Lichenicidin biosynthesis and search for novel antibacterial peptides

A estirpe Bacillus licheniformis I89 possui a capacidade de produzir alguns compostos com actividade antibacteriana. No presente estudo, a separação desses compostos foi realizada através da aplicação de vários procedimentos, incluindo extracção em fase sólida e cromatografia liquida de alta pressão. Dois destes compostos bioactivos constituem o lantibiótico de classe II lichenicidina e são caracterizados pela massas molecular de 3250 Da (Bliα) e 3020 Da (Bliβ). O cluster responsável pela biossíntese da lichenicidina foi heterologamente expresso em Escherichia coli, constituindo a primeira descrição da produção de um lantibiótico totalmente in vivo num hospedeiro Gram-negativo. Este sistema foi subsequentemente explorado com o objectivo de relacionar cada proteína codificada no cluster genético da lichenicidina na produção dos péptidos Bliα e Bliβ. O desenvolvimento do sistema de trans complementação possibilitou a produção de variantes destes péptidos. A análise das massas moleculares destas variantes assim como a análise dos padrões de fragmentação obtidos por MS/MS permitiu a revisão de algumas das características estruturais previamente proposta para Bliα e Bliβ. A análise dos genes hipoteticamente envolvidos na protecção da estirpe produtora contra a acção antibiótica da lichenicidina revelou, que em E. coli, a sua ausência não resulta no aumento da susceptibilidade a este composto. Verificou-se também que a presença destes genes não é essencial para a produção de lichenicidina em E. coli. Foi também confirmado experimentalmente que a membrana externa da E. coli constitui uma barreira natural para a entrada dos péptidos na célula. De facto, uma das características intrigantes da produção de lichenicidina por uma bactéria de Gram negativo reside no mecanismo de transporte dos dois péptidos através da membrana externa. Neste estudo foi demonstrado que na ausência da proteína de membrana TolC, a massa molecular de Bliα e Bliβ não foi identificada no sobrenadante de E. coli, demonstrando assim que a sua presença no ambiente extra-celular não se devia a um processo de lise bacteriana. Foi ainda avaliada a capacidade da maquinaria biossintética da lichenicidina para produzir o lantibiótico haloduracina, através do processamento de chimeras lichenicidina-haloduracina, contudo, os resultados foram negativos. Verificou-se ainda que em determinadas condições de incubação, a diferenciação da morfologia original da estirpe B. licheniformis I89 pode ocorrer. Esta dissociação implicou a transição da colónia parental e rugosa para uma colónia de aparência mais simples e suave. Desta forma, as diferenças das duas morfologias em termos de taxa de crescimento, esporulação e actividade antibiótica foram investigadas. Considerando especificamente Bliα e Bliβ verificou-se que a abundância destes péptidos nas culturas do fenótipo fino é geralmente inferior aquela identificada nas culturas do fenótipo parental. Por último, a diversidade de elementos genéticos constituintes de péptido sintetases não ribossomais (NRPS) foi investigada em lagoas no centro de Portugal e em solos provenientes de caves do sul de Portugal, revelando a presença de potenciais novas NRPS nestes ambientes.

Analysis of the organic matter associated to sea salt : definition of potential molecular markers based on the volatile composition and presence of glycosidic derivatives and polysaccharides

Sea salt is a natural product obtained from the evaporation of seawater in saltpans due to the combined effect of wind and sunlight. Nowadays, there is a growing interest for protection and re-valorisation of saltpans intrinsically associated to the quality of sea salt that can be evaluated by its physico-chemical properties. These man-made systems can be located in different geographical areas presenting different environmental surroundings. During the crystallization process, organic compounds coming from these surroundings can be incorporated into sea salt crystals, influencing their final composition. The organic matter associated to sea salt arises from three main sources: algae, surrounding bacterial community, and anthropogenic activity. Based on the hypothesis that sea salt contains associated organic compounds that can be used as markers of the product, including saltpans surrounding environment, the aim of this PhD thesis was to identify these compounds. With this purpose, this work comprised: 1) a deep characterisation of the volatile composition of sea salt by headspace solid phase microextraction combined with comprehensive two-dimensional gas chromatography time-of-flight mass spectrometry (HS-SPME/GCGC–ToFMS) methodology, in search of potential sea salt volatile markers; 2) the development of a methodology to isolate the polymeric material potentially present in sea salt, in amounts that allow its characterisation in terms of polysaccharides and protein; and 3) to explore the possible presence of triacylglycerides. The high chromatographic resolution and sensitivity of GC×GC–ToFMS enabled the separation and identification of a higher number of volatile compounds from sea salt, about three folds, compared to unidimentional chromatography (GC–qMS). The chromatographic contour plots obtained revealed the complexity of marine salt volatile composition and confirmed the relevance of GC×GC–ToFMS for this type of analysis. The structured bidimentional chromatographic profile arising from 1D volatility and 2D polarity was demonstrated, allowing more reliable identifications. Results obtained for analysis of salt from two locations in Aveiro and harvested over three years suggest the loss of volatile compounds along the time of storage of the salt. From Atlantic Ocean salts of seven different geographical origins, all produced in 2007, it was possible to identify a sub-set of ten compounds present in all salts, namely 6-methyl-5-hepten-2-one, 2,2,6-trimethylcyclohexanone, isophorone, ketoisophorone, β-ionone-5,6-epoxide, dihydroactinidiolide, 6,10,14-trimethyl-2-pentadecanone, 3-hydroxy-2,4,4-trimethylpentyl 2-methylpropanoate, 2,4,4-trimethylpentane-1,3-diyl bis(2-methylpropanoate), and 2-ethyl-1-hexanol. These ten compounds were considered potential volatile markers of sea salt. Seven of these compounds are carotenoid-derived compounds, and the other three may result from the integration of compounds from anthropogenic activity as metabolites of marine organisms. The present PhD work also allowed the isolation and characterisation, for the first time, of polymeric material from sea salt, using 16 Atlantic Ocean salts. A dialysis-based methodology was developed to isolate the polymeric material from sea salt in amounts that allowed its characterisation. The median content of polymeric material isolated from the 16 salts was 144 mg per kg of salt, e.g. 0.014% (w/w). Mid-infrared spectroscopy and thermogravimetry revealed the main occurrence of sulfated polysaccharides, as well as the presence of protein in the polymeric material from sea salt. Sea salt polysaccharides were found to be rich in uronic acid residues (21 mol%), glucose (18), galactose (16), and fucose (13). Sulfate content represented a median of 45 mol%, being the median content of sulfated polysaccharides 461 mg/g of polymeric material, which accounted for 66 mg/kg of dry salt. Glycosidic linkage composition indicates that the main sugar residues that could carry one or more sulfate groups were identified as fucose and galactose. This fact allowed to infer that the polysaccharides from sea salt arise mainly from algae, due to their abundance and composition. The amino acid profile of the polymeric material from the 16 Atlantic Ocean salts showed as main residues, as medians, alanine (25 mol%), leucine (14), and valine (14), which are hydrophobic, being the median protein content 35 mg/g, i.e. 4,9 mg per kg of dry salt. Beside the occurrence of hydrophobic volatile compounds in sea salt, hydrophobic non-volatile compounds were also detected. Triacylglycerides were obtained from sea salt by soxhlet extraction with n-hexane. Fatty acid composition revealed palmitic acid as the major residue (43 mol%), followed by stearic (13), linolenic (13), oleic (12), and linoleic (9). Sea salt triacylglycerides median content was 1.5 mg per kg of dry salt. Both protein and triacylglycerides seem to arise from macro and microalgae, phytoplankton and cyanobacteria, due to their abundance and composition. Despite the variability resulting from saltpans surrounding environment, this PhD thesis allowed the identification of a sea salt characteristic organic compounds profile based on volatile compounds, polysaccharides, protein, and triacylglycerides.

