Sensores de Bragg para bioaplicações

Nas últimas décadas, os sensores de Bragg têm sido frequentemente utilizados em inúmeras aplicações, em resultado das características únicas desta tecnologia. Contudo, a comunidade científica tem feito um esforço contínuo em desenvolver sensores que respondam tanto quanto possível aos requisitos e interesses de cada aplicação em particular. As bioaplicações são um campo de crescente interesse pelos sensores de Bragg, atendendo à heterogeneidade e complexidade dos meios de análise em questão. No âmbito desta dissertação foi realizada uma análise teórica dos princípios de funcionamento das redes de Bragg, focada em redes uniformes e inclinadas. Foi também descrito o processo de produção de redes de Bragg regeneradas. Redes de Bragg uniformes foram aplicadas na caracterização da reacção de polimerização e cura de materiais dentários, nomeadamente resina para base de dentadura, cimentos e gessos. Foi feita uma análise comparativa do desempenho de diferentes tipos de cimentos e gessos. Em relação ao gesso foi ainda avaliada a influência do rácio água/pó nas propriedades do material. Devido à importância que o índice de refracção tem na detecção de substâncias, doenças e controlo de qualidade de produtos, foi desenvolvido um sensor de índice de refracção baseado numa rede de Bragg inclinada. Implementaram-se também sensores para medição simultânea de índice de refracção e deformação, índice de refracção e temperatura e índice de refracção, deformação e temperatura, todos baseados numa única rede inclinada. O último dispositivo foi validado em ambiente laboratorial. Com o propósito de desenvolver um sensor baseado em redes de Bragg para monitorização da deformação óssea, foi avaliada a biocompatibilidade da fibra óptica em cultura de células osteoblásticas, e analisada a integridade física e funcionalidade da rede de Bragg nesse meio. O interesse em aumentar a sensibilidade e alargar a gama de trabalho dos sensores conduziu ao revestimento das fibras ópticas. Atendendo ao potencial índole biológica e biomédica do trabalho, usou-se como material de recobrimento o diamante, dada a excelente resposta em termos de biocompatibilidade, resistência à corrosão, não toxicidade e afinidade para espécies químicas e biológicas. Os filmes foram obtidos por deposição química a partir da fase vapor assistida por filamento quente. Para além de amostras de fibra óptica, foram revestidas redes de Bragg uniformes e regeneradas. Os sensores revestidos com diamante foram caracterizados à deformação e à temperatura.

Contribution to the study of the Ria de Aveiro inlet morphodynamics

Over the years it was observed at the Ria de Aveiro lagoon inlet, near the head of the north breakwater, a depth increase that might threaten the stability of this structure. A trend of accretion in the navigation channel of this lagoon is observed, endangering the navigation in this region. In order to understand the origin of these and other trends observed, the knowledge of the sediment transport in the study area is imperative. The main aim of this work is understanding the dominant physical processes in the sediment transport of sediment at the Ria de Aveiro lagoon inlet and adjacent area, improving knowledge of this region morphodynamics. The methodology followed in this study consisted in the analyzes of the topohydrographic surveys performed by the Administration of the Aveiro Harbor, and in the numerical simulations results performed with the morphodynamic modeling system MORSYS2D. The analysis of the surveys was performed by studying the temporal evolution of the bathymetry. The numerical analysis was based on the implementation of the model at the study area, sensitivity analysis of the formulations used to compute the sediment transport to the variation of input parameters (e.g. depth, sediment size, tidal currents) and analysis of the sediment uxes and bathymetric changes predicted. The simulations considered as sediment transport forcing the tidal currents only and the coupled forcing of tides and waves. Considering the wave e ect as sediment transport forcing, both monochromatic waves and a wave regime were simulated. The results revealed that the observed residual sediment transport patterns are generated due to the channel con guration. Inside the lagoon the uxes are mainly induced by the tidal currents action, restricting the action of waves to the inlet and adjacent coast. In the navigation channel the residual sediment uxes predicted are directed o - shore with values between 7 and 40 m3=day generating accretions of approximately 10 m3=day for the shallower region and 35 m3=day for the region between the tidal gauge and the tri^angulo das mar es. At the inlet, the residual uxes are approximately 30 m3=day inducing trends of erosion of approximately 20 m3=day. At the North side of the nearshore accretion is predicted, while at the South side is predicted erosion, at the rates of 250 and 1500 m3=day, respectively. It was also concluded that the waves with higher contribution to the residual sediment uxes are those with heights between 4 and 5 m. However, the storm waves with heights bigger than 5 m, despite their 10% of frequency of occurrence are responsible for 25% of the observed sediment transport.

Gene expression in understanding mechanisms of toxicity in amphibians

De uma forma geral os anfíbios são conhecidos como organismos que apresentam uma grande sensibilidade a vários tipos de contaminantes. Contudo existem casos, como o de Pelophylax perezi (rã-verde), em que estes organismos habitam áreas extremamente contaminadas. Este facto verifica-se na mina de urânio desactivada, da Cunha Baixa (Viseu, centro de Portugal), em que uma população destas rãs habita na lagoa de efluente ácido mineiro (M). Estudos ecotoxicológicos anteriores com estes organismos revelaram apenas efeitos de toxicidade ténues levantando algumas questões. Com o objectivo de elucidar quais os mecanismos que permitem a P. perezi permanecer neste local, sem sofrer aparentemente efeitos perniciosos, encetamos este trabalho. Numa primeira abordagem, avaliámos o sistema de defesa antioxidante de rãs adultas, bem como o conteúdo em metais de alguns órgãos. Desta forma verificámos alterações enzimáticas, principalmente no pulmão e acumulação de metais nos vários órgãos. Posteriormente foi realizado um estudo de expressão genética diferencial, também em organismos adultos e desta feita foram sugeridos alguns mecanismos de protecção basal que estarão por detrás da capacidade de suportar este ambiente extremamente contaminado. Numa etapa seguinte abordámos os efeitos em fases larvares, fazendo inicialmente uma exposição in situ, a vários efluentes, caracteristicamente diferentes, do complexo mineiro. Avaliámos o crescimento, a acumulação de metais e a actividade de alguns biomarcadores de stress oxidativo. Como resultado pudemos constatar que nas fases larvares para além de alguma mortalidade existe acumulação de metais bem como algumas alterações a nível de biomarcadores de stress oxidativo. Numa última abordagem realizamos uma exposição crónica dos girinos a efluente da mina com diversos níveis de pH para distinguir os efeitos da toxicidade do pH, dos efeitos da toxicidade pelo conteúdo de metais. Para tal avaliámos novamente biomarcadores de stress oxidativo, crescimento, acumulação de metais e efectuamos ainda um estudo de expressão genética diferencial. Esta última aproximação permitiu verificar que a toxicidade do efluente resulta primariamente do pH ácido, assumindo a contaminação por metais um papel secundário. Contudo o crescimento dos girinos de P. perezi apresenta-se estimulado por pHs mais baixos. São apontados ainda alguns mecanismos, em girinos, para lidar com o stress causado pela contaminação por metais.De uma forma geral pôde-se constatar que quer anfíbios adultos quer girinos expostos ao efluente apresentam valores altos de metais acumulados. Os biomarcadores de stress oxidativo na sua maioria não apresentaram respostas coerentes mediante as várias exposições. Este trabalho apresentase como um contributo importante para a ecotoxicologia de anfíbios, aumentando os níveis actuais de conhecimento sobre o efeito de contaminação proveniente de efluentes mineiros, sugerindo ainda mecanismos de resistência quer em larvas, quer para adultos.

