Acrylic bone cements modified with bioactive and biodegradable fillers

O cimento ósseo acrílico é o único material utilizado para a fixação de próteses em cirurgias ortopédicas, surgindo como uma alternativa às técnicas não cimentadas. Cerca de um milhão de pacientes são anualmente tratados para a substituição total da articulação do quadril e do joelho. Com a maior expectativa de vida da população e o aumento do número de cirurgias realizadas por ano espera-se que o uso do cimento ósseo aumente substancialmente. A fraca ligação do cimento ao osso é um problema comum que pode causar perda asséptica da prótese. Assim, torna-se necessário investir no desenvolvimento de cimentos ósseos alternativos que permitam promover maior estabilidade e melhor desempenho do implante. O principal objetivo desta tese foi desenvolver um cimento ósseo bioativo, capaz de ligar-se ao osso, com propriedades melhoradas relativamente aos sistemas convencionais. A preparação dos materiais foi realizada por dois processos diferentes, a polimerização por via térmica e a polimerização por via química. Inicialmente, utilizando o processo térmico, foram desenvolvidos compósitos de PMMA-co-EHA reforçados com vidro de sílica (CSi) e vidro de boro (CB) e comparados em termos do seu comportamento in vitro em meio acelular e celular. A formação de precipitados de fosfato de cálcio foi observada sobre a superfície de todos os compósitos indicando que estes materiais são potencialmente bioativos. Em relação à avaliação biológica o CSi demonstrou um efeito indutor da proliferação das células. As células apresentaram uma morfologia normal e alta taxa de crescimento quando comparadas com o padrão de cultura. Por outro lado ocorreu inibição da proliferação celular para o CB provavelmente devido à sua elevada taxa de degradação, levando a uma elevada concentraçao de iões de B e de Mg no meio de cultura. O efeito do vidro nos cimentos curados por via química, incorporando um activador de baixa toxicidade, também foi avaliado. Os resultados sugerem que as novas formulações podem diminuir o efeito exotérmico na cura do cimento e melhorar as propriedades mecânicas (flexão e compressão). Outro estudo conduzido neste trabalho explorou a possibilidade de incorporar ibuprofeno (fármaco anti-inflamatório) no cimento, dando origem a um material capaz de ser simultaneamente, bioativo e promotor da libertação controlada de fármacos. Neste contexto foi evidenciado que o desempenho do cimento desenvolvido pode contribuir para minimizar o processo inflamatório associado a uma cirurgia ortopédica. Finalmente, a fase sólida do cimento ósseo bioativo foi modificada por diferentes polímeros biodegradáveis. A adição deste enchimento deu origem a um cimento parcialmente biodegradável que pode permitir a formação de poros e o crescimento ósseo para o interior do cimento, resultando numa melhor fixação da prótese.

Characterization of bioactive compounds of dealcoholized wine: valuation of distillation process

