Metabonomics of human amniotic fluid for prenatal diagnostics

O trabalho apresentado nesta tese teve como principais objectivos contribuir para o conhecimento da composição do líquido amniótico humano (LA), colhido no 2º trimestre de gravidez, assim como investigar possíveis alterações na sua composição devido à ocorrência de patologias pré-natais, recorrendo à metabonómica e procurando, assim, definir novos biomarcadores de doenças da grávida e do feto. Após uma introdução descrevendo o estado da arte relacionado com este trabalho (Capítulo 1) e os princípios das metodologias analíticas usadas (Capítulo 2), seguida de uma descrição dos aspectos experimentais associados a esta tese (Capítulo 3), apresentam-se os resultados da caracterização da composição química do LA (gravidez saudável) por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), assim como da monitorização da sua estabilidade durante o armazenamento e após ciclos de congelamento-descongelamento (Capítulo 4). Amostras de LA armazenadas a -20°C registaram alterações significativas, tornando-se estas menos pronunciadas (mas ainda mensuráveis) a -70°C, temperatura recomendada para o armazenamento de LA. Foram também observadas alterações de composição após 1-2 ciclos de congelamento-descongelamento (a ter em conta aquando da reutilização de amostras), assim como à temperatura ambiente (indicando um período máximo de 4h para a manipulação e análise de LA). A aquisição de espectros de RMN de 1H de alta resolução e RMN acoplado (LC-NMR/MS) permitiu a detecção de 75 compostos no LA do 2º trimestre, 6 dos quais detectados pela primeira vez no LA. Experiências de difusão (DOSY) permitiram ainda a caracterização das velocidades de difusão e massas moleculares médias das proteínas mais abundantes. O Capítulo 5 descreve o estudo dos efeitos de malformações fetais (FM) e de cromossomopatias (CD) na composição do LA do 2º trimestre de gravidez. A extensão deste trabalho ao estudo dos efeitos de patologias no LA que ocorrem no 3º trimestre de gravidez é descrita no Capítulo 6, nomeadamente no que se refere ao parto pré-termo (PTD), pré-eclampsia (PE), restrição do crescimento intra-uterino (IUGR), ruptura prematura de membranas (PROM) e diabetes mellitus gestacional (GDM). Como complemento a estes estudos, realizou-se uma análise preliminar da urina materna do 2º trimestre para o estudo de FM e GDM, descrita no Capítulo 7. Para interpretação dos dados analíticos, obtidos por espectroscopia RMN de 1H, cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada a espectrometria de massa (UPLC-MS) e espectroscopia do infravermelho médio (MIR), recorreu-se à análise discriminante pelos métodos dos mínimos quadrados parciais e o método dos mínimos quadrados parciais ortogonal (PLS-DA e OPLS-DA) e à correlação espectral. Após análise por validação cruzada de Monte-Carlo (MCCV), os modelos PLS-DA de LA permitiram distinguir as FM dos controlos (sensibilidades 69-85%, especificidades 80-95%, taxas de classificação 80-90%), revelando variações metabólicas ao nível do metabolismo energético, dos metabolismos dos aminoácidos e glícidos assim como possíveis alterações ao nível do funcionamento renal. Observou-se também um grande impacto das FM no perfil metabólico da urina materna (medido por UPLC-MS), tendo no entanto sido registados modelos PLS-DA com menor sensibilidade (40-60%), provavelmente devido ao baixo número de amostras e maior variabilidade da composição da urina (relativamente ao LA). Foram sugeridos possíveis marcadores relacionados com a ocorrência de FM, incluindo lactato, glucose, leucina, valina, glutamina, glutamato, glicoproteínas e conjugados de ácido glucurónico e/ou sulfato e compostos endógenos e/ou exógenos (<1 M) (os últimos visíveis apenas na urina). No LA foram também observadas variações metabólicas devido à ocorrência de vários tipos de cromossomopatias (CD), mas de menor magnitude. Os perfis metabólicos de LA associado a pré- PTD produziram modelos que, apesar do baixo poder de previsão, sugeriram alterações precoces no funcionamento da unidade fetoplacentária, hiperglicémia e stress oxidativo. Os modelos obtidos para os grupos pré- IUGR pré- PE, pré- PROM e pré-diagnóstico GDM (LA e urina materna) registaram baixo poder de previsão, indicando o pouco impacto destas condições na composição do LA e/ou urina do 2º trimestre. Os resultados obtidos demonstram as potencialidades da análise dos perfis metabólicos do LA (e, embora com base em menos estudos, da urina materna) do 2º trimestre para o desenvolvimento de novos e complementares métodos de diagnóstico, nomeadamente para FM e PTD.