Toxicity assessment of essential metals in aquatic detritivores

Os contaminantes provenientes quer de fontes naturais quer como consequência da atividade humana, têm contribuído para a degradação dos ecossistemas aquáticos. Entre estes encontram-se os metais que podem, ou não ser essenciais mediante o papel que desempenham no metabolismo dos organismos. O cobre e o zinco são exemplos de metais essenciais, contudo quando atingem concentrações elevadas podem tornar-se tóxicos. Os detritívoros aquáticos desempenham um papel fundamental na decomposição da matéria orgânica, alimentando-se de carcaças e partes de plantas que caem nos cursos de água. Assim, estes organismos permitem que o ciclo dos nutrientes se complete e servem como elo de ligação entre todos os grupos funcionais do ecossistema mantendo o seu equilíbrio estrutural e funcional. Sendo a matéria orgânica a sua principal fonte de energia estão sujeitos à contaminação existente no meio, pelo que é de todo o interesse proceder-se à avaliação dos efeitos da toxicidade de metais nestes organismos. Uma vez que as diferenças comportamentais consequentes desta exposição podem originar variações na densidade e diversidade, o que se refletirá a nível das comunidades, originando alterações na estrutura e funcionamento do ecossistema. Tendo em vista a avaliação dos efeitos da contaminação por metais em detritívoros, o principal objetivo deste trabalho foi comparar a sensibilidade a metais essenciais de dois detritivoros aquáticos, o camarão Atyaephyra desmarestii e o anfípode Echinogammarus meridionalis. Para tal, avaliaram-se os efeitos do cobre e do zinco a diferentes níveis de organização biológica. Primeiro, foram determinadas as preferências alimentares de A. desmarestii e E. meridionalis considerando tanto a área das folhas como a contaminação por metais das folhas. Em seguida, avaliaram-se os efeitos do cobre e do zinco na sobrevivência e inibição alimentar de ambas as espécies. Finalmente, avaliaram-se os efeitos destes mesmos metais a nível bioquímico utilizando uma bateria de biomarcadores que incluiu enzimas de stresse oxidativo, o sistema de defesa antioxidante e as colinesterases. Ambos os organismos não mostraram preferência em relação a folhas de área diferente. A presença de uma maior ou menor concentração de metais essenciais no alimento não teve qualquer influência na sua escolha pelo alimento (contaminado ou não). Os ensaios agudos de cobre e zinco mostraram que o cobre é mais tóxico para ambas as espécies do que o zinco. O camarão demonstrou ser mais sensível ao zinco que o anfípode, tendo este sido mais sensível ao cobre ( CL50 do cobre para A. desmarestii foi de 0,128 mg.l-1 e o de E. meridionalis foi de 0,050 mg.l-1; os valores correspondentes para o zinco foram 7,951 e 11,860 mg.l-1, respectivamente. Em relação aos efeitos subletais, o cobre teve efeitos notórios na taxa de alimentação de E. meridionalis, mas não afectou a de A. desmarestii. No que diz respeito à exposição ao zinco, ambas as espécies parecem apresentar tendência para inibir a alimentação. A caracterização das colinesterases revelou que a principal forma presente em ambas as espécies é a acetilcolinesterase, a qual que não foi afetada pela presença dos metais, no caso do camarão, mas parece ser inibida pelo zinco no caso do anfípode. O cobre inibiu o sistema de defesa enzimático de ambas as espécies, sem sinais de danos lipídicos. Para além disto, inibiu uma das enzimas antioxidantes (GPx) do anfípode. Apesar de não ter ocorrido dano lipídico após exposição ao cobre, observou-se um ligeiro aumento dos níveis das LPO, o que pode ser indicativo de uma potencial existência de dano oxidativo, como resultado da falha do sistema de defesa antioxidante. Por outro lado, o zinco induziu o sistema de defesa em E. meriodionalis prevenindo o dano lipídico. Enquanto em A. desmarestii o sistema enzimático antioxidante não respondeu, tendo ocorrido dano celular oxidativo considerando-se, assim, que o sistema de defesa antioxidante do camarão pode ser comprometido por exposição a metais. Ainda que os danos celulares oxidativos tivessem ocorrido a baixas concentrações de zinco. A exposição a este metal também induziu a actividade da GST de E. meriodionalis. Considerando que a taxa de alimentação foi severamente reduzida no caso deste organismo, o zinco parece ser o metal cuja concentração no ecossistema requer maior atenção. Integrando as respostas dos biomarcadores parece também evidente que A. desmarestii responde de uma maneira geral a maiores concentrações dos dois metais, enquanto a resposta de E. meridionalis ocorre a concentrações inferiores. Pelo que, E. meridionalis parece ser mais sensível ao nível bioquímico. Neste trabalho, os dois detritívoros, com ligeiras diferenças no modo como utilizam a matéria orgânica disponível, apresentam diferenças na sensibilidade aos metais essenciais a vários níveis de organização biológica, sendo o zinco o metal que poderá causar maior preocupação a nível bioquímico, enquanto o cobre parece ser o mais tóxico ao nível do organismo, causando mortalidade a concentrações mais baixas.