O vinho tinto é uma importante fonte de compostos fenólicos com atividade antioxidante e que estão relacionados com a prevenção de doenças cardiovasculares e cancro. Estes compostos são um sub-produto do processo de destilação vínica utilizado para produzir aguardente necessária para a produção de Vinho do Porto. Esta tese tem como objetivo valorizar os compostos fenólicos resultantes das destilarias de vinho, através do estudo da sua composição, das interações com o material polimérico do vinho, da sua estabilidade durante o armazenamento e avaliação dos seus potenciais efeitos biológicos in vitro. Isto irá permitir definir aplicações para estes compostos como ingredientes alimentares com propriedades funcionais. Dois vinhos tintos (RW1 e RW2) foram utilizados como fonte de compostos fenólicos. A fim de estudar estes compostos, cada vinho foi evaporado à pressão atmosférica, permitindo obter o respetivo vinho desalcolizado (DW1 e DW2). Os polissacarídeos e compostos fenólicos presentes nos vinhos desalcolizados foram fracionados por extração em fase sólida utilizando cartuchos C18 sep-pak. A fração hidrofóbica, rica em compostos fenólicos, foi separada em frações ricas em ácidos fenólicos, em procianidinas e em antocianinas, as quais foram usadas para avaliar a sua contribuição para a atividade antioxidante total e caracterização fenólica detalhada dos DW. Foram obtidas quantidades comparáveis de compostos fenólicos totais (1.3 g/L para RW1 e DW1, e 3.1 para RW2 e DW2), de taninos (1.2 g/L para RW1 e DW1 e 1.6 para RW2 e DW2) e de antocianinas (0.24 g/L para RW1 e DW1 e 0.41 para RW2 e DW2) para os vinhos e para os respetivos vinhos desalcolizados. A determinação da atividade antioxidante de RW e DW pelos métodos do DPPH e ABTS também originou valores semelhantes, permitindo inferir que o processo de destilação realizado não promoveu uma perda relevante de compostos fenólicos. A atividade antioxidante total de vinho deveu-se essencialmente à fração rica em antocianinas. Os dois DW foram dialisados para se obter o material polimérico dos vinhos (WPM1 e WPM2). O WPM1 e WPM2 apresentavam 1.1 e 1.3 g/L de material sólido, respetivamente. O WPM (WPM1 e WPM2) era composto por polissacarídeos (31 e 36%), proteínas (10 e 12%) e também por compostos fenólicos (32 e 43%). A análise de açúcares mostrou que as manoproteínas e as arabinogalactanas eram os principais polissacarídeos presentes. A extração do WPM com metanol deu origem a um material insolúvel em metanol (PMi) e a uma fração solúvel em metanol, que continuava a conter hidratos de carbono e compostos fenólicos, mostrando uma forte interação entre estes compostos. Para determinar a energia de ativação (Ea) da libertação dos compostos fenólicos de fracções de material polimérico do vinho, foram realizadas diálises do DW, WPM e PMi, utilizando-se quatro concentrações diferentes, a cinco temperaturas (5-40 °C). O valor da Ea foi 25 para o WPM e 61 kJ/mol para o PMi, mostrando que os compostos fenólicos do vinho podem estar associados de forma diferente à matriz polimérica e que uma fração pode estar, ainda, fortemente associada a esta matriz. A fim de avaliar a possível existência de interações seletivas com os compostos fenólicos, o WPM foi fracionado, permitindo a obtenção de uma fração rica em manoproteínas (MP), através de uma cromatografia de afinidade com concanavalina A e 3 frações ricas em arabinogalactanas (AG0, AG1 e AG2) obtidas por cromatografia de troca aniónica. Foi avaliada a difusão de nove antocianinas monoméricas através de uma membrana de diálise, em presença do WPM, e das frações ricas em MP e em AG. A diálise dos compostos fenólicos livres do vinho foi realizada como ensaio em branco. Todas as frações poliméricas mostraram capacidade para reter as antocianinas, embora em diferente extensão. Foi observada uma capacidade de retenção maior para as antocianinas acilglucosiladas do que para as antocianinas glucosiladas. A fração rica em AG teve uma maior contribuição para a capacidade de retenção das antocianinas pelo material polimérico vinho do que a fração rica em MP, principalmente quando as antocianinas estavam acetiladas. Com o objetivo de estudar formas para preservar, a longo prazo, as propriedades antioxidantes dos compostos fenólicos, o extrato de compostos fenólicos (PCE), em pó, foi armazenado em diferentes condições de luz e atmosfera, à temperatura ambiente durante 1 ano. Observou-se que o PCE armazenado no escuro, dentro de um exsicador sob atmosfera de azoto, preservou 95% da atividade antioxidante inicial. Também foram avaliadas as melhores condições para preservar as antocianinas quando em solução, armazenadas a duas temperaturas (5 e 30 ºC) durante 3 meses. A adição de 0.5 g/L de uma fração rica em polissacarídeos a um vinho armazenado a 30 ºC promoveu a proteção das antocianinas, especialmente das antocianinas cumaroiladas. Os potenciais efeitos biológicos dos compostos fenólicos foram avaliados em diferentes sistemas celulares in vitro utilizando as seguintes frações: WPM, WPS (polissacarídeos do vinho), WPC (compostos fenólicos do vinho), PA-E (fração rica em ácidos fenólicos), PR-E (fração rica em procianidinas) e APP-E (fração rica em antocianinas e procianidinas poliméricas). Foi observada uma maior viabilidade celular quando as células do carcinoma do cólon HT-29 foram expostas a dois agentes oxidantes (radiação UV e H2O2) em presença das frações PR-E e APP-E. Além disso, os extratos WPS, WPC, PR-E e APP-E mostraram propriedades anti-inflamatórias, avaliadas pela inibição da produção de NO por células de macrófagos RAW264.7, sendo o extrato APP-E (0.19 mg/mL) o que exibiu a maior capacidade anti-inflamatória. A fim de elucidar as propriedades antioxidantes dos extratos do vinho em células humanas, os glóbulos vermelhos (RBC) foram selecionados como um modelo metabolicamente simples. Os extratos WPM, WPS, WPC, PR-E, e APP-E mostraram efeito anti-hemolítico para a hemólise dos RBC provocada pelo peróxido de hidrogénio (H2O2) e pelo di-hidrocloreto de 2,2'-azo-bis(2-diaminopropano) (AAPH). Os resultados obtidos permitem concluir que o processo de desalcoolização dos vinhos à pressão atmosférica, preservou as principais características antioxidantes dos compostos fenólicos. Estes compostos podem contribuir para a defesa das células contra agentes oxidantes, nomeadamente por terem um potencial de atividades anti-inflamatória e anti-hemolítica, promovendo a viabilidade celular. A interação dos compostos fenólicos do vinho com o material polimérico permite inferir uma dosagem contínua e gradual das antocianinas vinho tinto após a sua ingestão, contribuindo para um período mais longo da sua exposição e, como consequência, dos seus potenciais benefícios para a saúde.