Membranas compósitas para separação de CO2

O presente trabalho envolveu a produção de membranas compósitas para separação de CO2 a altas temperaturas. Os compósitos habituais são constituídos por duas fases, uma cerâmica, de céria dopada com gadolínio (Ce0.9Gd0.1O0.95 - CGO) condutora de iões óxido, que funciona como suporte da segunda fase composta por uma mistura eutética de carbonatos alcalinos (Li2CO3 e Na2CO3), que assegura o transporte de iões carbonato. O objetivo do trabalho prende-se com o estudo do transporte de iões através destes compósitos, por forma a perceber se os sais destes compósitos apresentam condução iónica singular ou condução mista. Neste sentido a resposta a esta questão teve por base a realização de ensaios de eficiência faradaica com recurso a amostras compósitas envolvendo matrizes de CGO (condutor de iões óxido) e de aluminato de lítio (não condutor de iões óxido). A preparação tanto de esqueletos porosos como de compósitos foi realizada tendo por base métodos e precursores semelhantes aos usados na literatura. Primeiramente efetuou-se o processamento dos esqueletos porosos para posteriormente impregnação com mistura eutética de carbonatos. Obtidos os compósitos estes foram caraterizados por microscopia de impedância e por microscopia eletrónica de varrimento de forma a serem submetidos mais tarde aos ensaios de eficiência faradaica. Os resultados de eficiência faradaica revelaram que na realidade existem processos de condução mista cuja importância depende das condições de operação da membrana.

O sistema dois-hidrido de levedura para confirmação da sinalização de APP Tipo-Noth

Inúmeras potenciais funções foram sugeridas para a APP (Proteína Precursora de Amilóide de Alzheimer), contudo, fisiologicamente, a função precisa da APP não foi ainda desvendada. A APP tem características consistentes com a função de molécula-receptora, capaz de reconhecer sinais extracelulares. Também relevante para este trabalho, é o facto de que a sinalização através de RIP (Proteólise Intramembranar Regulada) tem consequências na expressão génica, como no caso da sinalização tipo-Notch. Tal como a proteína Notch, a APP é processada resultando num fragmento C-terminal designado por AICD (Domínio Intracelular da APP). Neste trabalho é focado o papel importante na sinalização nuclear desempenhado pelo fragmento AICD, especificamente através da interacção com proteínas adaptadoras, promovendo a transcrição. Com o objectivo de contribuir para uma melhor compreensão da base molecular da DA (Doença de Alzheimer), torna-se importante investigar as vias de localização nuclear do AICD e o seu envolvimento na transcrição génica, possivelmente afectando proteínas até agora não associadas à DA. Por estes motivos é fundamental a identificação de novas proteínas que interajam com a APP. Um rastreio foi efectuado, utilizando o sistema Dois-Híbrido em Levedura, para identificar interacções específicas do AICD no cérebro humano e, assim, caracterizar o interactoma do AICD. Foi feito o rastreio de aproximadamente 1.1x108 clones de uma biblioteca de cDNA de cérebro humano com o domínio C-terminal da APP com a mutação Y687E, que mimetiza o estado fosforilado. De experiências anteriores deste laboratório sabemos que a tirosina-687 afecta a localização subcelular da APP e é também consensual que a fosforilação é importante nos mecanismos de transdução de sinais, daí a utilização deste mutante parecer apropriada. O rastreio originou 55 clones positivos que foram analisados para identificar proteínas que interagem com a APP. Dois clones são particularmente importantes, a RanBPM e a Transportin-SR2, visto que estão associadas ao transporte de proteínas para o núcleo e confirmam a sinalização nuclear da APP. ABSTRACT: Many putative functions for APP (Alzheimer’s amyloid precursor protein) have been suggested, although the precise physiological function of APP remains to be elucidated. APP has characteristics consistent with it having a role as a receptor, capable of mediating extracellular signals. Also of relevance to the work described here is that RIP (Regulated Intramembrane Proteolysis) signalling can have consequences in gene expression, similar to Notch signalling. Like the latter, APP is processed by RIP resulting in a C-terminal fragment known as AICD. Here we test the hypothesis that the AICD fragment may play an important role in nuclear signalling, specifically by interacting with adaptor proteins potentiating transcription. Therefore, in order to contribute to our understanding of the molecular basis of AD (Alzheimer’s disease) it is important to investigate the pathways of AICD nuclear targeting and its involvement in gene transcription, possibly affecting other proteins hitherto not associated with AD. Thus, it is important to identify AICD binding proteins. A Yeast Two-Hybrid (YTH) screen was performed to identify human brainspecific AICD binding proteins, and thus characterize the AICD interactome. The screen of approximately 1.1 x108 clones from a human brain cDNA library was carried out using the AICD fragment with an Y687E mutation, which mimics phosphorylation on that residue. From previous work carried out in the laboratory we know that tyrosine-687 phosphorylation affects subcellular localization of APP, and it is also recognized that phosphorylation events are important in signal transduction mechanisms, hence the use of this mutant is appropriate. The YTH screen yielded 55 positive clones that were analysed and several novel brain-specific APP binding proteins were identified. Two clones were particularly important, RanBPM and Transportin-SR2, being that they are associated with the nuclear transport of proteins, and support the nuclear signalling for APP.

Aß biology and its contribution to Alzheimer's disease

A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa progressiva patologicamente caracterizada pela presença de placas de amilóide (placas senis) insolúveis e também pela presença de tranças neurofibrilhares,formadas pela proteína Tau hiperfosforiladada. O principal constituinte das placas senis é o peptídeo beta-amilóide (Ab), que deriva do processamento proteolítico da proteína precursora de amilóide de Alzheimer (APP). Embora Ab exista como um agregado pouco solúvel nas placas senis, ele é secretado pelas células como uma molécula solúvel. O Ab “per se” pode afectar o metabolismo da APP. Alguns autores sugerem que o Ab exerce o seu efeito alterando o processamento ou catabolismo da APP, outros sugerem que ele também induz a transcrição da APP, onde aumentando os níveis da APP pode estar a contribuir para a sua própria produção (mecanismo de “feedback” positivo). Assim sendo, torna-se difícil consolidar todas estas observações e identificar as potenciais funções fisiológicas do Ab “in vivo”, ou as consequências da sua produção. Neste trabalho caracterizaram-se os efeitos do Ab no metabolismo da APP. Os nossos estudos revelaram que um dos mecanismos induzidos pelo Ab é a acumulação intracelular do fragmento neuroprotector sAPP (isAPPa) em estruturas com características vesiculares associadas ao citosqueleto. Estudos adicionais em culturas primárias revelaram que o Ab estava a exercer o seu efeito ao nível da secreção vesicular, provavelmente interferindo com o transporte de APP/sAPP ao longo da rede do citosqueleto. Esta hipótese é sustentada pelo facto do Ab estar a afectar a estabilidade e a polimerização de proteínas envolvidas na dinâmica do citosqueleto. Contrariamente a publicações anteriores o Ab não induziu a transcrição da APP, na verdade em culturas primárias neuronais foi observado uma diminuição nos níveis de expressão da APP. Isto foi acompanhado por um aumento nos fragmentos C-terminais da APP (CTFs) e uma diminuição na localização nuclear do seu domínio intracelular (AICD), sugerindo alterações na sinalização nuclear da APP. O Ab pode afectar outras vias de sinalização, particularmente alterando o balanço entre as actividades das proteínas cinases e fosfatases, o que pode ter consequências para o desenvolvimento da doença. Os dados obtidos indicam que o Ab é capaz de inibir a actividade da proteína fosfatase1, a sua importância numa perspectiva de futuras terapias é discutida. Devido à relevância da agregação do Ab para a sua toxicidade, a formação de complexos com proteínas que promovem a sua desagregação/degradação e o seu efeito no processamento da APP foi avaliado. Na presença destes complexos observou-se uma reversão da acumulação isAPP, demonstrando o potencial terapêutico destas proteínas como moduladores do metabolismo da APP. Este trabalho permitiu compreender melhor os mecanismos envolvidos nos efeitos do Ab no processamento da APP e descobrir algumas moléculas que podem ser relevantes numa perspectiva de diagnóstico e terapia na DA.