Tributyltin (TBT) resistance in Aeromonas molluscorum Av27

O tributilestanho (TBT) é considerado um dos xenobióticos mais tóxicos, produzidos e deliberadamente introduzidos no meio ambiente pelo Homem. Tem sido usado numa variedade de processos industriais e subsequentemente descarregado no meio ambiente. O tempo de meia-vida do TBT em águas marinhas é de várias semanas, mas em condições de anóxia nos sedimentos, pode ser de vários anos, devido à sua degradação mais lenta. Embora o TBT tenha sido descrito como sendo tóxico para eucariotas e procariotas, muitas bactérias podem ser resistentes a este composto. O presente trabalho teve como objetivo principal elucidar o mecanismo de resistência ao TBT em bactérias. Para além disso, pretendeu-se desenvolver um biorepórter para detectar TBT no ambiente. Para atingir estes objetivos foram delineadas várias tarefas cujos principais resultados obtidos se apresentam a seguir. Várias bactérias resistentes ao TBT foram isoladas de sedimento e água do Porto de Pesca Longínqua (PPL) na Ria de Aveiro, Portugal. Entre estas, Aeromonas molluscorum Av27 foi selecionada devido à sua elevada resistência a este composto (concentrações até 3 mM), à sua capacidade de degradar o TBT em compostos menos tóxicos (dibutilestanho, DBT e monobutilestanho, MBT) e também por usar o TBT como fonte de carbono. A. molluscorum Av27 foi caracterizada genotipica e fenotipicamente. Os fatores de virulência estudados mostraram que esta estirpe i) possui atividade lipolítica; ii) não é citotóxica para células de mamíferos, nomeadamente para células Vero; iii) não possui integrões de classe I e II e iv) possui cinco plasmídeos com aproximadamente 4 kb, 7 kb, 10 kb, 100 kb e mais de 100 kb. Estes resultados mostraram que a estirpe Av27 não é tóxica, aumentando assim o interesse nesta bactéria para futuras aplicações, nomeadamente na bioremediação. Os testes de toxicidade ao TBT mostraram que este composto tem um impacto negativo no crescimento desta estirpe, bem como, na densidade, no tamanho e na atividade metabólica das células e é responsável pela formação de agregados celulares. Assim, o TBT mostrou ser bastante tóxico para as bactérias interferindo com a atividade celular geral. O gene Av27-sugE, que codifica a proteína SugE pertencente à família das “small multidrug resistance proteins” (SMR), foi identificado como estando envolvido na resistência ao TBT nesta estirpe. Este gene mostrou ser sobreexpresso quando as células crescem na presença de TBT. O promotor do gene Av27-sugE foi utilizado para construir um bioreporter para detetar TBT, contendo o gene da luciferase do pirilampo como gene repórter. O biorepórter obtido reúne as características mais importantes de um bom biorepórter: sensibilidade (intervalo de limite de detecção de 1-1000 nM), rapidez (3 h são suficientes para a deteção de sinal) e, possivelmente, não é invasivo (pois foi construído numa bactéria ambiental). Usando sedimento recolhido no Porto de Pesca Longínqua da Ria de Aveiro, foi preparada uma experiência de microcosmos com o intuito de avaliar a capacidade de Av27 para bioremediar o TBT, isoladamente ou em associação com a comunidade bacteriana indígena. A análise das amostras de microcosmos por PCR-DGGE e de bibliotecas de 16S rDNA revelaram que a comunidade bacteriana é relativamente estável ao longo do tempo, mesmo quando Av27 é inoculada no sedimento. Para além disso, o sedimento estuarino demonstrou ser dominado por bactérias pertencentes ao filo Proteobacteria (sendo mais abundante as Delta e Gammaproteobacteria) e Bacteroidetes. Ainda, cerca de 13% dos clones bacterianos não revelaram nenhuma semelhança com qualquer dos filos já definidos e quase 100% afiliou com bactérias não cultiváveis do sedimento. No momento da conclusão desta tese, os resultados da análise química de compostos organoestânicos não estavam disponíveis, e por essa razão não foi possível tirar quaisquer conclusões sobre a capacidade desta bactéria remediar o TBT em sedimentos. Esses resultados irão ajudar a esclarecer o papel de A. molluscorum Av27 na remediação de TBT. Recentemente, a capacidade da estirpe Av27 remediar solo contaminado com TBT foi confirmada em bioensaios realizados com plantas, Brassica rapa e Triticum aestivum (Silva 2011a), e também com invertebrados Porcellionides pruinosus (Silva 2011B). Assim, poder-se-á esperar que a bioremediação do sedimento na experiência de microcosmos também tenha ocorrido. No entanto, só a análise química dos compostos organostânicos deverá ser conclusiva. Devido à dificuldade em realizar a análise analítica de organoestânicos, um método de bioensaio fácil, rápido e barato foi adaptado para avaliar a toxicidade do TBT em laboratório, antes de se proceder à análise química das amostras. O método provou a sua utilidade, embora tenha mostrado pouca sensibilidade quando se usam concentrações de TBT baixas. Em geral, os resultados obtidos contribuíram para um melhor entendimento do mecanismo de resistência ao TBT em bactérias e mostraram o potencial biotecnológico de A. molluscorum Av27, nomeadamente, no que refere à sua possível aplicação na descontaminação de TBT no ambiente e também no desenvolvimento de biorepórteres.

Self-referencing thermometry in the nanoscale

Na ´ultima d´ecada emergiu uma linha de investiga¸c˜ao muito activa em term´ometros n˜ao invasivos e precisos que possam determinar temperatura `a escala nanom´etrica. Esta investiga¸c˜ao foi fortemente estimulada pelas numerosas solicita¸c˜oes da nanotecnologia e da biomedicina, por exemplo. Uma das abordagens mais promissoras prop˜oe o uso de i˜oes trivalentes de lantan´ıdeos que apresenta propriedades fotoluminescentes que dependem da temperatura. Neste trabalho demonstra-se que esta t´ecnica combina as vantagens de te um limite de detec¸c˜ao de 0.5 graus com sensibilidade at´e 4.5 % · K−1. Este term´ometro molecular pode ser processado em filmes finos ou nanopart´ıculas, abrindo os campos de aplica¸c˜ao a diferentes utiliza¸c˜oes. As nanopart´ıculas de s´ılica produzidas s˜ao caracterizadas na presen¸ca e na ausˆencia de i˜oes lantan´ıdeos. Sem o metal, as nanopart´ıculas de APTES/TEOS demonstram ser luminescentes sob excita¸c˜ao UV sem necessidade de utilizar qualquer tratamento t´ermico. O rendimento quˆantico de emiss˜ao depende apenas da propor¸c˜ao dos silanos e pode atingir o valor de 0.15 ± 0.02. A co-dopagem destas nanopart´ıculas com Eu3+ e Tb3+ permite obter sondas com resposta raciom´etrica, com a possibilidade de ajustar a gama de temperaturas de opera¸c˜ao e a sensibilidade, via desenho inteligente da matriz de suporte e dos ligandos de β-dicetona que est˜ao coordenados ao i˜ao met´alico. Quando processados como filmes, este term´ometro permite o mapeamento de temperaturas com resolu¸c˜ao espacial 1.8 μm. A racionaliza¸c˜ao da dependˆencia de temperatura ´e uma ferramenta ´util para desenvolver term´ometros que operam em gamas de temperatura espec´ıficos (e.g. gama de temperatura fisiol´ogica, 290-340 K) com sensibilidade acima de 0.5 % · K−1. A combina¸c˜ao de esfor¸cos de um grande n´umero de diversas disciplinas ir´a previsivelmente permitir o surgimento de term´ometros moleculares novos e sofisticados, preenchendo os principais requisitos das nanociencias.