Alkali-free bioactive glasses for bone regeneration

Bioactive glasses and glass-ceramics are a class of third generation biomaterials which elicit a special response on their surface when in contact with biological fluids, leading to strong bonding to living tissues. The purpose of the present study was to develop diopside based alkali-free bioactive glasses in order to achieve good sintering behaviour, high bioactivity, and a dissolution/ degradation rates compatible with the target applications in bone regeneration and tissue engineering. Another aim was to understand the structure-property relationships in the investigated bioactive glasses. In this quest, various glass compositions within the Diopside (CaMgSi2O6) – Fluorapatite (Ca5(PO4)3F) – Tricalcium phosphate (3CaO•P2O5) system have been investigated. All the glasses were prepared by melt-quenching technique and characterized by a wide array of complementary characterization techniques. The glass-ceramics were produced by sintering of glass powders compacts followed by a suitable heat treatment to promote the nucleation and crystallization phenomena. Furthermore, selected parent glass compositions were doped with several functional ions and an attempt to understand their effects on the glass structure, sintering ability and on the in vitro bio-degradation and biomineralization behaviours of the glasses was made. The effects of the same variables on the devitrification (nucleation and crystallization) behaviour of glasses to form bioactive glass-ceramics were also investigated. Some of the glasses exhibited high bio-mineralization rates, expressed by the formation of a surface hydroxyapatite layer within 1–12 h of immersion in a simulated body fluid (SBF) solution. All the glasses showed relatively lower degradation rates in comparison to that of 45S5 Bioglass®. Some of the glasses showed very good in vitro behaviour and the glasses co-doped with zinc and strontium showed an in vitro dose dependent behaviour. The as-designed bioactive glasses and glass–ceramic materials are excellent candidates for applications in bone regeneration and for the fabrication of scaffolds for tissue engineering.

Diopside-fluorapatite-wollastonite based bioactive glasses and glass-ceramics

Bioactive glasses and glass–ceramics are a class of biomaterials which elicit special response on their surface when in contact with biological fluids, leading to strong bonding to living tissue. This particular trait along with good sintering ability and high mechanical strength make them ideal materials for scaffold fabrication. The work presented in this thesis is directed towards understanding the composition-structure-property relationships in potentially bioactive glasses designed in CaOMgOP2O5SiO2F system, in some cases with added Na2O. The main emphasis has been on unearthing the influence of glass composition on molecular structure, sintering ability and bioactivity of phosphosilicate glasses. The parent glass compositions have been designed in the primary crystallization field of the pseudo-ternary system of diopside (CaO•MgO•2SiO2) – fluorapatite (9CaO•3P2O5•CaF2) – wollastonite (CaO•SiO2), followed by studying the impact of compositional variations on the structure-property relationships and sintering ability of these glasses. All the glasses investigated in this work have been synthesized via melt-quenching route and have been characterized for their molecular structure, sintering ability, chemical degradation and bioactivity using wide array of experimental tools and techniques. It has been shown that in all investigated glass compositions the silicate network was mainly dominated by Q2 units while phosphate in all the glasses was found to be coordinated in orthophosphate environment. The glass compositions designed in alkali-free region of diopside – fluorapatite system demonstrated excellent sintering ability and good bioactivity in order to qualify them as potential materials for scaffold fabrication while alkali-rich bioactive glasses not only hinder the densification during sintering but also induce cytotoxicity in vitro, thus, are not ideal candidates for in vitro tissue engineering. One of our bioglass compositions with low sodium content has been tested successfully both in vivo and in preliminary clinical trials. But this work needs to be continued and deepened. The dispersing of fine glass particles in aqueous media or in other suitable solvents, and the study of the most important factors that affect the rheology of the suspensions are essential steps to enable the manufacture of porous structures with tailor-made hierarchical pores by advanced processing techniques such as Robocasting.

