Analysis of the organic matter associated to sea salt : definition of potential molecular markers based on the volatile composition and presence of glycosidic derivatives and polysaccharides

Sea salt is a natural product obtained from the evaporation of seawater in saltpans due to the combined effect of wind and sunlight. Nowadays, there is a growing interest for protection and re-valorisation of saltpans intrinsically associated to the quality of sea salt that can be evaluated by its physico-chemical properties. These man-made systems can be located in different geographical areas presenting different environmental surroundings. During the crystallization process, organic compounds coming from these surroundings can be incorporated into sea salt crystals, influencing their final composition. The organic matter associated to sea salt arises from three main sources: algae, surrounding bacterial community, and anthropogenic activity. Based on the hypothesis that sea salt contains associated organic compounds that can be used as markers of the product, including saltpans surrounding environment, the aim of this PhD thesis was to identify these compounds. With this purpose, this work comprised: 1) a deep characterisation of the volatile composition of sea salt by headspace solid phase microextraction combined with comprehensive two-dimensional gas chromatography time-of-flight mass spectrometry (HS-SPME/GCGC–ToFMS) methodology, in search of potential sea salt volatile markers; 2) the development of a methodology to isolate the polymeric material potentially present in sea salt, in amounts that allow its characterisation in terms of polysaccharides and protein; and 3) to explore the possible presence of triacylglycerides. The high chromatographic resolution and sensitivity of GC×GC–ToFMS enabled the separation and identification of a higher number of volatile compounds from sea salt, about three folds, compared to unidimentional chromatography (GC–qMS). The chromatographic contour plots obtained revealed the complexity of marine salt volatile composition and confirmed the relevance of GC×GC–ToFMS for this type of analysis. The structured bidimentional chromatographic profile arising from 1D volatility and 2D polarity was demonstrated, allowing more reliable identifications. Results obtained for analysis of salt from two locations in Aveiro and harvested over three years suggest the loss of volatile compounds along the time of storage of the salt. From Atlantic Ocean salts of seven different geographical origins, all produced in 2007, it was possible to identify a sub-set of ten compounds present in all salts, namely 6-methyl-5-hepten-2-one, 2,2,6-trimethylcyclohexanone, isophorone, ketoisophorone, β-ionone-5,6-epoxide, dihydroactinidiolide, 6,10,14-trimethyl-2-pentadecanone, 3-hydroxy-2,4,4-trimethylpentyl 2-methylpropanoate, 2,4,4-trimethylpentane-1,3-diyl bis(2-methylpropanoate), and 2-ethyl-1-hexanol. These ten compounds were considered potential volatile markers of sea salt. Seven of these compounds are carotenoid-derived compounds, and the other three may result from the integration of compounds from anthropogenic activity as metabolites of marine organisms. The present PhD work also allowed the isolation and characterisation, for the first time, of polymeric material from sea salt, using 16 Atlantic Ocean salts. A dialysis-based methodology was developed to isolate the polymeric material from sea salt in amounts that allowed its characterisation. The median content of polymeric material isolated from the 16 salts was 144 mg per kg of salt, e.g. 0.014% (w/w). Mid-infrared spectroscopy and thermogravimetry revealed the main occurrence of sulfated polysaccharides, as well as the presence of protein in the polymeric material from sea salt. Sea salt polysaccharides were found to be rich in uronic acid residues (21 mol%), glucose (18), galactose (16), and fucose (13). Sulfate content represented a median of 45 mol%, being the median content of sulfated polysaccharides 461 mg/g of polymeric material, which accounted for 66 mg/kg of dry salt. Glycosidic linkage composition indicates that the main sugar residues that could carry one or more sulfate groups were identified as fucose and galactose. This fact allowed to infer that the polysaccharides from sea salt arise mainly from algae, due to their abundance and composition. The amino acid profile of the polymeric material from the 16 Atlantic Ocean salts showed as main residues, as medians, alanine (25 mol%), leucine (14), and valine (14), which are hydrophobic, being the median protein content 35 mg/g, i.e. 4,9 mg per kg of dry salt. Beside the occurrence of hydrophobic volatile compounds in sea salt, hydrophobic non-volatile compounds were also detected. Triacylglycerides were obtained from sea salt by soxhlet extraction with n-hexane. Fatty acid composition revealed palmitic acid as the major residue (43 mol%), followed by stearic (13), linolenic (13), oleic (12), and linoleic (9). Sea salt triacylglycerides median content was 1.5 mg per kg of dry salt. Both protein and triacylglycerides seem to arise from macro and microalgae, phytoplankton and cyanobacteria, due to their abundance and composition. Despite the variability resulting from saltpans surrounding environment, this PhD thesis allowed the identification of a sea salt characteristic organic compounds profile based on volatile compounds, polysaccharides, protein, and triacylglycerides.