Effects of the climatic factors and anthropogenic actions in the Ria de Aveiro

A compreensão dos impactes das alterações climáticas é fundamental para a gestão a longo do prazo dos ecossistemas estuarinos. Esta compreensão só poderá ser efectiva considerando a variabilidade climática natural e o papel relativo das intervenções antropogénicas nestes ecossistemas. Assim, a presente dissertação analisa a influência das alterações climáticas e pressões antropogénicas na qualidade da água e dinâmica ecológica da Ria de Aveiro com base numa abordagem integrada, que combinou a análise de séries temporais dos últimos 25 anos e a modelação numérica de elevada resolução de cenários futuros de alterações climáticas e intervenções antropogénicas. A componente de modelação de qualidade da água e ecológica foi melhorada a vários níveis. A análise de sensibilidade do modelo 3D hidrodinâmicoecológico ECO-SELFE aplicado à Ria de Aveiro e a revisão das constantes de semi-saturação para absorção de nutrientes pelo fitoplâncton contribuíram para a precisão e robustez das aplicações. A concentração do fitoplâncton foi significativamente influenciada pelas taxas de crescimento do fitoplâncton e de mortalidade e excreção do zooplâncton, e apresentou uma sensibilidade reduzida à variação das constantes de semi-saturação na gama identificada para as diatomáceas. O acoplamento do ECO-SELFE a um modelo de campo próximo e a integração do ciclo do oxigénio aumentaram a sua capacidade de representação dos processos e das escalas espaciais relevantes. A validação do ECO-SELFE foi realizada com base num conjunto de campanhas específicas realizadas no canal de Mira. Os padrões espaciais e temporais observados para as várias variáveis (clorofila a, nutrientes, oxigénio dissolvido, salinidade, temperatura da água, correntes e níveis) foram simulados com erros menores ou semelhantes aos obtidos neste tipo de aplicações. A análise dos padrões de variabilidade espacial e temporal da qualidade da água e ecológica na Ria de Aveiro a diferentes escalas, efectuada com base nos dados históricos de 1985 a 2010 complementados pelas campanhas realizadas, sugeriu uma influência combinada da variabilidade climática e das acções antropogénicas. Os cenários futuros de alterações climáticas e intervenções antropogénicas simulados evidenciaram uma influência mais significativa das alterações climáticas quando comparadas com os efeitos das acções antropogénicas analisadas. As variações mais significativas são previstas para os cenários de subida do nível do mar, seguidos dos cenários de alterações dos regimes hidrológicos, evidenciando o papel da circulação (maré e caudal fluvial) no estabelecimento da qualidade da água e dinâmica ecológica na laguna. Para os cenários de subida do nível do mar são previstos decréscimos significativos da clorofila a e dos nutrientes a jusante e nas zonas intermédias do canal, e um aumento significativo da salinidade a montante. Estas alterações poderão favorecer modificações da composição e distribuição das comunidades, afectando a cadeia alimentar e causando uma progressão para montante de espécies marinhas. Os resultados sugerem ainda que os efeitos poderão ser mais significativos em estuários pouco profundos.

Ecological interactions in populations facing environmental stress

O zooplâncton, particularmente os cladóceros, são organismos de água doce importantes na regulação da produção primária dos ecossistemas de água doce. No entanto, também podem adaptar-se a condições salobras. Tendo em conta as previsões no âmbito das alterações climáticas, a intrusão salina pode ocorrer a par com a subida de temperatura. As populações de água doce podem ficar vulneráveis aos efeitos interativos da salinidade e da temperatura, de acordo com os seus limites de tolerância e capacidade de adaptação ao stress ambiental. Assim, a presente tese analisou as interações resultantes das alterações destes agentes de stress em populações de cladóceros de água doce. Primeiro, comparou-se a halotolerância de diferentes genótipos de Simocephalus vetulus provenientes de populações de água doce e de água salobra de modo a avaliar a existência de uma componente genética de resistência à salinidade. A sensibilidade aguda dos genótipos variou na mesma gama de concentrações; todavia, todos os genótipos da população salobra, exceto um, foram mais tolerantes do que os de água doce, em termos de tempo à imobilização. Contudo, não foi possível estabelecer uma relação entre a performance reprodutiva em condições salobras e o contexto ambiental de origem destes genótipos. Mais, estes ensaios mostraram que as populações de água doce têm potencial para tolerar incrementos de salinidade. Como tal, pode-se concluir que a seleção a que os genótipos estão sujeitos no seu local de origem foi mais fraca do que o esperado. Segundo, investigou-se a capacidade de aclimatação de Daphnia galeata à salinidade e temperatura, de modo a avaliar a halotolerância de Daphnia a duas temperaturas num cenário de aclimatação multigeracional. O objetivo foi compreender se a pré-adaptação ao stress ambiental (20ºC e 25ºC versus 0 g/L e 1 g/L de NaCl) influenciou posteriormente as respostas a estes agentes de stress. Verificou-se uma tendência para um aumento de sensibilidade ao NaCl, a temperaturas mais elevadas. No entanto, este efeito foi anulado após nove gerações, mas apenas quando os organismos foram aclimatados aos dois agentes de stress em simultâneo (salinidade e temperatura elevada). Terceiro, demonstrou-se experimentalmente que a salinidade interferiu com a competição interespecífica, alterando a composição das comunidades zooplanctónicas. Este conjunto de evidências permitiu-nos refletir nos múltiplos impactos de agentes de stress, particularmente os relacionados com as previsões de alterações climáticas. Em paralelo aos estudos de natureza experimental, e numa perspetiva de Educação para o Desenvolvimento Sustentável (EDS), importa também promover o desenvolvimento de competências necessárias à compreensão de mudanças ambientais globais (e.g., o impacto da salinidade e da temperatura) para implementar estratégias de mitigação e adaptação. Neste contexto, foi realizada uma atividade com estudantes do ensino secundário, que se tornou uma boa oportunidade para a sua aprendizagem e aquisição de competências de interpretação de dados experimentais, assim como de sensibilização para as questões ambientais.