Methodologies for a sustainable development of estuarine ecosystems

As zonas costeiras, estuarinas e lagunares são consideradas áreas muito produtivas e dotadas de grande biodiversidade sendo, por isso, consideradas de elevado valor ecológico e económico. No entanto, nas últimas décadas tem vindo a verificar-se um aumento da contaminação destes ecossistemas como resultado de diversas actividades antrópicas. As abordagens actualmente disponíveis para avaliação do impacto da poluição em ecossistemas estuarinos e lagunares apresentam diversos tipos de lacunas, pelo que é importante desenvolver metodologias mais eficazes com organismos autóctones. Neste contexto, o objectivo central desta dissertação consistiu em desenvolver e validar métodos ecologicamente relevantes para avaliação da contaminação estuarina e dos seus efeitos, utilizando o góbio-comum (Pomatoschistus microps), quer como organismo-teste quer como espécie sentinela, devido à importante função que desempenha nas cadeias tróficas de diversos estuários da costa Portuguesa. A Ria de Aveiro foi seleccionada como área de estudo principalmente pelo facto de possuir zonas com diferentes tipos de contaminação predominante e de haver conhecimento científico de base abundante e de elevada qualidade sobre este ecosistema. Na primeira fase do estudo, foram investigados os efeitos agudos de dois hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) (benzo[a]pireno e antraceno), de um fuel-óleo e de dois metais (cobre e mercúrio) em P. microps, utilizando ensaios laboratoriais baseados em biomarcadores e em parâmetros comportamentais, os quais foram avaliados utilizando um dispositivo expressamente desenvolvido para o efeito, designado por speed performance device (SPEDE). Como biomarcadores foram utilizados parâmetros envolvidos em funções fisiológicas determinantes para a sobrevivência e desempenho dos animais (neurotransmissão, obtenção de energia, destoxificação e defesas anti-oxidantes), nomeadamente a actividade das enzimas acetilcolinesterase, lactato desidrogenase, CYP1A1, glutationa S-transferases, glutationa reductase, glutationa peroxidase, superóxido dismutase, catalase, tendo ainda sido determinados os níveis de peroxidação lipídica como indicador de danos oxidativos. De forma global, os resultados indicaram que os agentes e a mistura testados têm a capacidade de interferir com a função neurológica, de alterar as vias utilizadas para obtenção de energia celular, induzir as defesas antioxidantes e, no caso do cobre e do mercúrio, de causarem peroxidação lipídica. Foram ainda obtidas relações concentração-resposta a nível dos parâmetros comportamentais testados, nomeadamente a capacidade de nadar contra a corrente e a distância percorrida a nadar contra o fluxo de água, sugerindo que os agentes testados podem, por exemplo, diminuir a capacidade de fuga aos predadores, as probabilidades de captura de presas e o sucesso reprodutivo. Na segunda fase, tendo sido já adaptadas técnicas para determinação de vários biomarcadores em P. microps e estudada a sua resposta a dois grupos de poluentes particularmente relevantes em ecossistemas estuarinos e lagunares (metais e HAPs), foi efectuado um estudo de monitorização utilizando P. microps como bioindicador e que incluiu diversos parâmetros ecológicos e ecotoxicológicos, nomedamente: 20 parâmetros indicativos da qualidade da água e do sedimento, concentração de 9 metais em sedimentos e no corpo de P. microps, 8 biomarcadores e 2 índices de condição na espécie seleccionada. A amostragem foi efectuada em quatro locais da Ria de Aveiro, um considerado como referência (Barra) e três com diferentes tipos predominantes de contaminação (Vagueira, Porto de Aveiro e Cais do Bico), sazonalmente, durante um ano. Os resultados obtidos permitiram uma caracterização ecotoxicológica dos locais, incluindo informação sobre a qualidade da água, concentrações de contaminantes ambientais prioritários nos sedimentos e nos tecidos de P. microps, capacidade desta espécie para bioacumular metais, efeitos exercidos pelas complexas misturas de poluentes presentes em cada uma das zonas de amostragem nesta espécie e possíveis consequências para a população. A análise multivariada permitiu analisar de forma integrada todos os resultados, proporcionando informação que não poderia ser obtida analisando os dados de forma compartimentalizada. Em conclusão, os resultados obtidos no âmbito desta dissertação indicam que P. microps possui características adequadas para ser utilizado como organismoteste em ensaios laboratoriais (e.g. abundância, fácil manutenção, permite a determinação de diferentes tipos de critérios de efeito utilizando um número relativamente reduzido de animais, entre outras) e como organismo sentinela em estudos de monitorização da poluição e da qualidade ambiental, estando portanto de acordo com estudos de menor dimensão previamente efectuados. O trabalho desenvolvido permitiu ainda adaptar a P. microps diversas técnicas bioquímicas vulgarmente utilizadas como biomarcadores em Ecotoxicologia e validá-las quer no laboratório quer em cenários reais; desenvolver um novo bioensaio, utilizando um dispositivo de teste especialmente concebido para peixes epibentónicos baseado na performance natatória de uma espécie autóctone e em biomarcadores; relacionar os efeitos a nível bioquímico com parâmetros comportamentais que ao serem afectados podem reduzir de forma drástica e diversificada (e.g. aumento da mortalidade, diminuição do sucesso reprodutivo, redução do crescimento) a contribuição individual para a população. Finalmente, foi validada uma abordagem multidisciplinar, combinando metodologias ecológicas, ecotoxicológicas e químicas que, quando considerada de forma integrada utilizando análises de estatística multivariada, fornece informação científica da maior relevância susceptível de ser utilizada como suporte a medidas de conservação e gestão em estuários e sistemas lagunares.

Study of pesticide effects on non-target organisms

A utilização insustentável de pesticidas, especialmente em zonas com elevado valor ecológico constitui uma ameaça à integridade dos ecossistemas. Sendo um problema à escala mundial, e também no contexto nacional, o presente trabalho pretende ser um contributo para a avaliação dos efeitos de pesticidas em organismos não alvo terrestres e, principalmente, aquáticos, em contextos de progressiva relevância ecológica. Neste sentido, o estudo foi direccionado para áreas (A1 e A2) integradas numa zona agrícola extensa em Portugal, utilizada para a produção de milho e, principalmente, de arroz (Baixo Mondego), a qual sustenta uma elevada biodiversidade. O estudo teve início na área A1, onde a monitorização físico-química e os ensaios com amostras naturais (ensaios WET - whole effluent tests) provenientes desta área evidenciaram que, apesar da ausência de pesticidas, as amostras de água colhidas no canal que atravessava os arrozais foram as mais nocivas para o crescimento de Pseudokirchneriella subcapitata e Chlorella vulgaris. Uma vez que outras fontes de contaminação (produção de gado) actuavam em A1, o estudo prosseguiu apenas na área A2. Assim, em A2, começou-se por determinar a toxicidade individual e da mistura de dois herbicidas formulados aplicados nos campos de arroz (Viper®) e milho (Mikado®) em condições laboratoriais. Viper® foi o herbicida mais tóxico, tanto para o crescimento de P. subcapitata e C. vulgaris, como para a sobrevivência, reprodução e crescimento de Daphnia longispina e Daphnia magna. Adicionalmente, estimou-se que a mistura Viper®/Mikado® induz efeitos antagonistas no crescimento de P. subcapitata e efeitos sinérgicos no crescimento de C. vulgaris e na sobrevivência dos dafnídeos. A avaliação da toxicidade destes herbicidas formulados e seus ingredientes activos no comportamento de minhocas terrestres (Eisenia andrei), usando solos naturais, demonstrou que Viper® e penoxsulam causaram uma % de evitamento superior nos organismos expostos. Contudo, o risco para E. andrei será à partida reduzido se as taxas de aplicação dos herbicidas forem respeitadas. Ensaios WET foram novamente usados para testar amostras naturais da área A2. Verificou-se que a qualidade do sistema aquático e do arrozal diminuiu durante a estação agrícola, em paralelo com a presença de nutrientes e pesticidas. O crescimento algal foi inibido, apesar dos parâmetros de história de vida dos dafnídeos terem sido estimulados. O resultado desta avaliação subestimou, em certos casos, os impactos reais causados pela aplicação de pesticidas. A avaliação in situ simultânea à aplicação de herbicidas nos arrozais demonstrou que os efeitos registados foram de facto restritos aos pulsos de herbicidas. A inibição das taxas de alimentação de D. longispina e D. magna forneceram um sinal precoce de alterações no sistema, seguido pela diminuição da sua sobrevivência e do crescimento de P. subcapitata. Em suma, as diferentes fases da avaliação efectuada confirmaram a existência de condições desfavoráveis devido às práticas agrícolas, reforçando a necessidade de se conjugar ensaios laboratoriais com avaliações in situ de maior relevância ecológica, para reduzir o grau de incerteza aliado à determinação dos riscos.