O sal marinho é um produto natural que deriva da evaporação da água do mar nas salinas pela ação do vento e da luz solar. Atualmente existe um interesse crescente na proteção e revalorização das salinas, o que está intrinsecamente associado à qualidade do sal, que pode ser avaliada pelas suas características físico-químicas. Estes sistemas construídos pelo homem podem encontrar-se em diferentes áreas geográficas, apresentando diferentes envolventes ambientais. Durante o processo de cristalização, compostos orgânicos provenientes da envolvente ambiental podem ficar incorporados nos cristais de sal, influenciando a sua composição. A matéria orgânica associada ao sal marinho é proveniente de três principais origens: algas, comunidade bacteriana envolvente e atividade antropogénica. Com base na hipótese de que o sal marinho contém compostos orgânicos associados que podem ser utilizados como marcadores do próprio sal marinho, incluindo as condições ambientais envolventes das salinas, o objetivo desta tese de doutoramento foi identificar estes compostos no sal. Para tal, procedeu-se a: 1) uma caracterização detalhada da composição volátil do sal marinho por microextração em fase sólida do espaço de cabeça combinada com cromatografia em fase gasosa bidimensional abrangente acoplada à espectrometria de massa por tempo de voo (HS-SPME/GCGC–ToFMS), proporcionando a identificação de potenciais marcadores voláteis; 2) ao desenvolvimento de uma metodologia que permitisse isolar material polimérico potencialmente presente no sal marinho, em quantidades suficientes para a sua caracterização em termos de polissacarídeos e proteína; e 3) à exploração da possível presença de triacilglicerídeos. A elevada resolução cromatográfica e sensibilidade da GC×GC–ToFMS possibilitou a separação e identificação de um maior número de compostos voláteis do sal marinho, cerca do triplo, em comparação com a cromatografia unidimensional (GC–qMS). Os cromatogramas bidimensionais revelaram a presença de 165 compostos, pertencentes a 11 famílias químicas, o que mostra a complexidade da composição volátil do sal marinho. O perfil cromatográfico em duas dimensões, resultante da separação por volatilidade em 1D e por polaridade em 2D, permite a dispersão dos compostos no espaço cromatográfico bidimensional em que os compostos estruturalmente similares ocupam o mesmo espaço cromatográfico (cromatograma estruturado), o que permitiu maior fiabilidade nas identificações de acordo os tempos de retenção (1tR e 2tR) e espetro de massa. Os resultados da análise de sal proveniente de dois locais do salgado de Aveiro, recolhido ao longo de três anos, sugerem a perda de compostos voláteis ao longo do tempo de armazenamento do sal. A partir de sais do Oceano Atlântico provenientes de sete origens geográficas, todos produzidos em 2007, foi possível identificar um conjunto de dez compostos presentes em todos os sais, nomeadamente: 6-metil-5-hepteno-2-ona, 2,2,6-trimetil-ciclo-hexanona, isoforona, cetoisoforona, 5,6-epóxi-β-ionona, di-hidroactinidiolida, 6,10,14-trimetil-2-pentadecanona, 2-metilpropanoato de 3-hidroxi-2,4,4-trimetilpentilo, bis(2-metilpropanoato) de 2,4,4-trimetilpentano-1,3-diilo e 2-etil-1-hexanol. Estes dez compostos foram considerados como potenciais marcadores voláteis do sal marinho. Sete destes compostos são derivados dos carotenoides e os restantes três poderão resultar da integração de compostos provenientes da atividade antropogénica no metabolismo dos organismos marinhos. Com o presente trabalho foi isolado e caracterizado, pela primeira vez, o material polimérico presente no sal marinho. Foram usados 16 sais do Oceano Atlântico. Foi desenvolvida uma metodologia baseada num processo de diálise, que permitiu isolar material polimérico a partir de sal marinho em quantidades suficientes que permitissem a sua caracterização. O conteúdo de material polimérico isolado a partir dos 16 sais foi, em mediana, 144 mg por kg de sal seco, i.e. 0,014% (m/m). A espetroscopia de infravermelho médio e a termogravimetria revelaram a presença maioritária de polissacarídeos sulfatados no material polimérico do sal marinho e também a presença de proteína. Os polissacarídeos do sal marinho mostraram ser ricos em resíduos de ácido urónico (21 mol%), glucose (18), galactose (15) e fucose (13). O conteúdo em sulfato representou, em mediana, 45 mol%, sendo a mediana do conteúdo em polissacarídeos sulfatados de 461 mg/g de material polimérico, o que representa 66 mg/kg de sal seco. As ligações glicosídicas encontradas indicaram que os resíduos de açúcares maioritários que poderiam conter um ou mais grupos sulfato eram a fucose e a galactose. Este facto leva a propor que os polissacarídeos do sal marinho tenham origem principalmente em algas, tendo em conta a sua composição e abundância. O perfil em aminoácidos do material polimérico dos 16 sais em estudo revelou como resíduos maioritários, em mediana, a alanina (25 mol%), a leucina (14) e a valina (14), que têm em comum a sua hidrofobicidade, sendo a mediana do conteúdo em proteína de 35 mg/g, i.e. 4,9 mg por kg de sal seco. Para além da fração hidrofóbica volátil, também foram detetados compostos hidrofóbicos não voláteis no sal marinho. Foram isolados triacilglicerídeos por extração com soxhlet, usando n-hexano. A composição em resíduos de ácidos gordos revelou como ácido maioritário o ácido palmítico (43 mol%), seguido do esteárico (13), linolénico (13), oleico (12) e linoleico (9). O conteúdo, em mediana, de triacilglicerídeos foi de 1,5 mg por kg de sal seco. Dada a sua composição e abundância, tanto a proteína como os triacilglicerídeos parecem ter origem em macro e microalgas, fitoplacton e cianobactérias. Apesar da variabilidade resultante do ambiente envolvente das salinas, a presente tese de doutoramento permitiu identificar um perfil em compostos orgânicos característico do sal marinho com base nos compostos voláteis, polissacarídeos, proteína e triacilglicerídeos.