol a 96% em cada suspensao de LBG a 10% (p/v) para conseguir evitar a sua hidratacao excessiva. Assim, todas as extracoes neste trabalho foram realizadas de acordo com estas condicoes. Posteriormente com vista a extracao das proteinas da LBG testaram-se diferentes tratamentos, designadamente tratamentos alcalinos, acidos e com detergentes. Segundo a bibliografia consultada para os tratamentos alcalinos, realizaram-se estas extracoes com hidroxido de sodio (NaOH) com concentracoes de 0,025 M, 0,05M, 0,1M e 0,2M. Estes tratamentos foram iniciados com uma concentracao de NaOH a 0,2M, contudo apos analise dos resultados verificou-se que esta originou uma LBG com uma coloracao mais amarela do que a LBG bruta (inicial) apresentava. Sendo a ideia final a clarificacao da goma este nao foi um resultado desejavel e como tal testaram-se concentracoes inferiores de NaOH, acima referidas. No final concluiu-se que todas estas extracoes efetuadas com NaOH originavam uma LBG mais amarela do que a LBG bruta e que assim este nao seria o tratamento mais adequado para o objectivo pretendido. Como tal prosseguiram-se os estudos com um tratamento acido, que atraves de consulta bibliografica se iniciou com acido sulfurico (H2SO4). O tratamento acido iniciou-se com uma concentracao de H2SO4 de 0,1M, testando-se posteriormente tambem uma extracao com H2SO4 com concentracao de 0,05M. No final destas extracoes verificou-se que a LBG obtida em ambas apresentava uma coloracao mais clara do que a LBG bruta, o que representava, numa primeira analise, um bom resultado. Por fim efectuaram-se extracoes solido-liquido com diferentes detergentes, designadamente com Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 65, Tween 80, Tween 85, Triton X-100, Triton X-114 e SDS todos a uma concentracao de 0,1% (v/v) a excepcao do Tween 65 em que foi utilizada uma concentracao de 0,1% (p/v), porque a temperatura ambiente este detergente e solido. No final destas extracoes concluiu-se que na maioria dos casos a LBG apresentava uma coloracao mais clara do que a LBG bruta. Para quantificar as proteinas extraidas atraves de cada um dos tratamentos acima mencionados utilizaram-se dois metodos, o metodo de Bradford para quantificar as proteinas presentes nos sobrenadantes das extracoes e o metodo de Kjeldahl para quantificar as proteinas ainda presentes na LBG apos as extracoes. Analisando os resultados obtidos por estes metodos concluiu-se que a extracao efetuada com Tween 80, em que se efectuou uma lavagem adicional a LBG durante a filtracao com uma solucao de agua destilada e etanol a 40% (v/v), foi a que apresentou melhores resultados. Assim, foi com esta amostra proteica que se prosseguiram os estudos as proteinas. Para realizar os estudos as proteinas extraidas efectuou-se uma eletroforese em SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) com o intuito de verificar o estado da amostra. Analisando os geles obtidos constatou-se que a amostra se encontrava em boas condicoes. Deste modo realizou-se uma eletroforese bidimensional (2 – D) das proteinas extraidas da LBG. Nesta tecnica, como se desconheciam que tipo de proteinas se encontravam presentes na amostra utilizou-se uma banda de pH para a Focagem Isoelectrica (1a Dimensao) entre 3 e 10 e a separacao por Peso Molecular (2a Dimensao) foi efetuada em SDS-PAGE. Analisando os geles obtidos concluiu-se que a maioria das proteinas presentes nesta amostra apresentam pontos isoelectricos na gama de pH entre 5 e 6 e tem pesos moleculares entre 40 e 60 kDa. Pode-se entao concluir que o objectivo deste trabalho foi apenas parcialmente atingido uma vez que se conseguiu extrair e estudar algumas das caracteristicas das proteinas presentes na LBG, mas nao se alcancou a sua clarificacao.