Upgrading of suberin from cork and birch outer bark

O trabalho aqui apresentado teve como principal propósito o estudo do potencial da suberina como fonte de produtos de química fina e como precursor de novos materiais macromoleculares de origem renovável. O interesse na suberina reside, não só na sua ubiquidade e nas suas propriedades únicas em termos de composição química e hidrofobicidade, mas também no facto de ser um dos principais componentes macromoleculares dos subprodutos da indústria corticeira de Quercus suber L. no Sul da Europa, e da indústria de pasta de papel do Norte da Europa, que utiliza a Betula pendula Roth como matéria-prima. A primeira parte do presente trabalho consistiu no estudo detalhado da composição química da cortiça de Quercus suber L. e respectivos resíduos industriais bem como da casca de Betula pendula Roth recorrendo a diferentes técnicas de caracterização, nomeadamente GC-MS, IV, RMN de 1H e de 13C, DSC, termomicroscopia, TGA e difracção de raios-X. Os resultados mostraram que os produtos de despolimerização da suberina representam tipicamente uma fracção substancial de todas as amostras. Para além da suberina, foram também identificados nas diversas amostras quantidades variáveis de compostos triterpénicos, lenhina, polissacarídeos e matéria inorgânica. Os principais resultados da análise por GC-MS mostraram que todas as amostras de suberina despolimerizada são fontes abundantes de ω-hidroxiácidos e de ácidos dicarboxílicos, bem como dos correspondentes derivados epóxidados. No entanto, as quantidades relativas de cada componente identificado foram significativamente diferentes entre amostras. Por exemplo, em amostras de suberina da casca de Quercus suber L. isoladas por metanólise alcalina o composto maioritário encontrado foi o ácido 22-hidroxidocosanóico, enquanto que a suberina também proveniente da cortiça, mas isolada por hidrólise alcalina era composta maioritariamente pelo ácido 9,10-dihidroxioctadecanóico. Já no caso da amostra de suberina despolimerizada proveniente da casca externa da bétula o composto identificado como mais abundante foi o ácido 9,10-epoxi-18-hidroxioctadecanóico. A caracterização das diversas amostras de suberina despolimerizada por FTIR e RMN de 1H e de 13C foram concordantes com os resultados de GC-MS, evidenciando a sua natureza predominantemente lipofílica. Foi ainda determinada a razão entre os grupos CO2H/OH e CO2CH3/OH por RMN de 1H das amostras convenientemente derivatizadas com isocianato de tricloroacetilo, verificando-se que a suberina despolimerizada possuía quantidades não-estequiométricas destes grupos funcionais. A investigação do comportamento térmico das amostras de suberina despolimerizada, por DSC e termomicroscopia, bem como a análise por difracção de raios-X, permitiu concluir que algumas amostras de suberina despolimerizada possuíam importantes domínios cristalinos e pontos de fusão bem definidos, tipicamente próximos de 70 oC, enquanto outras amostras eram essencialmente amorfa. Factores como a fonte de suberina ou as condições de despolimerização estiveram na origem destas diferenças. iv Neste trabalho estudaram-se também os extractáveis lipofílicos da cortiça e dos seus resíduos industriais, em particular os do pó industrial de cortiça e dos condensados negros, mostrando que os extractáveis lipofílicos são uma fonte abundante de compostos triterpénicos, em particular de ácido betulínico e de friedelina. Foram ainda identificadas fracções abundantes de ω-hidroxiácidos e de ácidos dicarboxílicos no condensado negro. A segunda parte deste trabalho abordou a síntese e a caracterização de novos poliésteres alifáticos derivados de suberina. Estes materiais foram sintetizados utilizando, quer misturas de suberina despolimerizada, quer monómeros modelo estruturalmente análogos aos existentes na suberina. Recorreu-se para o efeito a duas aproximações distintas de polimerização por passos, a policondensação e a politransesterificação. Procurou-se em simultâneo maximizar a eficiência da polimerização em termos de peso molecular e de extensão da reacção e utilizar condições de reacção de química “verdes”. Neste sentido, utilizou-se a policondensação em emulsão utilizando um tensioactivo como catalisador e a policondensação em massa utilizando a lipase B de Candida antarctica. Adicionalmente foram também testado os catalisadores trifluorometanosulfonato de bismuto(III) no caso da policondensação, e ainda os catalisadores clássicos óxido de antimónio(III) e o carbonato de potássio no caso da politransesterificação. Os poliésteres resultantes foram caracterizados através de várias técnicas, tais como IV, RMN (de 1H e de 13C), DSC, DMA, TGA, difracção de raios-X e medidas dos ângulos de contacto. Verificou-se que os catalisadores trifluorometanosulfonato de bismuto (III), óxido de antimónio(III) e carbonato de potássio conduziram aos rendimentos de isolamento dos polímeros resultantes mais elevados. No caso dos poliésteres derivados da suberina os resultados em termos de rendimentos e pesos moleculares sofreram um incremento substancial quando a estequiometria da reacção de polimerização foi adequadamente balanceada (r=1) com a adição de uma quantidade extra de um comonómero. Verificou-se a predominância de diferentes estruturas consoante a amostra de suberina utilizada e as condições de síntese adoptada, predominando as cadeias lineares ou então quantidades substanciais de estruturas reticuladas. Globalmente, este primeiro estudo sistemático da utilização de suberina como um precursor de novos poliésteres alifáticos confirmou o elevado potencial deste recurso abundante e renovável como precursor para preparar materiais macromoleculares.