Cadmium phytotoxicity and trophic transfer to isopods

O cádmio (Cd) é um metal não essencial e é considerado um poluente prioritário pela comunidade europeia. Este metal atinge o ambiente no decurso de várias actividades antropogénicas e tende a concentrar-se nos solos e sedimentos, onde está potencialmente disponível para as plantas, sendo posteriormente transferido através da cadeia trófica. Neste contexto, o principal objectivo da presente dissertação foi o estudo dos efeitos da assimilação e da acumulação de Cd em plantas e as suas consequências para animais consumidores. Numa primeira fase, foram estudados os principais efeitos fisiológicos e genotóxicos do Cd em plantas. As plantas de alface (Lactuca sativa L.) expostas a Cd apresentaram um decréscimo na eficiência fotossintética, aumento de peroxidação lipídica e alterações significativas na actividade de enzimas de stress oxidativo. Estas alterações culminaram num decréscimo do crescimento da parte aérea no final da exposição. As respostas obtidas pelos parâmetros bioquímicos sugerem que estes poderão ser utilizados como eventuais biomarcadores em testes ecotoxicológicos com Cd em abordagens integrantes em conjunto com parâmetros clássicos. Os efeitos mutagénicos de Cd foram avaliados através da determinação da instabilidade de microsatélites (IM). Não foi observada IM, nem nas folhas nem nas raízes de plantas de alface com 5 semanas de idade expostas a 100 μM Cd durante 14 dias, no entanto observou-se IM em raízes de alface exposta a 10 μM Cd durante 28 dias desde a germinação. A idade da planta e a maior acumulação de Cd nas raízes poderão explicar os resultados obtidos. A clastogenicidade de Cd foi analisada em três espécies vegetais com diferentes capacidades de destoxificação e acumulação de metais através de citometria de fluxo. Foram detectadas alterações significativas nos parâmetros analisados em raízes alface, mas não nas espécies Thlaspi caerulescens J & C Presl e Thlaspi arvense L. Estes resultados sugerem que o stress provocado pelo Cd originou clastogenicidade como consequência da perda de porções de cromossomas, uma vez que o conteúdo de ADN nuclear diminuiu. A transferência trófica através da cadeia alimentar permanece muito pouco estudada em termos ecotoxicológicos. A distribuição subcellular de metais num organismo pode ser utilizada para compreender a transferência trófica de um metal na cadeia alimentar. Como tal, numa última parte é estudado de que modo a distribuição subcellular do Cd em plantas com perfis de acumulação de Cd distintos afecta a biodisponibilidade e transferência trófica de Cd para isópodes. A distribuição de Cd entre as 4 fracções subcelulares obtidas através de centrifugação diferencial revelou a existência de diferenças significativas entre as espécies de plantas. Estes resultados em conjunto com a avaliação directa da eficiência de assimilação (EA) de Cd individual de cada uma das quatro fracções subcelulares das plantas em estudo, resultou em informação de grande relevância para a explicação das diferenças observadas na EA de Cd por parte de isópodes alimentados com folhas de diferentes espécies de plantas. Com base nos resultados obtidos, o Cd ligado a proteínas estáveis à temperatura (e.g. metaloteoninas e fitoquelatinas) é o menos biodisponível, sendo assim o que menos contribuiu para a transferência trófica, enquanto que o Cd ligado a proteínas desnaturadas pela temperatura foi a fracção mais disponível para transferência trófica de Cd ao isópode. Estes resultados realçam a relevância ecológica da distribuição subcelular de Cd em plantas que tem influência directa na tranferência trófica deste metal para os consumidores e ainda o facto de que alterações na distribuição subcelular de Cd em plantas devido a diferentes mecanismos de destoxificação poderá ter um impacto directo na transferência trófica de Cd para o animal consumidor.

Pesca comercial de tubarões e raias em Portugal

O objectivo do trabalho foi analisar os desembarques de tubarões e raias em Portugal no período 1986 – 2006. Esta análise revelou que os desembarques totalizaram 108.671 ton no referido período de 21 anos. Anualmente foram desembarcados, em média, cerca de 5.175 ton, com exemplares representantes de 8 ordens, 14 famílias e 44 espécies. Genericamente, os desembarques anuais destes grupos animais têm diminuído ao longo do tempo, apesar de se verificar um aumento no preço por quilo. O grupo mais desembarcado foi o das Raias (Raja sp.), responsável por 35.614 ton das capturas, ou seja, 33% do total. A este grupo seguiram-se as Patas-roxas (Scyliorhinus sp.), os tubarões Carocho (Centroscymnus coelolepis), Lixa (Centrophorus squamosus) e Barroso (Centrophorus granulosus), correspondendo a 12%, 12%, 10% e 9% dos desembarques, respectivamente. Na ausência de dados consistentes de CPUE, a comparação dos padrões de desembarques e preço foi utilizada como indicador da evolução do recurso, tendo em conta as várias espécies de elasmobrânquios. Centrophorus granulosus, Cações (Mustelus sp.), Tremelgas (Torpedo sp.), Marrachos (Carcharhinus sp.) e Tubarões-anjo (Squatina sp.) indiciaram sinais de possível sobrexploração, situação esta a merecer a atenção de programas futuros de I & DT. A evolução do esforço de pesca ao longo do tempo, ponderada sob a forma de “número de embarcações de pesca”, registou uma diminuição acentuada, embora substancialmente menor que a diminuição registada nos desembarques das espécies referidas. É pouco provável, por isso, que a diminuição dos desembarques seja fruto, unicamente, da diminuição na frota de pesca, mas sim de uma menor rendibilidade da actividade. Paralelamente, os aumentos de preço observados suplantaram largamente a taxa de inflação média, pelo que o aumento dos primeiros não é justificado inteiramente pelo aumento do segundo. Estes resultados tiveram eco nas análises de componentes principais (MAFA e DFA) conduzidas para as espécies, que validaram padrões de diminuição particularmente elevados nas espécies em que métodos anteriores já haviam apontado sinais de sobrepesca. Os resultados obtidos apontam para o facto de que algumas espécies parecem estar fora dos limites biológicos de segurança e, como tal, há necessidade de serem tomadas medidas de gestão eficazes.

Phytochelatin signal tranduction and cadmium chelation in plants

As plantas utilizam diversas estratégias de sinalização para reconhecer e responder aos stresses ambientais. A maioria das vias de transdução de sinais partilham um sinal genérico, normalmente a modulação dos níveis intracelulares de Ca2+. Esta por sua vez pode iniciar uma cascata de fosforilação proteica que finalmente afecta as proteínas directamente envolvidas na protecção celular ou culmina em factores de transcrição que vão determinar a resposta fisiológica ao stresse. A percepção destes sinais e a compreensão de como estes podem activar as respostas adaptativas são factores-chave para a tolerância das plantas a stresses abióticos. Um dos principais stresses abóticos que restrigem o crescimento das plantas é a presença de metais pesados. A produção de fitoquelatinas e a subsequente quelação dos metais é o mecanismo mais conhecido de tolerância ao stresse metálico em plantas. Fitoquelatinas (PCs) são péptidos com grupos tiol que são sintetizados através da transpeptidação da glutationa (GSH), pela acção da enzima fitoquelatina sintase (PCS). No entanto, até ao momento, as vias de sinalização que levam à síntese de fitoquelatinas e à percepção do stresse metálico são pouco compreendidas. Dentro deste contexto, o presente trabalho foi elaborado com o intuito de elucidar a via de sinalização através da qual o cádmio é detectado pelas células vegetais e induz a síntese de PCs. Quase todos, os estudos de stresses abióticos em plantas apontam para o facto de a sua sinalização se basear nos mesmos tipos de sinais moleculares, nomeadamente a sinalização por cálcio, a fosforilação proteica e a indução de espécies reactivas de oxigénio (ROS). Trabalhos recentes sugerem que a sinalização de PCs poderá envolver todos estes parâmetros. Assim, uma primeira abordagem foi efectuada para compreender a síntese de PCs na espécie Arabidopsis thaliana, através da monitorizaçção da actividade de enzimas relacionadas, a γ-EC sintetase, GSH sintetase e a PC sintase (PCS), assim como o tempo necessário para o elongamento das PCs e a sua acumulação. Seguidamente, ao longo deste processo foi analisada a expressão de sinais específicos, associados com sinais de cálcio, fosforilação proteica e sinalização por ROS. A importância destes factores na síntese de PCs foi também avaliada através do uso de moduladores farmacológicos de cálcio e fosfatases proteicas e também pela indução de stresse oxidativo. Os resultados demonstraram novos dados sobre o papel do cálcio e da fosforilação proteica na produção de PCs e na síntese de GSH, revelando que a actvidade da PCS é regulada por fosforilação e que a sinalização de cálcio pode mediar a síntese de GSH. O envolvimento da sinalização de ROS na síntese de GSH, atráves de crosstalk com a sinalização de cálcio também foi proposta. Assim, os resultados aqui apresentados descrevem uma possível via de sinalização de cádmio nas plantas e da indução de fitoquelatinas. Este trabalho poderá ser portanto muito útil na implementação de novas metodologias de agricultura sustentável e práticas de fitorremediação em solos contaminados com metais pesados.