The work presented in this thesis aimed to contribute to knowledge of 2nd trimester human amniotic fluid (AF) composition and to investigate the possible metabolic effects of prenatal disorders on AF composition through metabonomics, in order to define new potential disorder biomarkers. After an introduction describing the state-of-the-art (Chapter 1), the analytical methodologies used (Chapter 2) and the description of the experimental details of the work performed (Chapter 3), the results from the chemical characterization of AF (healthy pregnancy) by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy are presented, as well as the results of AF stability assessment during storage and after freeze-thaw cycles (Chapter 4). AF samples stored at -20°C registered significant compositional changes, less marked (but still measurable) at -70°C, the latter temperature being then recommended for AF storage. In addition, significant compositional changes were also observed after 1-2 freeze-thaw cycles (to be considered when sample re-usage is necessary), and at room temperature (indicating a maximum period of 4h for handling and analysis of AF). High resolution 1H NMR and hyphenated NMR (LC-NMR/MS) analysis enabled the detection of 75 different compounds in 2nd trimester AF, 6 of which were detected for the first time in AF. Moreover, diffusion-edited spectroscopy (DOSY) experiments allowed the characterization of the main AF proteins in terms of diffusivity and, hence, average molecular weight. Chapter 5 describes the study of the effects of fetal malformations (FM) and chromosomal disorders (CD) on the composition of 2nd trimester AF. In Chapter 6, this approach is extended, to the effects of 3rd trimester disorders, namely preterm delivery (PTD), preeclampsia (PE), intrauterine growth restriction (IUGR), premature rupture of the membranes (PROM) and gestational diabetes mellitus (GDM). These studies were complemented by a preliminary analysis of 2nd trimester maternal urine to study FM and GDM (Chapter 7). Interpretation of the analytical data obtained by 1H NMR spectroscopy, ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) and mid-infrared spectroscopy (MIR) was performed through partial least squares and orthogonal partial least squares - discriminant analysis (PLS-DA and OPLS-DA) and statistical correlation spectroscopy. Monte-Carlo cross-validated (MCCV) PLS-DA models of AF revealed separation of FM cases from controls (sensitivities 69-85%, 80-95% specificities, classification rates: 80-90%), revealing disturbances in energy metabolism, amino acids and sugar metabolisms and possibly abnormal kidney function. A high impact of FM on maternal urine was also observed (by UPLC-MS), however, the models obtained were of lower sensitivity (40-60%), probably due to the low sample numbers and higher variability of urine composition (in relation to AF). Possible markers of FM were suggested including lactate, glucose, leucine, valine, glutamine, glutamate, glycoproteins and conjugation products of glucuronic acid and/or sulfate with endogenous and/or exogenous metabolites (<1 M). In addition, metabolite variations were found in AF related to the occurrence of several types of chromosomal disorders (CD), although of smaller magnitude. Second trimester AF profiling associated with pre-PTD produced models, which, despite their low predictive power, enabled the detection of metabolite variations suggestive of early fetal-placental dysfunction, hyperglycaemia and oxidative stress. The models obtained for pre-IUGR, pre-PE, pre-PROM and pre-diagnostic GDM (both AF and urine) showed low predictive power, reflecting the small impact of these disorders in 2nd trimester AF and/or urine composition. The results presented demonstrate the potential of metabolic profiling of 2nd trimester AF (and, although based on less studies, maternal urine) for the development of new complementary prenatal diagnosis methods, namely for FM and PTD.

Doutoramento em Química