Electrospun fibrous mats for skin and abdominal wall repair

Esta tese centra-se no desenvolvimento de materiais biodegradáveis e nãodegradáveis produzidos por eletrofiação com aplicação na área biomédica. O poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV), um poliéster biodegradável, foi selecionado como base dos materiais biodegradáveis, enquanto o poli(tereftalato de etileno) (PET), um polímero sintético, estável e biocompatível, foi selecionado para a produção das matrizes não degradáveis. Adicionou-se quitosana aos sistemas com o objetivo de melhorar o processo de eletrofiação e as propriedades morfológicas, físico-químicas e biológicas dos materiais resultantes. A composição química, bem como as características morfológicas e físicoquímicas dos materiais em estudo, foram manipuladas de modo a otimizar a sua performance como suportes celulares para engenharia de tecidos. Foram realizados estudos in vitro com cultura de fibroblastos L929 para avaliar o comportamento das células, i.e. viabilidade, adesão, proliferação e morte, quando cultivadas nas matrizes produzidas por eletrofiação. Adicionalmente foram realizados ensaios in vivo para investigar o potencial dos materiais em estudo na regeneração cutânea e como tela abdominal. Os principais resultados encontrados incluem: o desenvolvimento de novas matrizes híbridas (PHBV/quitosana) adequadas ao crescimento de fibroblastos e ao tratamento de lesões de pele; o desenvolvimento de um sistema de eletrofiação com duas seringas para a incorporação de compostos bioativos; diversas estratégias para manipulação das características morfológicas dos materiais de PHBV/quitosana e PET/quitosana produzidos por eletrofiação; uma melhoria do conhecimento das interações fibroblastos-suporte polimérico; a verificação de uma resposta inflamatória desencadeada pelos materiais nãodegradáveis quando utilizados no tratamento de defeitos da parede abdominal, o que sugere a necessidade de novos estudos para avaliar a segurança do uso de biomateriais produzidos por eletrofiação.

Assessment of biocompatibility of selected ferroelectric ceramics

Desde há muitas décadas que é sabido que os organismos vivos, em especial os tecidos, reagem fisicamente a estímulos eléctricos, podendo esses efeitos reproduzirem-se numa libertação de químicos endógenos, ou deformar a sua estrutura física. O tecido ósseo por si só é considerado um material/tecido piezoeléctrico, deformando-se mecanicamente quando lhe é induzido um estímulo eléctrico e vice-versa, ou seja, produz um potencial eléctrico quando sofre uma tracção ou compressão mecânica. A hipótese de que um material ferroeléctrico possa vir a produzir efeitos no desempenho deste tipo de tecidos é então proposta, como por exemplo, para uma melhor, mais rápida e eficaz regeneração óssea. Estes mesmos materiais ferroeléctricos podem porventura alterar as cargas de superfície dos tecidos vivos de modo a atrair, atrasar ou até impedir o fluxo iónico de elementos químicos específicos responsáveis pelo processo de regeneração. São escolhidos então o niobato de lítio e o tantalato de lítio como cerâmicos ferroeléctricos e foi estudada pela primeira vez a sua bioactividade in vitro, esperando-se encontrar pistas relativas à sua bioactividade in vivo. Estes cerâmicos ferroeléctricos foram seleccionados devido às suas importantes propriedades piezoeléctricas e ferroeléctricas. Estas propriedades podem abrir um novo e importante leque de aplicações biomédicas caso estes cerâmicos sejam bioactivos. Este trabalho foi dividido em 3 fases: (i) sintetização dos pós de niobato de lítio e tantalato de lítio, (ii) caracterização dos pós e (iii) preparação das amostras e (iv) estudo da bioactividade destes cerâmicos ferroeléctricos. Os pós foram produzidos através de um processo simples de mistura/moagem seguido de calcinação. Foram estudadas as fases cristalinas presentes através de Difracção de raios-X (DRX) e avaliadas as características morfológicas destes pós, nomeadamente o diâmetro de partículas e área superficial específica. De modo a simular o ambiente do plasma humano, foi produzido sinteticamente um “Simulated Body Fluid” (SBF). Seguidamente as amostras foram imersas nesse ambiente líquido por 1, 3, 7, 15 e 21 dias. Após remoção dos pós foram realizadas uma série de análises de modo a estudar a sua bioactividade. De entre estes testes destacam-se a microscopia electrónica de varrimento (SEM/EDS), DRX e espectroscopia de Infravermelho por transformada de Fourier com reflectância total atenuada (FTIR-ATR). Embora não tenham sido detectadas alterações no DRX realizado aos pós, verificou-se a formação de aglomerados de fosfato de cálcio na superfície dos pós através do SEM, resultados estes, reforçados pelo EDS e FTIR-ATR. Estes precipitados de fosfato de cálcio indiciam a capacidade destes pós cerâmicos ferroeléctricos se comportarem como bioactivos em contacto com tecidos ósseos in vivo.