Determinant factors for the use of imposex in TBT pollution monitoring

Os compostos de tributilestanho (TBT) foram utilizados como biocidas em tintas antivegetativas (AV) e amplamente aplicados, durante décadas, de forma a evitar a bioincrustação em superfícies submersas, principalmente em cascos de embarcações. Os seus efeitos deletérios em organismos não-alvo tornaram-se evidentes após o aparecimento de gastrópodes prosobrâquios com imposex – sobreposição de caracteres sexuais masculinos sobre o tracto reprodutivo das fêmeas. Desde então, a expressão do imposex em prosobrânquios tem sido amplamente utilizada como biomarcador da poluição por TBT. Um dos objectivos da presente tese é avaliar se as mais recentes restrições legais na utilização das tintas AV com compostos organoestânicos (OTs) resultaram numa redução da poluição pelos mesmos na costa continental Portuguesa. Para tal, foi levada a cabo a análise da variação temporal do imposex como biomarcador dos níveis ambientais de TBT e a validação de procedimentos, de modo a seguir de forma precisa a evolução da intensidade deste fenómeno ao longo do tempo. O trabalho de investigação teve início no momento em que a ineficácia da legislação anterior (Directiva 89/677/CEE) na redução da poluição por TBT no litoral Português era reportada na literatura e quando estavam já agendados instrumentos decisivos para a diminuição definitiva deste tipo de poluição: o Regulamento (CE) N.º 782/2003 do Parlamento e do Conselho da União Europeia (UE) que bania as tintas AV baseadas em TBT na sua frota a partir de 1 de Julho de 2003; a "Convenção Internacional sobre o Controlo de Sistemas Antivegetativos Nocivos em Navios” (Convenção AFS), adoptada em 2001 pela Organização Marítima Internacional (OMI), que procurava erradicar os OTs da frota mundial até 2008. Os níveis de imposex e as concentrações de OTs nos tecidos de fêmeas de Nucella lapillus foram medidos em 17 locais de amostragem ao longo da costa Portuguesa em 2003, a fim de se avaliarem os impactos do TBT nas populações desta espécie e de se criar uma base de dados para seguir a sua evolução futura. O índice da sequência do vaso deferente (VDSI), o índice do tamanho relativo do pénis (RPSI) e a percentagem de fêmeas afectadas por imposex (%I) foram utilizados na medição da intensidade deste fenómeno em cada local de amostragem e os seus valores variaram entre 0,20-4,04, 0,0- 42,2% e 16,7-100,0%, respectivamente. Foram encontradas fêmeas estéreis em 3 locais de amostragem, com percentagens a variar entre 4,0 e 6,2%. As concentrações de TBT e dibutilestanho (DBT) nas fêmeas variaram respectivamente entre 23-138 e <10-62 ng Sn.g-1 de peso seco, e o conteúdo em TBT nos tecidos revelou-se significativamente correlacionado com o imposex (nomeadamente com o RPSI e o VDSI). Os níveis de expressão do fenómeno e o conteúdo em OTs nos tecidos, foram superiores na proximidade de portos, confirmando as conclusões obtidas anteriormente por outros autores de que os navios e a actividade dos estaleiros são as principais fontes destes compostos no litoral Português. As infra-estruturas associadas ás principais fontes de OTs – portos, estaleiros e marinas – estão geralmente localizadas no interior de estuários, motivo pelo qual estas áreas têm vindo a ser descritas como as mais afectadas por estes poluentes. Por esta razão, foi levado a cabo o estudo pormenorizado da poluição por TBT na Ria de Aveiro, como caso de estudo representativo da poluição por estes compostos num sistema estuarino em Portugal continental. N. lapillus foi usada como bioindicador para avaliar a tendência temporal da poluição por TBT nesta área entre 1997 e 2007. Foi registada uma diminuição da intensidade do imposex após 2003, embora as melhorias mais evidentes tenham sido observadas entre 2005 e 2007, provavelmente devido à implementação do Regulamento (CE) N.º 782/2003 que proibiu a aplicação de tintas AV com TBT em navios com a bandeira da UE. Apesar desses progressos, as análises ao conteúdo em OTs nos tecidos de fêmeas de N. lapillus e em amostras de água colhidas em 2006 indicaram contaminação recente por TBT na área de estudo, evidenciando assim a permanência de fontes de poluição. A utilização de N. lapillus como bioindicador da poluição por TBT na Ria de Aveiro apresenta algumas limitações uma vez que a espécie não ocorre nas áreas mais interiores da Ria e não vive em contacto com sedimentos. Assim, a informação obtida a partir da sua utilização como bioindicador é fundamentalmente relativa aos níveis de TBT na coluna de água. Foi então necessário recorrer a um bioindicador complementar – Hydrobia ulvae – para melhor avaliar a evolução temporal da poluição por TBT no interior deste sistema estuarino e estudar a persistência de TBT nos sedimentos. Não foi registada uma diminuição dos níveis de imposex em H. ulvae na Ria de Aveiro entre 1998 e 2007, apesar da aplicação do Regulamento (CE) N.º 782/2003. Pelo contrário, houve um aumento global significativo da percentagem de fêmeas afectadas por imposex e um ligeiro aumento do VDSI, contrastando com o que tem sido descrito para outros bioindicadores na Ria de Aveiro no mesmo período. Estes resultados mostram que a diferente biologia/ecologia das espécies indicadoras determina vias distintas de acumulação de TBT, apontando a importância da escolha do bioindicador dependendo do compartimento a ser monitorizado (sedimento versus água). A ingestão de sedimento como hábito alimentar em H. ulvae foi discutida como sendo a razão para a escolha da espécie como indicadora da contaminação dos sedimentos por TBT. Foram também estudados os métodos mais fiáveis para reduzir a influência de variáveis críticas na medição dos níveis de imposex em H. ulvae. As comparações de parâmetros do imposex baseados em medições do pénis devem ser sempre realizadas sob condições de narcotização bem standardizadas uma vez que este procedimento provoca um aumento significativo do comprimento do pénis (PL) em ambos os sexos. O VDSI, a % e o PL em ambos os sexos revelaram ser fortemente influenciados pelo tamanho dos espécimes: a utilização de fêmeas mais pequenas conduz à subestimação do VDSI, da %I e do PL, enquanto que diferenças no tamanho dos machos provocam variações no índice do comprimento relativo do pénis (RPLI), independentemente dos níveis de poluição por TBT. Existe, portanto, a necessidade de controlar algumas variáveis envolvidas na análise do imposex que mostraram afectar a fiabilidade dos resultados. Uma vez que N. lapillus é o principal bioindicador dos efeitos biológicos específicos do TBT para a área da OSPAR, foi também estudada a influência de algumas variáveis na avaliação dos níveis de imposex nesta espécie, especificamente as relacionadas com o ciclo reprodutor e o tamanho dos espécimes. O estudo do ciclo reprodutor e a variação sazonal/espacial do comprimento do pénis do macho (MPL) incidiu num único local no litoral Português (Areão – região de Aveiro) de forma a avaliar se o RPSI varia sazonal e espacialmente na mesma estação de amostragem e se tais variações influenciam os resultados obtidos em programas de monitorização do imposex. Nos meses de Dezembro de 2005 a Junho de 2007, foram encontrados espécimes de N. lapillus sexualmente maturos e potencialmente aptos para a reprodução. Contudo, foi também evidente um padrão sazonal do ciclo reprodutor – o estado de desenvolvimento da gametogénese nas fêmeas variou sazonalmente e ocorreu uma diminuição do volume da glândula da cápsula e do factor de condição no final do Verão / início do Outono. Contrariamente, a gametogénese nos machos não apresentou variação sazonal significativa, embora os valores mais baixos do factor de condição, do comprimento do pénis e dos volumes de esperma e da próstata tenham também sido registados no final do Verão / início do Outono. Além disso, o MPL mostrou variar, no mesmo local de amostragem, inversamente com a distância aos ninhos de cápsulas ovígeras; um aumento dos valores do MPL foi também observado em espécimes de maior tamanho. Todas estas variações no MPL introduzem desvios nos resultados da avaliação do imposex quando é usado o RPSI. A magnitude do erro envolvido foi quantificada e revelou-se superior em locais com níveis mais elevados de poluição por TBT. Apesar do RPSI ser um índice que fornece informação importante sobre os níveis de poluição por TBT, a sua interpretação deve ser cuidadosa e realizada complementarmente com os outros índices, destacando-se o VDSI como índice mais fiável e com significado biológico mais expressivo. Novas campanhas de monitorização do imposex em N. lapillus foram realizadas ao longo da costa Portuguesa em 2006 e 2008, e os resultados subsequentemente comparados com a base de dados criada em 2003,de forma a avaliar a evolução da poluição por TBT no litoral Português naquele período. Nestes estudos foram aplicados novos procedimentos na monitorização e tratamento dos dados, de forma a minimizar a variação nos índices de avaliação do imposex induzida pelos factores acima descritos, para seguir com maior consistência a tendência da poluição por TBT entre 2003 e 2008. Foi observado um declínio global significativo na intensidade de imposex na área de estudo durante o referido período e a qualidade ecológica da costa Portuguesa, segundo os termos definidos pela Comissão OSPAR, revelou melhorias notáveis após 2003 confirmando a eficácia do Regulamento (CE) N.º 782/2003. Não obstante, as populações de N. lapillus revelaram-se ainda amplamente afectadas por imposex, tendo sido detectadas emissões de TBT na água do mar ao longo da costa em 2006, apesar da restrição anteriormente referida. Estes inputs foram atribuídos principalmente aos navios que à data ainda circulavam com tintas AV com TBT aplicadas antes de 2003, uma vez que a sua utilização nas embarcações foi apenas proibida em 2008. Considerando que o Regulamento (CE) N.º 782/2003 constitui uma antecipação da proibição global da OMI que entrou em vigor em Setembro de 2008, prevê-se, por analogia, que haja uma rápida diminuição da poluição por TBT à escala mundial num futuro próximo. Na sequência desta previsão, é apresentada uma discussão teórica preliminar relativamente ás possíveis estratégias usadas por N. lapillus na recolonização de locais onde, no passado, as populações terão aparentemente sido extintas devido a níveis extremamente elevados de TBT. Estes locais são tipicamente zonas abrigadas junto de infra-estruturas portuárias, cuja recolonização por esta espécie será provavelmente muito lenta dada a mobilidade reduzida dos adultos e o ciclo de vida não apresentar fase larvar pelágica. Foram então equacionadas duas hipotéticas vias de recolonização de zonas abrigadas por espécimes provenientes de populações de costa aberta/exposta: a migração de adultos e/ou a dispersão de juvenis. No entanto, em ambos os casos, estaria implicada a transposição de um problema amplamente descrito na bibliografia: as populações de N. lapillus de costa aberta podem apresentar um fenótipo muito diferente das de zonas abrigadas, podendo inclusivamente variar no número de cromossomas. A recolonização pode portanto não ter sucesso pelo simples facto dos novos recrutas não estarem bem adaptados aos locais a recolonizar. Para analisar este problema, foram estudados tanto a forma da concha de espécimes de N. lapillus ao longo da costa Portuguesa como o respectivo número de cromossomas. Embora a forma da concha tenha revelado diferenças, de acordo com o grau de hidrodinamismo entre as populações de N. lapillus avaliadas, o cariótipo 2n = 26, típico de zonas expostas, foi registado em todos os locais amostrados. Por outro lado, foi também testada em laboratório a possível mortalidade de juvenis em dispersão no interior menos salino dos estuários. Foi então verificada a ocorrência de mortalidade elevada de juvenis expostos a salinidades baixas (=100% após 1 hora a salinidades ≤9 psu), o que também pode comprometer a recolonização de zonas estuarinas menos salinas por esta via. Mesmo assim, os juvenis mostraram um comportamento de flutuação à superfície da água em condições laboratoriais, que pode ser considerado um benefício específico na colonização de áreas mais internas dos estuários, se tal facto vier a ser confirmado em estudos de campo. As conclusões deste estudo contribuem certamente para a descrição do final da “história do TBT” dado que, uma vez controlados alguns factores determinantes no uso do imposex como biomarcador, a avaliação do declínio da poluição por estes compostos, agora esperado à escala global, se torna mais rigorosa.