Metabonomics of human amniotic fluid for prenatal diagnostics

O trabalho apresentado nesta tese teve como principais objectivos contribuir para o conhecimento da composição do líquido amniótico humano (LA), colhido no 2º trimestre de gravidez, assim como investigar possíveis alterações na sua composição devido à ocorrência de patologias pré-natais, recorrendo à metabonómica e procurando, assim, definir novos biomarcadores de doenças da grávida e do feto. Após uma introdução descrevendo o estado da arte relacionado com este trabalho (Capítulo 1) e os princípios das metodologias analíticas usadas (Capítulo 2), seguida de uma descrição dos aspectos experimentais associados a esta tese (Capítulo 3), apresentam-se os resultados da caracterização da composição química do LA (gravidez saudável) por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), assim como da monitorização da sua estabilidade durante o armazenamento e após ciclos de congelamento-descongelamento (Capítulo 4). Amostras de LA armazenadas a -20°C registaram alterações significativas, tornando-se estas menos pronunciadas (mas ainda mensuráveis) a -70°C, temperatura recomendada para o armazenamento de LA. Foram também observadas alterações de composição após 1-2 ciclos de congelamento-descongelamento (a ter em conta aquando da reutilização de amostras), assim como à temperatura ambiente (indicando um período máximo de 4h para a manipulação e análise de LA). A aquisição de espectros de RMN de 1H de alta resolução e RMN acoplado (LC-NMR/MS) permitiu a detecção de 75 compostos no LA do 2º trimestre, 6 dos quais detectados pela primeira vez no LA. Experiências de difusão (DOSY) permitiram ainda a caracterização das velocidades de difusão e massas moleculares médias das proteínas mais abundantes. O Capítulo 5 descreve o estudo dos efeitos de malformações fetais (FM) e de cromossomopatias (CD) na composição do LA do 2º trimestre de gravidez. A extensão deste trabalho ao estudo dos efeitos de patologias no LA que ocorrem no 3º trimestre de gravidez é descrita no Capítulo 6, nomeadamente no que se refere ao parto pré-termo (PTD), pré-eclampsia (PE), restrição do crescimento intra-uterino (IUGR), ruptura prematura de membranas (PROM) e diabetes mellitus gestacional (GDM). Como complemento a estes estudos, realizou-se uma análise preliminar da urina materna do 2º trimestre para o estudo de FM e GDM, descrita no Capítulo 7. Para interpretação dos dados analíticos, obtidos por espectroscopia RMN de 1H, cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada a espectrometria de massa (UPLC-MS) e espectroscopia do infravermelho médio (MIR), recorreu-se à análise discriminante pelos métodos dos mínimos quadrados parciais e o método dos mínimos quadrados parciais ortogonal (PLS-DA e OPLS-DA) e à correlação espectral. Após análise por validação cruzada de Monte-Carlo (MCCV), os modelos PLS-DA de LA permitiram distinguir as FM dos controlos (sensibilidades 69-85%, especificidades 80-95%, taxas de classificação 80-90%), revelando variações metabólicas ao nível do metabolismo energético, dos metabolismos dos aminoácidos e glícidos assim como possíveis alterações ao nível do funcionamento renal. Observou-se também um grande impacto das FM no perfil metabólico da urina materna (medido por UPLC-MS), tendo no entanto sido registados modelos PLS-DA com menor sensibilidade (40-60%), provavelmente devido ao baixo número de amostras e maior variabilidade da composição da urina (relativamente ao LA). Foram sugeridos possíveis marcadores relacionados com a ocorrência de FM, incluindo lactato, glucose, leucina, valina, glutamina, glutamato, glicoproteínas e conjugados de ácido glucurónico e/ou sulfato e compostos endógenos e/ou exógenos (<1 M) (os últimos visíveis apenas na urina). No LA foram também observadas variações metabólicas devido à ocorrência de vários tipos de cromossomopatias (CD), mas de menor magnitude. Os perfis metabólicos de LA associado a pré- PTD produziram modelos que, apesar do baixo poder de previsão, sugeriram alterações precoces no funcionamento da unidade fetoplacentária, hiperglicémia e stress oxidativo. Os modelos obtidos para os grupos pré- IUGR pré- PE, pré- PROM e pré-diagnóstico GDM (LA e urina materna) registaram baixo poder de previsão, indicando o pouco impacto destas condições na composição do LA e/ou urina do 2º trimestre. Os resultados obtidos demonstram as potencialidades da análise dos perfis metabólicos do LA (e, embora com base em menos estudos, da urina materna) do 2º trimestre para o desenvolvimento de novos e complementares métodos de diagnóstico, nomeadamente para FM e PTD.