Avaliação do desempenho in vivo do biovidro FastOs™

O conceito de bioatividade surgiu com a descoberta, no início década de 70, de que algumas composições vítreas (ex.: 45S5 Bioglass®), tinham a capacidade de estabelecer uma ligação direta e estável com os tecidos vivos. Desde então, este grupo de biomateriais tem vindo a receber uma atenção cada vez maior por parte dos investigadores, tendo como motivação principal a busca de novas composições com propriedades mais adequadas para a regeneração óssea do que as composições comercialmente disponíveis. Na presente tese, avaliou-se o desempenho in vivo de duas composições de biovidro do sistema diopsite (CaMgSi2O6) - fluorapatite (Ca5(PO4)3F) - fosfato tricálcico (3CaO•P2O5) aplicados em defeitos ósseos de tamanho não crítico em carneiros, tendo também sido avaliada a biocompatibilidade dos biomateriais através da aplicação subcutânea de placas dos mesmos vidros. O trabalho realizado também incluiu a avaliação dos materiais in vitro, através de estudos de biomineralização em fluido corporal simulado e estudos de degradação. Os biomateriais foram comparados com o biovidro 45S5 Bioglass®, sendo que em termos de bioatividade in vitro, as duas composições investigadas apresentaram um maior potencial bioativo, levando à formação de uma camada superficial de hidroxiapatite carbonatada, em contraste com a formação de calcite na composição comercial, sob condições idênticas. Os testes de degradação in vitro também apresentaram resultados melhores para as duas novas composições, traduzidos por variações de pH e taxas de degradação menores do que os observados no caso do 45S5 Bioglass®. A avaliação in vivo dos implantes subcutâneos permitiu apurar a biocompatibilidade dos biovidros testados, tendo sido considerados ligeiramente irritantes. Os resultados relativos à aplicação dos pós de vidro bioativo nos defeitos ósseos não foram obtidos em tempo útil de modo a poderem ser incluídos na presente tese. Considerando o desempenho in vitro e a biocompatibilidade dos materiais estudados, estes podem apontar-se como materiais promissores para aplicações em engenharia de tecidos, particularmente na regeneração do tecido ósseo.

A actividade sintética de hMSCs em contacto com vidros bioativos

Os vidros bioativos constituem um material apropriado para o preenchimento de defeitos ósseos, como alternativa a enxertos autólogos, uma vez que, quando expostos a fluidos fisiológicos promovem a formação de uma ligação com o tecido ósseo sob a forma de uma camada de hidroxiapatite carbonatada. No presente trabalho caracterizaram-se vidros bioativos sem conteúdo alcalino, cuja composição incide no sistema binário de diópsido (CaMgSi2O6) e fosfato de tricálcio (3CaO·P2O5), em função da sua molhabilidade, carga superficial, perfil de degradação, carácter bioativo em fluido fisiológico simulado e do seu comportamento in vitro em contacto com células estaminais mesenquimais humanas (hMSCs). A medição do ângulo de contacto inicial de água sobre os vidros demonstrou o carácter hidrofílico dos vidros investigados. A determinação do potencial zeta mostrou que a carga superficial dos vidros é negativa, sendo mais negativa na composição Di-70. O estudo da biodegradação dos vidros, efetuado através da sua imersão em Tris-HCl, permitiu concluir que a perda de peso dos vidros foi reduzida. A caraterização in vitro em meio acelular foi efetuada através da imersão dos vidros numa solução de fluido fisiológico simulado (SBF) e verificou-se que estes possuem capacidade de formar uma camada de hidroxiapatite carbonatada à sua superfície após 7 dias, detetável por XRD, FTIR e SEM/EDS, sugerindo que este conjunto de vidros é potencialmente bioativo, e poderá estimular a proliferação e diferenciação celular. A resposta das hMSCs em cultura aos vidros bioativos foi avaliada em termos de atividade metabólica, morfologia, viabilidade, proliferação e diferenciação osteogénica e conclui-se que os biovidros Di-60 e Di-70 poderão constituir um suporte viável para a proliferação e diferenciação de hMSCs.

