小麦肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）基因的分离和功能分析

作为植物界广泛存在的一类酚类聚合物，木质素是陆生植物正常生长发育过程中非常重要的生物大分子，而且与人类的生活息息相关。利用分子生物学手段和基因工程方法，从小麦中分离木质素生物合成途径的关键酶-肉桂酰辅酶A还原酶基因（CCR），研究肉桂酰辅酶A还原酶基因在木质素代谢途径中的调控规律，从其催化的限速步骤入手，来调控木质素的合成，有效的改变木质素的组成、含量和结构，是改善木质素在植物生长发育中的作用乃至开发木质素资源的关键所在。本文就小麦肉桂酰辅酶A还原酶基因的分离、表达特征及其在木质素合成途径中的作用开展了研究工作。 首先用RACE方法从小麦中克隆了CCR的两个cDNA的部分序列，序列分析表明它们编码的蛋白具有CCR的典型特点，GC含量高于均60%，两者在核酸水平和蛋白水平的同源性为76%和 69%，证明在小麦中至少存在着两个CCR基因。通过 RT-PCR和Northern 杂交确定W-cr6和W-cr19在小麦的发育中具有不同的表达特征，W-cr6主要在茎中表达，而W-cr19的表达集中在根中。以W-cr6为探针，从cDNA文库中筛选到一个全长1317bp的cDNA，命名为TaCCR1。TaCCR1包括开放阅读框 (ORF) 1047bp、5′端侧翼 72bp和3′端侧翼198bp的非翻译序列。TaCCR1能够编码由349个氨基酸组成的蛋白质，预期的分子量为37.4kD。同源性比较显示TaCCR1基因在核酸水平和蛋白质水平与其他物种的CCR基因的同源性高于60%。 为了分析CCR在木质素合成中的作用，用TaCCR1构建了用于转化烟草的正义和反义表达载体pStCCR和pAtCCR、用于转化小麦的正义和反义表达载体pBSC1和pBAC1。通过农杆菌介导得到了30株反义转基因烟草和12株正义转基因烟草。由于外源基因的抑制作用，转基因烟草在形态、木质素组成和含量、木质部显微结构上都程度不同的发生了变化。正义和反义的转基因株系呈现出株型矮化、木质素含量下降、木质部导管细胞壁受到破坏等现象。同时利用花粉管通道法转化小麦种子5000多粒，部分处理经过初步的PCR和 Southern分子鉴定获得了1株转基因株系，需要对其遗传、生理和形态特征做进一步的研究。 本文还对木质素对小麦茎杆的机械强度的影响做了初步的探讨，得到的结果是小麦茎杆的木质素含量、维管束的数量、茎杆有效的横界面积与其最大弯曲应力存在着正相关，而维管束的结构、密度对茎杆的最大弯曲应力没有明显的影响，从而为通过CCR基因来改善小麦茎杆的抗倒特性建立了生理学基础。

普通烟草与毛曼陀罗族间体细胞杂交的研究

采用PEG／DMSO融合法，从普通烟草(Nicotiana tabacum L.cv.Xanthi nc)叶肉和毛曼陀罗(Datura innoxia Mill.)茎或叶愈伤组织原生质体融合获得I5株花盆中健康生长的族间体细胞杂种植株;其中11株是在没有选择压力的条件下获得，4株则是在有IOA和R6G选择系统存在下获得。同时获得一株试管开花且形态异常的植株和一株花盆中生长的嵌合植株。lOmM IOA和I5μ g／ml R6G均能分别有效地抑制烟草叶肉和毛曼陀罗愈伤组织原生质体的分裂;10% DMSO能显著提高原生质体融合率;PEG种类并不重要，但浓度则很重要;BAP较ZT，KT对植株分化有更好的诱导效果。杂种的形态、细胞、同工酶、Southern杂交，花粉育性分析结果如下：1、l5株杂种较双亲普遍株型矮小，生长缓慢，形态接近烟草但不很正常，根据形态特征可分为两种类型：(1)共有8株，其叶片大小、形状、颜色、开花习惯、花类型（单花）等均与毛曼陀罗接近，但子房败育;(2)共有7株，其株型、叶片形状、颜色、光滑度、花形状、类型（圆锥状花序）、颜色更接近烟草，但少数杂种开单花或先单花后圆锥状花序或先单花后两种花并存，且开花时间不一，部分子房败育。2、杂种染色体数目大都在60～90之间，个别者较少(48条)或较多(125条)，没有一株为双二倍体(2n=96)，并全部为混倍体。3、15株杂种植株均有双亲的细胞色素氧化酶同工酶特征谱带;大部分都有双亲的过氧化物酶同工酶特征谱带，少都仅具烟草的谱带。4、Hae Ⅲ／水稻rDNA的Southern杂交分析表明杂种1较双亲多一条谱带，杂种2较双亲也多一条弱带，其它杂种尚待定。5、花粉活力测定表明毛曼陀罗（种子再生而来）的为99%，烟草（原生质体再生而来）为80～90%，而杂种的为24～61%，育性普遍低于双亲。