Biodiversity and conservation of subterranean fauna of Portuguese karst

As regiões cársicas de Portugal ocupam uma parte considerável do território e albergam mais de 2000 grutas, que são habitadas por animais subterrâneos com características adaptativas únicas. Estes animais estão entre os mais raros, ameaçados e desprotegidos a nível mundial, comummente pelo simples fato de serem desconhecidos, o que associado à relativa inacessibilidade do seu habitat, constitui um desafio para o seu estudo. O presente trabalho centra-se no estudo da biodiversidade subterrânea do carso de Portugal, de forma a contribuir para a sua conservação. Os invertebrados subterrâneos têm sido ignorados no que concerne à sua proteção, sobretudo porque o conhecimento era escasso e desorganizado. Este trabalho começa por apresentar uma revisão de todas as fontes bibliográficas sobre fauna subterrânea em Portugal, incluindo um catálogo de espécies troglóbias e estigóbias, acompanhado das respetivas localizações, para congregar, pela primeira vez, o estado do conhecimento da riqueza específica, biogeografia e conservação das áreas estudadas. Para compreender os padrões de biodiversidade subterrânea, foi realizado um ano de trabalho de campo intenso e padronizado em mais de 40 cavidades de 14 unidades cársicas. Deste esforço resultou a descoberta e descrição de nove novos taxa, compreendendo três novos géneros e seis novas espécies para a ciência. Utilizando sistemas de informação geográfica foram mapeadas as distribuições das espécies subterrâneas do carso de Portugal e a sua riqueza foi comparada com a de outras áreas do mundo. Para explicar a sua riqueza específica subterrânea, foram testados vários fatores ambientais e efetuada a estimativa de espécies subterrâneas, numa escala regional. A evapotranspiração e consequentemente a produtividade primária ao nível da superfície poderão ser fatores importantes na variação da riqueza específica nas diferentes unidades cársicas, mas a profundidade e as características geológicas únicas de cada maciço parecem desempenhar um papel determinante nos padrões de biodiversidade subterrânea. Com o intuito de avaliar a sensibilidade de organismos subterrâneos à contaminação, foram testados os efeitos letais de dois tóxicos em crustáceos estigóbios com diferentes graus de troglomorfismo. Foram igualmente abordados aspectos gerais de ecotoxicologia de águas subterrâneas e perspectivas de futuro. Os principais problemas relacionados com a conservação dos habitats subterrâneos em Portugal estão associados à destruição direta do habitat e à sua contaminação. Estes carecem de proteção específica, o que implica a gestão adequada à superfície e a criação de áreas prioritárias de conservação. Integrando toda a informação gerada, o presente estudo estabelece uma hierarquização de locais prioritários para a conservação da fauna subterrânea em zonas cársicas de Portugal.

Os ambientes artísticos interativos na inclusão de alunos com necessidades educativas especiais

Com o objetivo de sublinhar a habilidade e o direito à criação do indivíduo com necessidades especiais este projeto deriva da beleza do território da arte e dos paradigmas de interação e imersão, hoje potencializados pelo feedback multimodal e multissensorial dos ambientes multimédia responsivos. Enfatizando o atual contexto da escola inclusiva, este estudo teve lugar num estabelecimento de ensino, em Portugal, envolvendo um grupo de alunos com Necessidades Educativas Especiais — NEE — de Currículo Específico Individual — CEI. Num contexto real, intentámos avaliar que tipo de impacto poderão ter os ambientes artísticos interativos nestes alunos, enquanto meio de autoexpressão e de inclusão. O estudo realizado assumiu um carácter exploratório. Special INPUT foi o conceito proposto por diferentes ambientes e abordagens de interação, implementados em sessões individuais com os participantes, que permitiu observar e promover, sob um contexto artístico, as habilidades intelectual, emocional, de personalidade, interpessoal, intrapessoal, psicomotora e, artística. Conceptualizámos, prototipámos e implementámos oito ambientes interativos, artísticos e lúdicos, que enfatizaram de formas diversas a experiência imersiva mediada pela técnica. Daí emergiram três grupos de ambientes – Special SOUND, Special MOVEMENT e Special ME – que intentaram promover nestes alunos a descoberta de si mesmos através do input de som, movimento e/ou vídeo processados em tempo real. O feedback visual e/ou sonoro visou o “engajamento lúdico” e a “ressonância estética” enquanto meios de descoberta e desenvolvimento da habilidade e valor pessoais. Numa perspetiva de diferenciação e individualização curricular, reconhecemos as vantagens dos ambientes artísticos interativos na inclusão de alunos com NEE, tendo-se observado um impacto positivo derivado da autoria e do controlo propiciados aos participantes nestes contextos. Hoje, a possibilidade de recorrer ao multimédia e a toda uma panóplia de interfaces não invasivas, explorando a poética de som e imagem interativos, em contexto artístico, inspira abordagens originais, centradas na pessoa, atentando às potencialidades e plasticidades das vigentes ferramentas de autor para a programação de interação, promovendo a dignificação da diferença, a autoexpressão e sensibilidade individuais, e os processos de autoobservação, autodescoberta e autoconsciência da capacidade expressiva que promovem a ideia positiva do “self” e o desenvolvimento de diferentes aptidões pessoais.

Educar (para) o pensar : desenvolvimento de competências reflexíveis em professores e alunos do 1º CEB : contributos da "Filosofia para Crianças"