Ultrastructure and phylogeny of peridinioid dinoflagellates

Os dinoflagelados são um grupo muito diverso de protistas que possuem um conjunto de características pouco comuns. Os peridinióides são dinoflagelados com teca que é formada por seis séries latitudinais de placas, incluindo a série cingular e um anel incompleto de placas intercalares anteriores, embora as últimas estejam ausentes em algumas espécies de Peridiniopsis. São dinoflagelados com simetria bilateral em relação ao plano apical que contem o eixo dorso-ventral. Na série sulcal há apenas uma placa posterior que contacta com o limite ventral de duas grandes placas antapicais. Entre os peridinióides, a presença ou ausência de um poro apical e o número de placas no cíngulo são geralmente consideradas marcas filogenéticas importantes ao nível de género ou família. Actualmente, a definição de Peridinium Ehrenberg, o dinoflagelado mais comum de água doce, inclui organismos com combinações diferentes destas duas características. Trabalhos anteriores sobre a ultrastrutura e afinidade filogenética das espécies tipo de Peridinium, P. cinctum, e Peridiniopsis Lemmermann, P. borgei também sugerem a necessidade de reexaminar as relações taxonómicas dos peridinióides. Esta tese combina o estudo ultrastrutural de uma selecção de espécies com hipóteses filogenéticas baseadas nas sequências de LSU rDNA, para aumentar o nosso conhecimento das diferenças e afinidades dentro dos peridinióides. Tem como objectivo aumentar o nosso conhecimento das características individuais das células que possam levar a reconhecer sinapomorfias que possam ser usadas como marcadores dos peridinióides como um todo e dos seus subgrupos. As espécies escolhidas para exame pormenorizado foram: Peridinium palatinum Lauterborn, de um grupo com duas placas intercalares anteriores, seis placas cingulares e sem poro apical; Peridinium lomnickii Wo!oszy"ska, de um grupo com poro apical, três placas intercalares e seis cingulares; Peridiniopsis berolinensis (Lemmermann) Bourrelly, uma espécie heterotrófica com poro apical, sem placas intercalares e com seis placas cingulares; e Sphaerodinium cracoviense Wo!oszy"ska, um membro de um género de formas com teca com um tipo de tabulação marginalmente peridinióide, com um suposto poro apical e quatro placas intercalares anteriores. Peridinium palatinum difere de Peridinium e Peridiniopsis típicos, quer em características da teca, quer internas. As diferenças estimadas entre as sequências parciais de LSU rDNA de P. palatinum e a espécie próxima P. pseudolaeve, relativamente a P. cinctum são comparativamente grandes e, juntamente com a topologia da árvore filogenética, apoiam a separação de P. palatinum e formas próximas ao nível de género. Palatinus nov. gen. foi, então, descrito com as novas combinações Palatinus apiculatus nov. comb. (espécie tipo; sin. Peridinium palatinum), P. apiculatus var. laevis nov. comb. e P. pseudolaevis nov. comb.. As características distintivas de Palatinus incluem uma superfície das placas lisa ou um tanto granulosa, mas não areolada, um grande pirenóide central penetrado por canais citoplasmáticos e de onde radiam lobos plastidiais, e a presença de uma fiada microtubular homóloga à de um pedúnculo. As células de Palatinus saem da teca pela zona antapicalpos- cingular. Peridinium lomnickii apresenta tabulação semelhante às formas marinhas, produtoras de quistos calcários, do género Scrippsiella A.R. Loeblich. Para comparação, adicionámos novas observações ultrastruturais de S. trochoidea. Peridinium lomnickii tem uma combinação de características diferente de Peridinium, Peridiniopsis e Scrippsiella. As hipóteses filogenéticas baseadas em DNA colocam P. lomnickii no mesmo ramo que Pfiesteria Steidinger et Burkholder, Tyrannodinium e outras Pfiesteriaceae, com as quais partilha um "microtubular basket" e uma ligação peculiar entre duas placas do sulco. As características distintivas do novo género proposto Chimonodinium gen. ined. incluem, além da tabulação, a ausência de pirenóides, a presença de um "microtubular basket" com quatro ou cinco fiadas sobrepostas de microtúbulos associados a um pequeno pedúnculo, um sistema pusular com tubos pusulares bem definidos ligados aos canais flagelares, e a produção de quistos não calcários. Peridiniopsis berolinensis partilha várias características significativas com Pfiesteria e afins, como um "microtubular basket" com a capacidade de suportar um tubo de alimentação, quimiossensibilidade para encontrar presas apropriadas, o modo de natação junto às presas e a organização geral da célula. Hipóteses filogenéticas com base em LSU rDNA confirmam a afinidade entre P. berolinensis e Pfiesteria bem como a relação mais remota com a espécie tipo de Peridiniopsis, P. borgei. Estas razões justificam a proposta de Tyrannodinium gen. nov., uma nova Pfiesteriaceae que difere de outros membros do grupo por viver em água doce e nos pormenores da tabulação. Sphaerodinium cracoviense revelou a tabulação típica do género Sphaerodinium, que apresenta um número de placas intercalares superiores e pos-cingulares maior que o que é típico em peridinióides: 4 e 6, respectivamente. Observações em SEM mostraram uma estrutura apical diferente da dos peridinióides, e um sulco apical numa das placas fazendo lembrar a área apical de alguns woloszynskióides. Os pormenores do aparelho flagelar e do sistema pusular ligam o Sphaerodinium aos woloszynskióides em geral e ao género Baldinia em particular, mas não aos peridinióides. O volumoso estigma de S. cracoviense revelou ser extraplastidial e de um modelo único, composto por elementos que se encontram em woloszynskióides, mas nunca encontrados anteriormente juntos. A análise filogenética baseada nas sequências parciais de LSU rDNA também sugerem uma maior proximidade de S. cracoviense com os woloszynskióides do que com os peridinióides. Futuras análises pormenorizadas de dinoflagelados peridinióides, em especial entre os do numeroso grupo de espécies com poro apical, serão necessárias para clarificar as suas relações taxonómicas; e a produção de descrições melhoradas das características finas particulares das células serão um requisito para perceber a evolução dos caracteres dos peridinióides por forma a podermos identificar marcadores filogenéticos.