体细胞无性系变异与烟草抗黑胫病细胞突变体的筛选

体细胞无性系变异是植物组织培养过程中发生的一种较为普遍的现象，这种现象在遗传学理论和育种实践上都很值得研究。应用这种变异进行筛选人们已经获得了一大批生产上有广泛意义的细胞突变体。但对于无性系变异发生的机理，人们虽然也进行了详细研究，提出了不少假说，但一直未能给出一个较为全面的解释。有些解释仍然建立在推测的基础上，有待进一步的研究。在这些解释中，利用转座子活化进行解释是最使人感兴趣的一种，也是较有说服力的一种。我们的实验分为两个部分，一是对无性系变异发生与转座子的关系进行了初步的探索,一是利用体细胞无性系变异筛选烟草黑胫病细胞突变体的应用进行了研究。 对转座因子的转活性进行分析，通常采用标记基因的表型检测。本实验用农杆菌双元载体pSLJ721（Ac∷GUS）转化烟草（品种：红花大金元）， 然后对转基因烟草的愈伤组织进行GUS酶活性的组织化学分析。通过GUS活性变化来分析转座活性。结果表明组织培养可以增强转座子的活性。间接证明转座子活化是体细胞无性系变异的原因之. 本论文实验方面的另一部分是体细胞无性系变异在烟草抗黑茎病研究上的应用。烟草黑茎病是由烟草致病疫霉引起的一种烟草主要病害。首先从云南地区黑胫病病区分离、纯化黑胫病（Phytophythora parasitica via. Nicotina）病原菌，同时利用红花大金元为实验对象，以组织培养中自然发生的元性系变异为基础，以50％以及80％的黑胫病病菌粗毒素为选择压力，筛选出抗黑胫病毒素的烟草株系，用离体叶片法和茎部接种法进一步鉴定其对黑胫病病菌的抗性。最后进行田间检测以期获得综合性状优良的抗黑胫病细胞突变体。另外我们还利用随机引物扩增多态DNA（RAPD）分析技术，对选择到的九个抗病株系和六株对照的DNA进行分析。在使用的70种随机引物中，共有57个引物产生可检测扩增产物，产生306条搁增带，其中有多态性的条带数为51条，突变体的平均RAPD条带变异率为1.85％，其中有两个RAPD条带（CYA－17－100和Sangon03-350）为突变体所特有，可初步判断为抗黑胫病的RAPD标记。对突变体和对照植株叶片水溶性蛋白SDS电泳观察到一些条带的变异，但没有找到突变体特异的共同条带。

转基因植物生产生物可降解塑料PHB的研究-phbA功能鉴定、多价表达载体的构建及转基因植物的获得

聚-β-羟基链烷酸（PHA）是许多微生物作为碳源、能源的一类贮藏性聚酯，具有广泛的应用价值。该聚酯可被微生物完全降解且有与塑料相似的性质，因而研究并提高PHA在植物中的合成为解决环境污染提供了新的解决途径。 聚-β-羟基于酸酯（PHB）是研究的最早、研究的最清楚的一种PHA。用聚合酶链式反应扩增并克隆了真养产碱杆菌（Alcaligenes eutrophus）中合成PHB的一个关键酶——3-酮硫裂解酶基因phbA。DNA序列分析表明所克隆的基因与国外报道序列同源性很高，只有一个碱基对的区别。为了检测该基因的功能及导肽的定位效率，构建了带有导肽基因的组成型表达载体，由根癌农杆菌介导转化烟草（Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38）得到转基因植株。蛋白质电泳结果表明导肽可以将外源蛋白定位于质体，phbA基因能翻译成相应大小的蛋白。酶活性分析证实了转基因烟草中phbA编码的3-酮硫裂解酶可以催化乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA。 将携有导肽序列的phbC（编码PHB合酶）和phbB（编码乙酰乙酰-CoA还原酶）连入pBIB-HYG得到组成型表达载体pZCB，用冻融法转入根癌农杆菌，介导转化烟草。烟草为已获得的具有卡那霉素抗性整合并表达phbA的转基因烟草。通过二次转化将携有潮霉素抗性的phbB基因和phbC基因导入已整合phbA的烟草，各基因均由质体导肽控制，最后得到整合PHB合成的三个酶基因的转基因烟草。转基因烟草经PCR、PCR-Southern检测，初步确定整合phbB和phbC烟草植株。以气相色谱初步分析，转基因烟草中PHB的含量可达鲜重的0.233%。 结果表明phbB和phbC基因可以在真核表达系统中编码相应的蛋白。通过色素分析、荧光动力学等手段分析了PHB在叶绿体中的累积对其功能的影响。 为了提高底物乙酰-CoA的供应能力及减少惰性聚酯对植物体的伤害，分离了种子特异性启动子和质体导肽序列，利用忆经克隆的合成PHB的三个关键酶基因，通过一系列DNA重组，分别构建了含有种子特异性启动子的嵌合phbC、phbB的二价表达载体pSCB及嵌合phbC、phbA、phbB的三价表达载体pSCAB，并由导肽将基因表达产物定位于质体。经根癌农杆菌介导转化油菜（Brassica napus L.) H165，获得转基因油菜植株，并进行了PCR、Southern blot及RT-PCR-DNA杂交等分检测。结果表明，三基因已经分别整合到相应的转基因油菜中，并已在转录水平表达。同时转化了油菜不育系、恢复系和保持系，获得批量转化株，并移入温室栽培。