Searching biocompounds in marine natural extracts with potential use in tumor prevention and treatment

Cancer is a multistage process characterized by three stages: initiation, promotion and progression; and is one of the major killers worldwide. Oxidative stress acts as initiator in tumorigenesis; chronic inflammation promotes cancer; and apoptosis inactivation is an issue in cancer progression. In this study, it was investigated the antioxidant, antiinflammatory and antitumor properties of hexane, ether, chloroform, methanol and water extracts of five species of halophytes: A. macrostachyum, P. coronopus, J. acutus, C. edulis and A. halimus. Antioxidant activity was assessed by DPPH• and ABTS•+ methods, and the total phenolics content (TPC) was evaluated by the Folin-Ciocalteau method. The anti-inflammatory activity of the extracts was determined by the Griess method, and by evaluating the inhibition of NO production in LPS-stimulated RAW- 264.7 macrophages. The cytotoxic activity of the extracts against HepG2 and THP1 cell lines was estimated by the MTT assay, and the results obtained were further compared with the S17 non-tumor cell line. The induction of apoptosis of J. acutus ether extract was assessed by DAPI staining. The highest antioxidant activities was observed in C. edulis methanol and the J. acutus ether extracts against the DPPH• radical; and J. acutus ether and A. halimus ether extracts against the ABTS•+ radical. The methanol extracts of C. edulis and P. coronopus, and the ether extract of J. acutus revealed a high TPC. Generally the antioxidant activity had no correlation with the TPC. The A. halimus chloroform and P. coronopus hexane extracts demonstrated ability to reduce NO production in macrophages (> 50%), revealing their anti-inflammatory capacity. The ether extract of J. acutus showed high cytotoxicity against HepG2 cancer cells, with reduced cellular viability even at the lowest concentrations. This outcome was significantly lower than the obtained with the non-tumor cells (S17). This result was complemented by the induction of apoptosis.

Isolamento e produção de agentes de controlo biológico das principais doenças de pós-colheita, em citrinos e pomóideas

Potenciais agentes de biocontrolo foram isolados a partir da microbiota epifítica de folhas e frutos, de citrinos e pomóideas, de diferentes pomares, durante diferentes campanhas e de distintas condições de armazenamento. A atividade antagonista de 1465 microrganismos isolados foi testada em ensaios in vivo em pomóideas face a Penicillium expansum (104 esporos/ml) e em citrinos face a P. digitatum (105 esporos/ml) em frutos feridos e inoculados artificialmente. Aproximadamente 7,6% dos isolados reduziu a severidade (diâmetro da podridão) e a incidência (% podres) em mais de 25%, menos de 3% reduziu ambos os parâmetros em mais de 50%, mas apenas 4 microrganismos preencheram os critérios de seleção, redução da incidência e severidade em mais de 75%. Dos 4 e pelos resultados obtidos em ensaios de seleção secundária e de determinação da concentração mínima eficaz, destacaram-se e selecionaram-se 2 microrganismos, uma bactéria isolada de laranjas „Valencia late‟ e identificada como pertencente ao grupo das Enterobactérias, Pantoea agglomerans PCB-1 e uma levedura isolada a partir da superfície de maças 'Bravo de Esmolfe' identificada como Metschnikowia andauensis PBC-2, com o objetivo de usar dois modelos distintos de agentes de biocontrol, uma bactéria e uma levedura. P. agglomerans é um agente de biocontrolo já conhecido. A estirpe PBC-1 isolada neste trabalho mostrou ter elevada eficácia face aos principais agentes patogénicos na póscolheita de citrinos e pomóideas. M. andauensis é uma levedura recentemente descoberta e a estirpe PBC-2 diz respeito à primeira referência desta espécie como agente de biocontrolo, a qual foi recentemente objeto de concessão de Patente de Invenção Nacional nº 105210, como uma nova estirpe desta espécie para uso como agente de biocontrolo das doenças de póscolheita de frutos. A concentração mínima eficaz dos antagonistas revelou estar dentro dos limites para o seu desenvolvimento comercial. M. andauensis PBC-2 quando aplicada à concentração de 5×106 ufc/ml, permitiu uma redução da incidência e da severidade de 62 e 70%, respetivamente, e quando aplicada a 1×107 ufc/ml, uma redução de 90% de incidência e de 95% de severidade. P. agglomerans PBC-1 aplicada a 1 × 108 ufc/ml em maçãs e em citrinos no controlo de P. expansum e P. digitatum, respetivamente, propiciaram uma redução significativa de cerca de 86% de cada um dos agentes patogénicos. O espectro de ação de