Diversity of Aeromonas species from different environments in Portugal

Espécies de Aeromonas encontram-se distribuídas por diferentes habitats, estando especialmente relacionadas com ambientes aquáticos. O seu papel em complicações na saúde humana e animal é reconhecido. De facto, não só pelo seu potencial de virulência, mas também pelos determinantes genéticos de resistência a antibióticos que possam conter, estes organismos constituem uma preocupação na medicina humana e veterinária. Assim, é essencial o estudo da diversidade de espécies de Aeromonas bem como explorar as suas características fenotípicas e genéticas que podem conduzir a impactos negativos. A água constitui um importante veículo de transmissão de microrganismos e espécies de Aeromonas estão amplamente distribuídas em águas tratadas e não tratadas. Em Portugal é ainda comum o consumo de águas não tratadas cuja qualidade, na maioria das vezes, não é sujeita a monitorização, como acontece por exemplo, em explorações agrícolas de gestão familiar. Neste estudo, investigou-se a presença de Aeromonas em águas não tratadas para consumo. Estabeleceu-se também uma linha horizontal de colheitas de diferentes amostras de origem agrícola com o intuito de avaliar a possibilidade de a água ser uma das vias de contaminação de culturas agrícolas e animais por espécies de Aeromonas. Obtiveram-se 483 isolados que foram discriminados por RAPD-PCR. 169 estirpes distintas foram identificadas ao nível da espécie por análise filogenética baseada no gene gyrB. Verificou-se uma frequente ocorrência bem como uma diversidade considerável de espécies de Aeromonas. Em alguns casos, as relações genotípicas entre isolados de diferentes amostras eram muito próximas. Adicionalmente, a maioria das amostras continha diferentes espécies e estirpes distintas da mesma espécie. A. media e A. hydrophila foram as espécies mais ocorrentes. Um grupo de isolados apresentou variantes moleculares de gyrB diferente das conhecidas até agora, o que indica que poderão constituir espécies não descritas. O perfil de susceptibilidade da colecção de Aeromonas a diferentes antibióticos foi estabelecido, constituindo um perfil típico do género, com algumas excepções. Estirpes multirresistentes foram encontradas. A presença de genes tet e bla foi investigada por estudos de PCR, hibridação e, em alguns casos, de sequenciação. Como era esperado, cphA/imiS foi o mais detectado. A detecção de integrões fez-se por PCR e hibridação e a sua caracterização foi feita por sequenciação de DNA; a sua ocorrência foi reduzida. A maioria das estirpes sintetizou enzimas extracelulares com actividade lipolítica e proteolítica que potencialmente contribuem para virulência. A análise por PCR e hibridação permitiram a detecção de vários determinantes genéticos que codificam moléculas possivelmente envolvidas em processos patogénicos. Diversas espécies de Aeromonas apresentando características relacionadas com resistência a antibióticos e potencialmente de virulência estão frequentemente presentes em produtos para consumo humano e animal em Portugal. ABSTRACT: Aeromonas spp. are present in a wide range of ecological niches, being mainly related to aquatic environments. Their role in human and animal health complications is recognised. In fact, not only for their putative virulence but also for the antibiotic resistance genetic determinants Aeromonas may harbour, these organisms constitute an issue of concern in human and veterinary medicine. Thus, it is essential to get knowledge on Aeromonas sp. diversity and on their genotypic and phenotypic characteristics that may lead to negative impacts. Water constitutes a good contamination route for microorganisms and Aeromonas are widespread in untreated and treated waters from different sources. In Portugal there is still an extensive use of untreated water which is not regularly monitored for quality. This is often the case in family smallholding farms. In this study untreated drinking and mineral waters were assessed for their content in Aeromonas spp. Furthermore, a sampling scheme was designed to investigate the occurrence and diversity of Aeromonas sp. in different agricultural correlated sources and to assess the possibility of water being the transmission vehicle between those sources. 483 isolates were obtained and discriminated by RAPD-PCR. Identification at the species level for 169 distinct strains was done by gyrB based phylogenetic analysis. Results demonstrated the frequent occurrence and considerable diversity of Aeromonas spp. In some cases, genotypic close relations were found between isolates from different sources. Also, most samples contained different species and distinct strains of the same species. A. media and A. hydrophila were the most occurring. A group of isolates displayed gyrB gene sequences distinct from the previously known, indicating that they may constitute representatives of non-described species. The antibiotic susceptibility profile of the aeromonads collection was established and constituted a typical profile of the genus, although few exceptions. Multiresistance patterns were found. The presence of tet and bla genes was investigated by PCR, hybridisation and, in some cases, sequencing analysis. As expected, cphA/imiS was the most detected. Integrons were screened by PCR and hybridisation and characterised by DNA sequencing; low occurrence was recorded. The bulk of strains was able to produce extracellular enzymes with lipolytic and proteolytic activities, which may contribute to virulence. PCR and hybridisation surveys allowed the detection of distinct genetic determinants coding for molecules putatively involved in pathogenic processes. Diverse Aeromonas sp. presenting distinct antibiotic resistance features and putative virulence traits are frequently present in many sources for human and animal consumption in Portugal.