O presente estudo inscreve-se na área científica da Formação de Professores, incidindo, particularmente, na compreensão do processo de desenvolvimento das competências reflexivas percebidas como factor de promoção do seu próprio desenvolvimento profissional e pessoal, do desenvolvimento da capacidade de pensar dos seus alunos, da revalorização dos processos curriculares de ensino-aprendizagem e de inovação dos contextos educacionais. Num contexto de complexidade, incerteza e mudança, importa repensar estratégias de formação de professores e de alunos para que possam constituir-se como fatores potenciadores do desenvolvimento da competência reflexiva. Estratégias que convocam, quer o professor, quer o aluno, para um tipo de questionamento de maior exigência reflexiva e consideradas potenciadoras do pensamento crítico, criativo e de cuidado com o outro, numa perspetiva educativa centrada no cuidar, que valoriza a dimensão humana, a atuação responsável, ética e solidária, em todos os planos da vida. Neste estudo propomo-nos retomar algumas das estratégias de formação já configuradas no movimento Filosofia para Crianças e que se constituíram como um programa de formação em contexto, no qual se procurou aprofundar e compreender as múltiplas dimensões e modos como interatuam os diferentes participantes da relação educativa em práticas curriculares reconfiguradas à luz dos pressupostos que sustentam este estudo. Do ponto de vista metodológico, a investigação inscreve-se num paradigma de natureza qualitativa e interpretativa, de matriz hermenêutica e ecológica, configurando uma abordagem de tipo complexo, e com características de estudo de caso, que considera indispensável a participação ativa do sujeito na construção do conhecimento próprio, bem como o carácter de imprevisibilidade e de recursividade das condições e subsistemas em que tal ocorre. No sentido de construir uma visão integrada do objeto em estudo, foram desenvolvidos procedimentos específicos (mixed-methods), nomeadamente análise documental, entrevista semiestruturada, observação participante e inquirição por questionário. O estudo, que decorreu na região centro do país, envolveu 5 professoras do 1.º Ciclo do Ensino Básico, 100 alunos do mesmo nível de ensino e os seus pais/encarregados de educação, inquiridos através de questionário e desenvolveu-se em duas fases. A primeira destinou-se à formação teórico-prática das professoras e, na segunda, foram desenvolvidas sessões práticas de Filosofia para Crianças com os alunos. Os portfolios reflexivos construídos pelos participantes e pela investigadora principal constituíram outra fonte da informação recolhida no estudo empírico. Os resultados do estudo situam-se a quatro níveis: no que respeita aos saberes básicos, ao perfil de competência dos professores, à sua formação e às estratégias e recursos considerados como potenciadores de um pensar de mais elevada qualidade. Quanto ao primeiro nível, o presente estudo releva o carácter estruturante e epistémico de aprender a pensar (bem), salientando que este se processa numa maior amplitude e profundidade dos conteúdos da própria reflexão, às quais subjaz uma visão ampla de cidadania planetária e socialmente comprometida, evidenciando uma ampliação do quadro referencial dos saberes básicos e considerados imprescindíveis para a educação dos cidadãos. A um segundo nível, salienta-se a exigência de um perfil de competência profissional que permita aos professores desenvolver nos seus alunos um pensar de qualidade e, simultaneamente, melhorar a sua própria competência reflexiva. Neste sentido, o estudo aponta para a continuidade das respostas que têm vindo a ser equacionadas por vários autores nacionais e internacionais que, ao abordarem a problemática da formação, do conhecimento profissional e do desenvolvimento identitário dos professores, têm acentuado a importância dos modelos crítico-reflexivos da formação e de uma supervisão ecológica, integradora, não standard e humanizada, no desenvolvimento das sociedades contemporâneas. Conforme os dados sugerem, admite-se que a formação integral dos cidadãos passa pela inclusão e interligação de diferentes áreas do conhecimento que, concertada e complementarmente, possam contribuir para o desenvolvimento da sensibilidade, do pensamento crítico e criativo, de uma cultura da responsabilidade e de uma atitude ética mais ativa e interventiva. Neste sentido, reafirma-se a importância de um trajeto formativo que promova a efetiva articulação entre teoria e a prática, o diálogo crítico-reflexivo entre saberes científicos e experiência, que focalize o profissional na sua praxis e saliente a sua conexão com o saber situado em contexto vivencial e didático- -pedagógico. Realça-se a pertinência de dinâmicas formativas que, a exemplo de “comunidades de investigação/aprendizagem”, na sua aceção de redes de formação que, na prossecução de projetos e propósitos comuns, incentivam a construção de itinerários próprios e de aprendizagens individuais, mobilizando processos investigativos pessoais e grupais. Evidencia-se a valorização de práticas promotoras da reflexão, do questionamento, da flexibilidade cognitiva como eixos estruturadores do pensamento e da ação profissional e como suporte do desenvolvimento profissional e pessoal, corroborando a importância dos processos transformadores decorrentes da experiência, da ação e da reflexão sobre ela. Finalmente, no que respeita às estratégias e recursos, os dados permitem corroborar a riqueza e o potencial do uso de portfolios reflexivos no desenvolvimento de competências linguísticas, comunicacionais, reflexivas e meta-reflexivas e o entendimento de que o processo de construção da identidade profissional ocorre e desenha-se numa dinâmica reflexiva- -prospetiva (re)confirmadora ou (re)configuradora de ideias, convicções, saberes e práticas, ou seja, identitária. De igual modo, a investigação releva a importância da construção de portfolios, por parte dos alunos, para o desenvolvimento da qualidade do seu pensamento, sublinhando-se o seu carácter inovador nesta área. Evidencia-se, ainda, a diversidade de estratégias que respeitem os interesses, necessidades e expectativas dos alunos e o seu contexto de vida, tal como o recurso a materiais diversificados que, atentos ao conteúdo da mensagem, possibilitem a autonomia do pensamento, o exercício efetivo da reflexão crítica e do questionamento, na sua articulação com as grandes questões que sempre despertaram a curiosidade humana e cuja atualidade permanece. Materiais e recursos que estabeleçam o diálogo entre razão e imaginação, entre saber e sensibilidade, que estimulem o envolvimento dos alunos na resolução de problemas e na procura conjunta de soluções e na construção de projetos individuais na malha dos projetos comuns. Reafirma-se, pois, a importância da humanização do saber, a educação pensada como vivência solidária de direitos e deveres. Uma perspetiva educacional humanista que assenta nas trajetórias de vida, na recuperação de experiências pessoais e singulares, que procura compreender a identidade como um processo em (re)elaboração permanente. O presente estudo integra-se na rede de cooperação científica Novos saberes básicos dos alunos no século XXI, novos desafios à formação de professores sendo que, e na linha das investigações produzidas neste âmbito, destaca que o alargamento das funções do professor do 1.º Ciclo do Ensino Básico, que colocando a tónica da ação pedagógica no como se aprende e para quê e na possibilidade de aprender e incorporar o imprevisível, incide no desenvolvimento de um conjunto de capacidades que vão para além das tradicionalmente associadas ao ensinar a ler, escrever e contar. Releva-se, pois, a pertinência da criação de ambientes educativos nos quais professores e alunos entreteçam, conjunta e coerentemente, conhecer, compreender, fazer, sentir, dizer, ver, ouvir e (con)viver em prol de uma reflexão que nos encaminhe no sentido de ser(mos) consciência.