M. andauensis PBC-2 foi avaliado, verificando-se o controlo efetivo face a Rhizopus stolonifer, P. expansum e Botritys cinerea, em pera 'Rocha' e em diferentes cultivares de maçã e contra P. digitatum e Penicillium italicum em clementinas e laranjas de diferentes cultivares. Durante 4 épocas, a eficácia de M. andauensis PBC-2, foi avaliada e comparada com o fungicida sintético mais usado comercialmente, Imazalil, em ensaios semicomerciais. Os resultados assemelharam-se aos obtidos com o fungicida, a redução da incidência do bolor azul foi de 90% em maças armazenadas durante 3 meses a 1±0.5 ºC, seguido de 7 dias à temperatura ambiente, para simular o tempo de prateleira. Em ensaios do estudo da dinâmica populacional, verificou-se que o agente de biocontrolo M. andauensis PBC-2 tem uma excelente capacidade colonizadora e que consegue crescer e sobreviver nas feridas, mas também na superfície dos frutos, armazenados à temperatura ambiente e em condições de frio. Pelo contrário, M. andauensis PBC- não apresentou capacidade de sobrevivência no suco gástrico simulado, começando a população a diminuir imediatamente após exposição e passadas 48 h não restava população viável. Diferentes meios de cultura usualmente descritos na produção de leveduras foram testados na produção de M. andauensis PBC-2. Aquele que apresentou a maior população viável ao fim de 40 h de incubação foi o meio YPD, entretanto escolhido para estudos posteriores. O pH mais favorável ao crescimento foi de 6,5, não se observando diferenças significativas entre os crescimentos a 25 e 30 ºC. Estudou-se ainda o efeito da concentração das duas fontes de azoto do meio YPD e elegeu-se a combinação de 10 g/l de extrato de levedura e 20 g/l de peptona. Nos estudos de produção de biomassa dos dois potenciais agentes de biocontrolo, analisou-se o efeito da sacarose, frutose e glucose, como fontes de carbono e otimizou-se a concentração destes açúcares no crescimento em Erlenmeyer. Após 20 h de incubação a população viável de P. agglomerans PBC-1 atingiu 3.9×109, 1.5×109, 3.9×109 ufc/ml, respetivamente. No caso de M. andauensis PBC-2, foi obtida a população de 1.2×108, 5.3×108 e 1,3×108 ufc/ml, com glucose, sacarose e frutose, após 40 h. Os resultados permitem concluir que os dois agentes têm capacidade de metabolizar os açúcares testados, contudo e atendendo à produtividade de biomassa, rendimento, disponibilidade e custo, optou-se por usar a sacarose como fonte de carbono nos restantes ensaios, nomeadamente na transição de Erlenmeyer para reator biológico. Na produção de P. agglomerans PBC-1 escolheu-se o meio SAC (5 g/l sacarose e 5 g/l extrato de levedura). O meio YPS (12.5g/l sacarose, 10 g/l extrato de levedura, 20 g/l peptona) foi usado no aumento de escala de M. andauensis PBC-2. A otimização da produção em reator biológico de P. agglomerans PCB-1 foi realizada submetendo o microrganismo a diferentes condições hidrodinâmicas, testando-se arejamentos, dois tipos de turbina (hélice; rusthon) e dispersores (poroso, em L). Foram igualmente estudados, o efeito da concentração inicial do inoculo e a adição programada da fonte de carbono. Embora tenham sido testadas diferentes variações, o perfil dos diferentes parâmetros analisados foi idêntico, a população máxima viável foi de 3-5×109 ufc/ml. A diferença mais notória foi observada na fermentação com concentração inicial de 107 cfu/ml, que permitiu encurtar em cinco horas a fase lag, o que pode significar uma redução de tempo de fermentação, e consequentemente uma redução de custos. Visando a produção de biomassa a baixo custo, fator importante na implementação de um sistema de controlo biológico, estudou-se a possibilidade de utilizar subprodutos e resíduos da indústria alimentar no crescimento dos agentes de biocontrolo. Subprodutos da indústria de alfarroba e subprodutos e resíduos da indústria de sumos de citrinos foram utilizados na produção de P. agglomerans PBC-1 e de M. andauensis PBC-2, respetivamente. Desta forma, para além de uma redução dos custos de produção, pretendeu-se a valorização de um subproduto (no caso de alfarroba e do bagaço de citrinos) e mitigar os efeitos nefastos de um resíduo (licor), com elevada carga poluente, que gera graves problemas ambientais e que pode ditar o encerramento desta unidade industrial, com efeitos devastadores para a economia local. Realizaram-se extrações de subprodutos da indústria de alfarroba, a diferentes razões sólido/líquido, tempos e temperaturas, de forma a maximizar a extração de açúcares. A potencialidade de utilizar o extrato de açúcares obtido, na produção de P. agglomerans PBC-1 foi avaliada, em ensaios de