Clubes de ciências e o percurso escolar dos alunos

Os factores que levam os alunos, no final da escolaridade obrigatória, a escolher o seu percurso escolar são vários. Neste estudo procurou-se saber em que medida a frequência de Clubes na área das Ciências influenciam essa decisão e, ainda, estudar como potenciar a sua organização no sentido de que estes possam contribuir positivamente para as escolhas dos alunos por percursos escolares na área das Ciências. A investigação decorreu em duas fases. Na primeira fase, foi avaliada a influência dos Clubes de Ciências na decisão do percurso escolar dos alunos, no final da escolaridade básica. Nesta fase foram realizados os seguintes procedimentos: -Entrevista semi-estruturada realizada a sete professoras responsáveis de Clubes na área das Ciências Físicas e Naturais, de 7 Escolas Secundárias da região de Aveiro. -Administração de um questionário, construído com questões maioritariamente fechadas, a uma amostra de 106 alunos, do 10ºAno, provenientes de 11 Escolas Secundárias da região de Aveiro, que frequentaram Clubes na área das Ciências Físicas e Naturais, no 3º Ciclo. -Tratamento estatístico das questões do questionário, com recurso ao programa SPSS (Statistical Package for the Social Science) e análise de conteúdo das questões abertas do questionário e das entrevistas, recorrendose para o efeito à construção de categorias de resposta. Na segunda fase concebeu-se e implementou-se um Clube de Ciências. Nesta fase surgiu a criação do Clube: ”Educação para o Desenvolvimento Sustentável”, no qual foi desenvolvido o projecto: “Construção e dinamização de uma Estação Meteorológica”, numa Escola Básica do 2º e 3º Ciclos do Concelho de Aveiro. Os resultados obtidos na primeira fase do estudo são reveladores da importância que é atribuída às experiências vivenciadas pelos alunos nos Clubes de Ciências que frequentaram. Os temas/assuntos abordados foram essencialmente conteúdos ligados a áreas do conhecimento das disciplinas de Ciências. Predominaram as estratégias com base em trabalho de projecto e em actividades experimentais. Indicadores nacionais e internacionais têm evidenciado um decréscimo no número de jovens que, na sua escolaridade, optam por estudos nas áreas das Ciências e da Tecnologia. Este decréscimo tem sido um factor de preocupação ao nível das políticas educativas, nomeadamente europeias, tornando-se urgente, por um lado, compreender o porquê desse facto e, por outro, encontrar formas de o minimizar. Os Clubes na perspectiva das responsáveis entrevistadas: (a) Surgem como uma oportunidade para melhorar as competências dos alunos ao nível do saber fazer; (b) Permitem confirmar e reforçar a motivação e o gosto pelas Ciências; (c) Podem, também, dar-lhes orientações para o futuro, embora esta não tenha sido uma preocupação explícita; (d) São do agrado dos alunos devido a apresentarem actividades não meramente académicas e formais. Os Clubes, na perspectiva dos alunos respondentes: (a) Aumentaram a motivação para estudar Ciências; (b) Permitiram relacionar as Ciências com o dia-a-dia; (c) Ajudaram na escolha do curso que frequentam no Ensino Secundário; (d) Contribuíram para querer exercer uma profissão na área das Ciências. Na segunda fase do estudo, foi desenvolvido um trabalho de projecto que envolveu alunos do 3º Ciclo. O tema do projecto, proposto e implementado, coincidiu com os dois temas menos abordados, nos Clubes frequentados pelos respondentes da primeira fase do estudo, Meteorologia e Temáticas com Impacto Social. Por outro lado o Clube pretendeu contribuir para a Década da Educação para o Desenvolvimento Sustentado, instituída pelas Nações Unidas, para fazer frente à actual situação de emergência planetária. Uma estratégia privilegiada para formar cidadãos capazes de assumir atitudes e valores com vista ao desenvolvimento sustentável, passa pela Educação em todas as suas vertentes, nomeadamente a do ensino não formal, na qual se incluem os Clubes de Ciências. ABSTRACT: National and international indicators have showed a decrease in the number of youngsters that, during their school course make their choices in the study areas of Science and Technology. This decreasing tendency has been a motive of concern as far as the European educational policies are concerned. Thus, it is urgent to understand the reason behind that situation and find ways to minimize it. There are various factors that make students choose their study areas in the end of their school course. This study aimed to find out how the Science Clubs can influence their decisions as well as to study new ways to improve their organization in such a way that they may contribute positively to the students’ choices of their school careers in the area of Science. The investigation was divided in two parts: in the first part, it was evaluated the level of the influence of the Science Clubs in the students’ school careers at the end of the elementary education. At this stage it was adopted the following procedure: -A semi-structured interview was applied to 7 female teachers that are responsible for the Natural and Physics Science Clubs, in secondary schools, in the region of Aveiro; -A mainly close-question questionnaire was applied to a sample of 106 students, in the 10th grade, in 11 secondary schools, in the region of Aveiro. These students have attended some Natural and Physics Science Clubs, during the 7th, 8th and 9th grades; -Statistical work of the questionnaire was done with the help of the SPSS programme (Statistical Package for the Social Science) as well as the analysis of the contents of the open-questions of the questionnaire and the interviews by means of the answer-category method. In the second part, a Science Club was planned and implemented. At this stage, a club was created - “Education for the Sustainable Development” - within which the following project was developed – “Building and Development of a Meteorological Observatory”, at a 2nd and 3rd Ciclos (Stages) Elementary School, in Aveiro. The results of the first part of this study case have showed clearly the importance given to the experiences of the students while attending the Science Clubs. The themes/subjects studied were mainly science knowledgerelated contents. The strategies adopted were based on project work and experimental activities. A view of the Clubs by the people who are responsible for them: (a)The Clubs mean an opportunity for students to learn the know-how process; (b)They have provided the reinforcement of the motivation and preference for Science; (c)Although it was not the main concern with the clubs, the truth is that they can also give the students a sense of awareness for the future; (d)Students like to make part of the clubs because of their experimental character. A view of the Clubs by the students who make part of them: (a)The clubs have increased the level of motivation to study Science; (b)They have allowed a close perspective of the daily life reality; (c)They have helped with the choice of the Secondary School courses; (d)They have made students want a future professional career in the area of Science. In the second part of this study case, a project work was carried out involving 7th, 8th and 9th grade students. The subject of the project, considered and implemented, coincided with the two less boarded subjects, in the Clubs attended a course for the respondents of the first phase of the study, Meteorology and Thematic with Social Impact. The Club also aimed to contribute to the decade of the “Education for the Sustained Future” as settled by the United Nations in order to face the present emergency situation of the planet. The last but not the least, it is believed that, the best strategy to teach future citizens who are able to take the responsibility of their values and attitudes towards a sustainable future, is to provide them a type of Education that can teach them both the formal curriculum aspects and the informal ones, as it is the case of the Science Clubs.

O desenvolvimento do raciocínio dedutivo ao nível do ensino secundário : recurso a geometrias planas

Este trabalho, no âmbito da Didáctica da Matemática, foca-se no estudo de abordagens alternativas de ensino e aprendizagem da Geometria Euclidiana, no Ensino Secundário, no sentido de promover níveis estruturados do pensamento matemático. Em particular, as potencialidades do recurso a outros modelos de Geometria Plana (e.g. Geometria Hiperbólica, Geometria do Motorista de Táxi) em relação a este problema serão investigadas. A opção pelo Ensino Secundário deve-se ao facto de se tratar de um nível de ensino onde se regista uma elevada taxa de insucesso escolar (especialmente no 10º ano) e onde é notório o abismo existente, entre o ensino Secundário e Universitário, no âmbito do raciocínio lógico - dedutivo. O trabalho a desenvolver pretende aprofundar o estudo de questões ligadas à natureza do conhecimento envolvido que estarão na base de decisões, tais como: Quais os processos que vão ser ensinados? Que processos queremos que os alunos dominem? E, por outro lado, ter em conta que se pretende desenvolver capacidades de ordem superior, significando que o ensino da Matemática deve dirigir-se para níveis elevados de pensamento, tais como: resolução de problemas; comunicar matematicamente; raciocínio e demonstração. No currículo de matemática para o Ensino Básico e Secundário tem-se negligenciado a demonstração matemática, contribuindo para que exista uma desconformidade entre os graus de ensino, secundário e universitário. Muitas vezes as abordagens de ensino centram-se na verificação de resultados e desvalorizam a exploração e explicação (Villiers, 1998). Actualmente, assiste-se a uma tendência para retomar o raciocínio lógico - dedutivo. O principal objectivo desta investigação é analisar ambientes de aprendizagem em que os alunos sejam solicitados a resolver problemas de prova em contextos diversificados e, de uma forma mais geral promover o desenvolvimento do raciocínio dedutivo e uma visão mais alargada do conhecimento matemático. Em particular, a abordagem de problemas de prova num contexto de geometria não Euclidiana, com recurso a artefactos e a software de geometria dinâmica, será investigada.