Gene expression in understanding mechanisms of toxicity in amphibians

De uma forma geral os anfíbios são conhecidos como organismos que apresentam uma grande sensibilidade a vários tipos de contaminantes. Contudo existem casos, como o de Pelophylax perezi (rã-verde), em que estes organismos habitam áreas extremamente contaminadas. Este facto verifica-se na mina de urânio desactivada, da Cunha Baixa (Viseu, centro de Portugal), em que uma população destas rãs habita na lagoa de efluente ácido mineiro (M). Estudos ecotoxicológicos anteriores com estes organismos revelaram apenas efeitos de toxicidade ténues levantando algumas questões. Com o objectivo de elucidar quais os mecanismos que permitem a P. perezi permanecer neste local, sem sofrer aparentemente efeitos perniciosos, encetamos este trabalho. Numa primeira abordagem, avaliámos o sistema de defesa antioxidante de rãs adultas, bem como o conteúdo em metais de alguns órgãos. Desta forma verificámos alterações enzimáticas, principalmente no pulmão e acumulação de metais nos vários órgãos. Posteriormente foi realizado um estudo de expressão genética diferencial, também em organismos adultos e desta feita foram sugeridos alguns mecanismos de protecção basal que estarão por detrás da capacidade de suportar este ambiente extremamente contaminado. Numa etapa seguinte abordámos os efeitos em fases larvares, fazendo inicialmente uma exposição in situ, a vários efluentes, caracteristicamente diferentes, do complexo mineiro. Avaliámos o crescimento, a acumulação de metais e a actividade de alguns biomarcadores de stress oxidativo. Como resultado pudemos constatar que nas fases larvares para além de alguma mortalidade existe acumulação de metais bem como algumas alterações a nível de biomarcadores de stress oxidativo. Numa última abordagem realizamos uma exposição crónica dos girinos a efluente da mina com diversos níveis de pH para distinguir os efeitos da toxicidade do pH, dos efeitos da toxicidade pelo conteúdo de metais. Para tal avaliámos novamente biomarcadores de stress oxidativo, crescimento, acumulação de metais e efectuamos ainda um estudo de expressão genética diferencial. Esta última aproximação permitiu verificar que a toxicidade do efluente resulta primariamente do pH ácido, assumindo a contaminação por metais um papel secundário. Contudo o crescimento dos girinos de P. perezi apresenta-se estimulado por pHs mais baixos. São apontados ainda alguns mecanismos, em girinos, para lidar com o stress causado pela contaminação por metais.De uma forma geral pôde-se constatar que quer anfíbios adultos quer girinos expostos ao efluente apresentam valores altos de metais acumulados. Os biomarcadores de stress oxidativo na sua maioria não apresentaram respostas coerentes mediante as várias exposições. Este trabalho apresentase como um contributo importante para a ecotoxicologia de anfíbios, aumentando os níveis actuais de conhecimento sobre o efeito de contaminação proveniente de efluentes mineiros, sugerindo ainda mecanismos de resistência quer em larvas, quer para adultos.

Amphibians are generally known as organisms that present a great sensitivity to several kinds of contaminants. However, there are some cases as the one of Pelophylax perezi (green frog), where these organisms inhabit extremely contaminated areas. This fact has been recorded, in the deactivated uranium mine of Cunha Baixa (Viseu, Centre of Portugal) where a frogs’ population inhabits the acid mine effluent (M). Previous ecotoxicological studies carried out with these organisms have revealed only mild toxic effects. This has raised some questions on these organisms ability to endure extreme conditions, gaining certainly some advantage in these places in terms of refuge. Aiming to uncover the mechanisms that allow the presence of P. perezi in this area without apparent deleterious effects, this work was carried out. A first approach was to assess the antioxidant defence system in frogs as well as metal content in various organs. Thus enzymatic changes, mainly in lung, and metal accumulation were reported. Afterwards a differential gene expression study was also performed in adult organisms and basal protection mechanisms were suggested as supporting the ability of enduring extremely contaminated environment. These mechanisms encompass the possible increase of the albumin and fibrinogen antioxidants. In the next stage effects on larvae were addressed with an in situ exposure to several mine complex effluents with different characteristics. Growth, metal accumulation and oxidative stress biomarkers were assessed. As a result we can point that in the larval stages, beyond mortality, metal accumulation exists, as well as some oxidative stress enzyme responses. In a final approach, to distinguish metal toxicity effects from pH toxicity effects, tadpoles were exposed chronically to the mine effluent at various pH values. With this purpose, oxidative stress biomarkers, growth, metal accumulation and differential gene expression were performed. This approach allowed verifying that the effluent toxicity results primarily from acidic pH, with metal contamination assuming a secondary role. However P. perezi tadpoles’ growth seems to be stimulated by lower pH values. Some mechanisms in tadpoles are pointed as a way to cope with metal contamination stress. These mechanisms include an increase in osmotic regulation and energy acquisition investment. Overall, it could be noted that both adult amphibians and tadpoles exposed to the effluent have higher metal accumulation. Also the majority of the oxidative stress biomarkers did not present consistent responses throughout the various exposure conditions. This work presents as a new contribution for amphibian ecotoxicology, increasing current knowledge on mine effluent contamination effects and suggesting resistance mechanisms both in larvae and adults.

Doutoramento em Biologia