crescimento em Erlenmeyer, com consequente transição para reator mecanicamente agitado. Os perfis de crescimento da cultura crescida com subprodutos da indústria de alfarroba assemelharam-se aos observados com sacarose como fonte de carbono. A biomassa viável produzida com subprodutos da indústria de alfarroba, foi de 4- 7×109 ufc/ml, o que permite concluir que é uma alternativa viável à produção deste microrganismo. A produção de M. andauensis PBC-2 com subprodutos da indústria de sumos de citrinos, foi estudada em Erlenmeyer tendo como objetivo conhecer os perfis de crescimento do microrganismo, bem como, estudar a melhor combinação desta fonte de carbono e sua concentração. O bagaço de citrinos e um resíduo líquido, que se denominou de licor, foram testados com resultados comparáveis à produção obtida com meio usado como standard, (YPS), sem comprometer a atividade antagonista do agente de biocontrolo. Posteriormente, foi realizada a produção em reator mecanicamente agitado, escolhendo-se para tal o meio YL (10 g/l extrato de levedura e licor à concentração de açúcares de 12.5 g/l). Os parâmetros de crescimento da cultura foram semelhantes aos obtidos com a fonte de carbono comercial. Após aproximadamente 40 h de incubação, a população viável de M. andauensis PCB-2 atingiu 3.1×108 ufc/ml. A produtividade de biomassa e rendimento foi de 0.435 g/l.h e 1.502 g/g, respetivamente, comparável a produtividade de biomassa (0.432 g/l.h) e rendimento (1.4416 g/g) observado no meio YPS. Os resultados obtidos, são uma base sólida para o aumento de escala a um nível laboratorial e semi-industrial, permitiram concluir que é exequível produzir M. andauensis a baixo custo e representam uma possível alternativa para um resíduo. Em estudos dos possíveis modos de ação, de M. andauensis PBC-2, conclui-se que, este agente de biocontrolo, não tem como modos de ação a produção de antibióticos ou de voláteis, uma vez que, não se verificou inibição do crescimento dos agentes patogénicos. A competição por ferro e a produção de enzimas líticas por M. andauensis PBC-2 foi estudada em meios com diferentes concentrações de ferro e em um meio de cultura, com paredes celulares de fungos, como única fonte de carbono. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que a produção e secreção de enzimas líticas não é o principal ou o mais importante modo de ação do agente de controlo biológico PBC-2, uma vez que a produção de quitinase observada ao 5 e 7º dia de incubação foi muito baixa, e não foi observada a produção de β-1,3- glucanases e proteases.

Molecular characterization of Gla-rich protein (GRP) gene expression and function

Gla-rich protein (GRP) is a vitamin K-dependent protein related to bone and cartilage recently described. This protein is characterized by a large number of Gla (γ-carboxyglutamic acid) residues being the protein with the highest Gla content of any known protein. It was found in a widely variety of tissues but highest levels was found in skeletal and cartilaginous tissues. This small secreted protein was also expressed and accumulated in soft tissues and it was clearly associated with calcification pathologies in the same tissues. Although the biological importance of GRP remains to be elucidated, it was suggested a physiological role in cartilage development and calcification process during vertebrate skeleton formation. Using zebrafish, an accepted model to study skeletal development, we have described two grp paralog genes, grp1 and grp2, which exhibited distinct patterns of expression, suggesting different regulatory pathways for each gene. Gene synteny analysis showed that grp2 gene is more closely related to tetrapod grp, although grp1 gene was proposed to be the vertebrate ortholog by sequence comparison. In addition, we identified a functional promoter of grp2 gene and using a functional approach we confirmed the involvement of transcription factors from Sox family (Sox9b and Sox10) in the regulation of grp2 expression. In an effort to provide more information about the function of grp isoforms, we generated two zebrafish transgenic lines capable to overexpress conditionally grp genes and possible roles in the skeleton development were studied. To better understand GRP function a mammalian system was used and the analysis of knockout mice showed that GRP is involved in chondrocyte maturation and the absence of GRP is associated to proteoglycans loss in calcified articular cartilage. In addition, we detected differences in chondrogenesis markers in articular chondrocyte primary culture. Overall, our data suggest a main role for GRP on chondrocyte differentiation.