Surface reactivity enhancement of silica-based glass-ceramic scaffolds

A paradigm shift is taking place from using transplanting tissue and synthetic implants to a tissue engineering approach that aims to regenerate damaged tissues by combining cells from the body with highly porous scaffold biomaterials, which act as templates, guiding the growth of new tissue. The central focus of this thesis was to produce porous glass and glass-ceramic scaffolds that exhibits a bioactive and biocompatible behaviour with specific surface reactivity in synthetic physiological fluids and cell-scaffold interactions, enhanced by composition and thermal treatments applied. Understanding the sintering behaviour and the interaction between the densification and crystallization processes of glass powders was essential for assessing the ideal sintering conditions for obtaining a glass scaffolds for tissue engineering applications. Our main goal was to carry out a comprehensive study of the bioactive glass sintering, identifying the powder size and sintering variables effect, for future design of sintered glass scaffolds with competent microstructures. The developed scaffolds prepared by the salt sintering method using a 3CaO.P2O5 - SiO2 - MgO glass system, with additions of Na2O with a salt, NaCl, exhibit high porosity, interconnectivity, pore size distribution and mechanical strength suitable for bone repair applications. The replacement of 6 % MgO by Na2O in the glass network allowed to tailor the dissolution rate and bioactivity of the glass scaffolds. Regarding the biological assessment, the incorporation of sodium to the composition resulted in an inibition cell response for small periods. Nevertheless it was demonstrated that for 21 days the cells response recovered and are similar for both glass compositions. The in vitro behaviour of the glass scaffolds was tested by introducing scaffolds to simulated body fluid for 21 days. Energy-dispersive Xray spectroscopy and SEM analyses proved the existence of CaP crystals for both compositions. Crystallization forming whitlockite was observed to affect the dissolution behaviour in simulated body fluid. By performing different heat treatments, it was possible to control the bioactivity and biocompatability of the glass scaffolds by means of a controlled crystallization. To recover and tune the bioactivity of the glass-ceramic with 82 % crystalline phase, different methods have been applied including functionalization using 3- aminopropyl-triethoxysilane (APTES). The glass ceramic modified surface exhibited an accelerated crystalline hydroxyapatite layer formation upon immersion in SBF after 21 days while the as prepared glass-ceramic had no detected formation of calcium phosphate up to 5 months. A sufficient mechanical support for bone tissue regeneration that biodegrade later at a tailorable rate was achievable with the glass–ceramic scaffold. Considering the biological assessment, scaffolds demonstrated an inductive effect on the proliferation of cells. The cells showed a normal morphology and high growth rate when compared to standard culture plates. This study opens up new possibilities for using 3CaO.P2O5–SiO2–MgO glass to manufacture various structures, while tailoring their bioactivity by controlling the content of the crystalline phase. Additionally, the in vitro behaviour of these structures suggests the high potential of these materials to be used in the field of tissue regeneration.

Degradação do perfil bioquímico de um concentrado de Nannochloropsis sp. durante o seu período de validade

As algas do género Nannochloropsis são microalgas marinhas que apresentam um perfil bioquímico único, principalmente no que é respeitante a lípidos, e uma vasta gama de compostos bioativos que possibilitam a sua aplicabilidade comercial em várias áreas biotecnológicas, destacando-se a alimentação e nutrição humana, indústria cosmética e farmacêutica, produção de biocombustíveis e a sua utilização em aquacultura. Em aquacultura, são usadas maioritariamente microalgas vivas, cuja produção representa elevados custos. Tem havido assim uma pesquisa de dietas alternativas, entre as quais os concentrados de microalgas se apresentam promissores. Os desafios atuais das empresas produtoras de concentrados de microalgas prendem-se com a conservação e armazenamento destes concentrados. Assim, neste trabalho foi proposto o estudo da influência da refrigeração, congelação e adição de conservantes a PhytoBloom Green Formula®, concentrado de Nannochloropsis sp. comercializado pela empresa Necton S.A., com o objetivo de averiguar a variação de parâmetros bioquímicos e organoléticos com a exposição do concentrado aos diferentes métodos de conservação. Pretendia-se assim observar se estes processos podem ser usados para aumentar o tempo de prateleira do concentrado em estudo. Para tal, foram avaliadas amostras recolhidas em três pontos temporais e analisados os seguintes parâmetros: perfil de ácidos gordos, quantificação de hidroperóxidos lipídicos, quantificação espectrofotométrica de clorofila a e carotenóides, bem como parâmetros organoléticos. Inicialmente, foi efetuada uma avaliação de diferentes parâmetros organoléticos, não se observando variações relevantes entre amostras das diferentes condições. Assim, foi posteriormente realizada a avaliação bioquímica. Primeiramente, foi efetuada a quantificação de ácidos gordos por GC-FID das diferentes amostras, nas quais não se observou diferenças significativas entre as condições experimentais. Foi também efetuado um ensaio de FOX II, que permitiu avaliar o grau de peroxidação lipídica de cada amostra por quantificação de hidroperóxidos lipídicos formados. As amostras nas quais houve adição de conservantes apresentaram um teor menor de hidropéroxidos lipídicos, permitindo inferir que a ação dos conservantes com propriedades antioxidantes permitiu uma melhor conservação da amostra. Quando se determinou a concentração de clorofila a e de carotenóides verificou-se que, em ambos os casos, a congelação conduziu a uma estabilização da concentração destes pigmentos. No entanto, os melhores resultados foram obtidos usando a combinação de congelação com adição de conservantes. Estes resultados, embora promissores, carecem de uma confirmação por um novo estudo, completando com análises com maior rigor e sensibilidade associados, no sentido de se verificar qual o método mais vantajoso para a extensão do tempo de prateleira de PhytoBloom Green Formula®.