Exposure modelling to traffic-related air toxic pollutants

Atualmente, a poluição atmosférica constitui uma das principais causas ambientais de mortalidade. Cerca de 30% da população europeia residente em áreas urbanas encontra-se exposta a níveis de poluição atmosférica superiores aos valores- limite de qualidade do ar legislados para proteção da saúde humana, representando o tráfego rodoviário uma das principais fontes de poluição urbana. Além dos poluentes tradicionais avaliados em áreas urbanas, os poluentes classificados como perigosos para a saúde (Hazard Air Pollutants - HAPs) têm particular relevância devido aos seus conhecidos efeitos tóxicos e cancerígenos. Neste sentido, a avaliação da exposição tornase primordial para a determinação da relação entre a poluição atmosférica urbana e efeitos na saúde. O presente estudo tem como principal objetivo o desenvolvimento e implementação de uma metodologia para avaliação da exposição individual à poluição atmosférica urbana relacionada com o tráfego rodoviário. De modo a atingir este objetivo, foram identificados os parâmetros relevantes para a quantificação de exposição e analisados os atuais e futuros potenciais impactos na saúde associados com a exposição à poluição urbana. Neste âmbito, o modelo ExPOSITION (EXPOSure model to traffIc-relaTed aIr pOllutioN) foi desenvolvido baseado numa abordagem inovadora que envolve a análise da trajetória dos indivíduos recolhidas por telemóveis com tecnologia GPS e processadas através da abordagem de data mining e análise geoespacial. O modelo ExPOSITION considera também uma abordagem probabilística para caracterizar a variabilidade dos parâmetros microambientais e a sua contribuição para exposição individual. Adicionalmente, de forma a atingir os objetivos do estudo foi desenvolvido um novo módulo de cálculo de emissões de HAPs provenientes do transporte rodoviário. Neste estudo, um sistema de modelação, incluindo os modelos de transporteemissões- dispersão-exposição, foi aplicado na área urbana de Leiria para quantificação de exposição individual a PM2.5 e benzeno. Os resultados de modelação foram validados com base em medições obtidas por monitorização pessoal e monitorização biológica verificando-se uma boa concordância entre os resultados do modelo e dados de medições. A metodologia desenvolvida e implementada no âmbito deste trabalho permite analisar e estimar a magnitude, frequência e inter e intra-variabilidade dos níveis de exposição individual, bem como a contribuição de diferentes microambientes, considerando claramente a sequência de eventos de exposição e relação fonte-recetor, que é fundamental para avaliação dos efeitos na saúde e estudos epidemiológicos. O presente trabalho contribui para uma melhor compreensão da exposição individual em áreas urbanas, proporcionando novas perspetivas sobre a exposição individual, essenciais na seleção de estratégias de redução da exposição à poluição atmosférica urbana, e consequentes efeitos na saúde.

UV-induced stress in bacterioneuston : mechanisms and ecological implications

As bactérias desempenham um papel chave na reciclagem de energia e matéria nas teias tróficas aquáticas. No entanto, as suas pequenas dimensões, curto tempo de geração e o facto de os seus genomas constituírem uma grande porção do seu volume celular, tornam as bactérias mais suscetíveis às alterações ambientais que os organismos superiores. O aumento dos níveis de radiação UVB (280-320 nm) constitui uma ameaça particularmente importante para as comunidades bacterianas dos sistemas aquáticos, uma vez que a radiação consegue penetrar até profundidades consideráveis. No entanto, os mecanismos através dos quais a radiação causa danos nas bactérias ainda não são claros, o que impede a modelação precisa dos efeitos da radiação UV nas comunidades bacterianas naturais. O bacterioneuston habita a microcamada superficial (primeiro milímetro da coluna de água), estando naturalmente exposto a níveis de radiação UV superiores aos que o bacterioplâncton está exposto. Deste modo, a microcamada superficial pode ser vista como um nicho ecológico modelo para estudar as interações entre as bactérias e a radiação UV. Os objetivos deste trabalho foram (i) avaliar a influência do nível de exposição natural à radiação das comunidades bacterianas na sua sensibilidade à radiação UV, através da comparação das respostas fotobiológicas do bacterioneuston e bacterioplâncton; (ii) aprofundar o conhecimento acerca dos mecanismos através dos quais a radiação UV causa danos, bem como dos fatores que afetam a interação entre a radiação UV e as bactérias; e (iii) avaliar o potencial da proteína RecA, que medeia a resposta SOS das bactérias, para ser usada como marcador de danos induzidos por UV nas comunidades bacterianas. Verificou-se que o bacterioneuston é mais resistente à radiação UVB que o bacterioplâncton e recupera de modo mais eficiente dos danos induzidos por UV, particularmente em condições de escassez de nutrientes, indicando assim que o nível de exposição natural das comunidades bacterianas à radiação afeta a sua sensibilidade à radiação UV. Os resultados das análises independentes do cultivo revelaram o potencial da radiação UV para afetar a estrutura das comunidades bacterianas ao selecionar bactérias resistentes. A análise do perfil de utilização de fontes de carbono usando o sistema de Ecoplacas Biolog ® e a determinação das taxas de incorporação de leucina e timidina permitiu também verificar que a radiação UV modifica o funcionamento das comunidades bacterianas. Os resultados obtidos indicam a possibilidade do bacterioneuston conter um conjunto de estirpes resistentes a UV que, mediante as condições meteorológicas apropriadas, podem ser selecionadas aquando da exposição à radiação.

Avaliação ecológica do efeito combinado de contaminantes ambientais

The assessment of ecological status of lotic freshwater bodies, based on stringent criteria of classification, has been defined by the Water Framework Directive (WFD), as a result of the implementation and optimization of methodologies that integrate physico-chemical, biological, and hydromorphological parameters. It is recognized that the application of this methodology is not easy, because it requires deep technical and scientific knowledge; it is time consuming in its application involving high financial costs. Thus, the main objective of this study was the development of cheaper and faster complementary methodologies that may contribute to the technical application of the classification criteria defined by the WFD, achieving the same final results of evaluation. In order to achieve this main goal, the river Mau, a small mountain river subjected to different stressors (eg, metals, pesticides), was established as the main sampling area. This thesis reviewed the historical development of various biotic indexes and its application in assessing water quality, especially highlighting the new paradigm defined by the WFD, and the corresponding actions developed for optimization and intercalibration of methodologies, evaluating the final state of water bodies. The ecological spatiotemporal characterization of the river Mau focused on the application of the WFD methodology, using at this stage only macroinvertebrates collected during four seasons. Results were compared with historical data of the last three years and they demonstrated that the river is in good condition. However, the ecological quality decreased at certain locations indicating that organisms were subjected to some type of disturbance. As the ecological quality can be conditioned by pulses of contamination from the sediments, in environmental adverse conditions, assays were performed with elutriates, obtained from sediments collected near the mining complex Braçal-Palhal. Results showed that this method was effective achieving the state of contamination, which may be important in prioritizing/scoring of critical areas within river ecosystems potentially impacted, using the WFD methodology. However, this methodology requires the collection of sediment which can promote the modification and / or loss of contaminants. To solve this potential problem, we developed a new methodology to obtain similar results. For this, we used a benthic microalga, belonging to the Portuguese flora, sensitive to organic pollution and metals. This methodology was optimized for application in situ, by immobilization of diatom in calcium alginate beads. The results showedthat their sensitivity and normal growth rate are similar to data obtained when used free cells of diatom. This new methodology allowed the achievement of a very quick response on the degree of contamination of a site, providing a complementary methodology to WFD.