Degradação do perfil bioquímico de um concentrado de Nannochloropsis sp. durante o seu período de validade

As algas do género Nannochloropsis são microalgas marinhas que apresentam um perfil bioquímico único, principalmente no que é respeitante a lípidos, e uma vasta gama de compostos bioativos que possibilitam a sua aplicabilidade comercial em várias áreas biotecnológicas, destacando-se a alimentação e nutrição humana, indústria cosmética e farmacêutica, produção de biocombustíveis e a sua utilização em aquacultura. Em aquacultura, são usadas maioritariamente microalgas vivas, cuja produção representa elevados custos. Tem havido assim uma pesquisa de dietas alternativas, entre as quais os concentrados de microalgas se apresentam promissores. Os desafios atuais das empresas produtoras de concentrados de microalgas prendem-se com a conservação e armazenamento destes concentrados. Assim, neste trabalho foi proposto o estudo da influência da refrigeração, congelação e adição de conservantes a PhytoBloom Green Formula®, concentrado de Nannochloropsis sp. comercializado pela empresa Necton S.A., com o objetivo de averiguar a variação de parâmetros bioquímicos e organoléticos com a exposição do concentrado aos diferentes métodos de conservação. Pretendia-se assim observar se estes processos podem ser usados para aumentar o tempo de prateleira do concentrado em estudo. Para tal, foram avaliadas amostras recolhidas em três pontos temporais e analisados os seguintes parâmetros: perfil de ácidos gordos, quantificação de hidroperóxidos lipídicos, quantificação espectrofotométrica de clorofila a e carotenóides, bem como parâmetros organoléticos. Inicialmente, foi efetuada uma avaliação de diferentes parâmetros organoléticos, não se observando variações relevantes entre amostras das diferentes condições. Assim, foi posteriormente realizada a avaliação bioquímica. Primeiramente, foi efetuada a quantificação de ácidos gordos por GC-FID das diferentes amostras, nas quais não se observou diferenças significativas entre as condições experimentais. Foi também efetuado um ensaio de FOX II, que permitiu avaliar o grau de peroxidação lipídica de cada amostra por quantificação de hidroperóxidos lipídicos formados. As amostras nas quais houve adição de conservantes apresentaram um teor menor de hidropéroxidos lipídicos, permitindo inferir que a ação dos conservantes com propriedades antioxidantes permitiu uma melhor conservação da amostra. Quando se determinou a concentração de clorofila a e de carotenóides verificou-se que, em ambos os casos, a congelação conduziu a uma estabilização da concentração destes pigmentos. No entanto, os melhores resultados foram obtidos usando a combinação de congelação com adição de conservantes. Estes resultados, embora promissores, carecem de uma confirmação por um novo estudo, completando com análises com maior rigor e sensibilidade associados, no sentido de se verificar qual o método mais vantajoso para a extensão do tempo de prateleira de PhytoBloom Green Formula®.

Ecological and biotechnological potential of sponge microbiome

Marine sponges harbor microbial communities of immense ecological and biotechnological importance. Recently, they have been focus of heightened attention due to the wide range of biologically active compounds with potential application, particularly, in chemical, cosmetic and pharmaceutical industries. However, we still lack fundamental knowledge of their microbial ecology and biotechnological potential. The development of high-throughput sequencing technologies has given rise to a new range of tools that can help us explore the biotechnological potential of sponges with incredible detail. Metagenomics, in particular, has the power to revolutionize the production of bioactive compounds produced by unculturable microorganisms. It can offer the identification of biosynthetic genes or gene clusters that can be heterologously expressed on a cultivable and suitable host. This review focus on the exploration of the biotechnological potential of sponge-associated microorganisms, and integration of molecular approaches, whose increasing efficiency can play an essential role on achieving a sustainable source of natural products.