两个固氮相关的植物基因对烟草和水稻的转化及其表达

豆科植物凝集素基因和血红蛋白基因在对根瘤菌的识别作用和类菌体在低氧分压下的共生固氮中起重要作用。本文的目的是试图将这两个基因转移到非豆料植物烟草和水稻，使其能识别根瘤菌，探讨非豆科植物的共生和联合固氮的可能性。 构建了含有豌豆凝集素（P－Lec）基因、Parasponia andersonii血红蛋白基因、gus基因及植物选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）的两个植物表达载体pCBHL和pCBHUL;同时，还构建了含有P－Lec基因、gus基因及植物选择标记PPT乙酰转移酶基因（bar）的植物表达载体pBBUL。在pCBHL中，CaMV35S启动子调控P－Lec基因的表达，而在pCBHUL和pBBUL中，该基因由玉米Ubiquitin 1启动子调控。 用农杆菌法将pCBHL导入烟草，得到53株再生植株，PCR检测表明转化频率为88％。用基因枪法分别将pCBHUL和pBBUL导入水稻幼胚或幼胚诱导的愈伤组织。转pCBHUL的材料共得到40株再生植株，经分子检测有18株分转基因植株，转化频率为0.9%。转pBBUL的幼胚愈伤组织经PPT筛选，只得到能分化出小芽的抗性愈伤组织。 PCR检测、Southern杂交表明P-Lec基因和Paraspoina血红蛋白基因都已经整合到转基因烟草及水稻的基因组中，转基因水稻植株中两个外源目的基因的拷贝数较高。Western杂交分析转基因植物中P-Lec基因的表达情况，结果表明该基因在转基因的烟草和水稻叶片中得到正确地表达。同时，GUS组织化学染色表明转基因烟草的嫩茎和幼根，转基因水稻的嫩叶和幼根中都有gus基因的表达。转基因烟草中外源基因的表达频率高于转基因水稻。T1代转基因烟草幼根的蛋白原位免疫杂交显示P-Lec正确定位于正在生长的幼根根毛的顶端，与对照豌豆中的P-Lec基因表达部位相一致。关于Parasponia血红蛋白基因，以前本实验室对转基因烟草和水稻的研究表明有转录水平的表达，国外实验室证实转基因烟草中有转译表达。 上述结果有可能为进一步研究转基因非豆科植物与根瘤菌的相互作用奠定一定的基础。

烟草FtsZ基因的表达特征分析及其对质体发生的影响

FtsZ (filamentation temperature-sensitive，fts)是广泛存在于原核生物和高等植物中的一种功能蛋白。它控制着原核细胞和质体的分裂过程。研究该基因的表达调控特征，为我们进一步认识原核细胞和质体分裂的分子机制及真核细胞的起源和进化等重要问题提供了新的思路。从烟草克隆FtsZ cDNA，构建了谷胱甘肽转移酶（GST, glutathione S-transferase，EC 2.5.1.18）与FtsZ融合蛋白的表达质粒，并将其导入到在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下能高效表达的JM109大肠杆菌中。高表达的融合蛋白通过谷胱甘肽一琼脂糖(glutathione-agarose)亲和层析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后，用以免疫兔子制备抗血清。免疫印迹法表明烟草FtsZ基因表达具有明显的组织器官特征，在质体（叶绿体）分裂活跃部位表达强：幼嫩花瓣>幼叶>幼根>老叶>茎。黑暗处理l天对FtsZ表达似乎无影响，随黑暗培养时间延长，FtsZ蛋白表达逐渐降低，叶绿体转化成为数目众多（增加2-3倍）体积小的淡黄色或白色质体。该实验结果显示，光对植物FtsZ基因表达很可能无直接影响，FtsZ基因表达强弱是决定质体（叶绿体）分裂和细胞中质体（叶绿体）数目多少的主要原因之一。

紫黄质脱环氧化酶在烟草中的过量表达和反义抑制研究

叶黄素循环被发现具有热耗散的作用后，已引起人们广泛的关注。目前普遍认为叶黄素循环的色素定位于天线色素蛋白复合体上，在跨膜质子梯度（ΔpH）形成后，玉米黄质（zeaxanthin;Z）和环氧玉米黄质（antheraxanthin;A）能够从叶绿素中吸收过多的激发能，并以热能的形式耗散到体外，从而保护光合器官免受强光的破坏。紫黄质脱环氧化酶（Violaxanthin de-epoxidase;VDE）是叶黄素循环的关键酶，存在于植物类囊体内腔中，它催化紫黄质（violaxanthin）脱环氧化生成环氧玉米黄质(A)和玉米黄质(Z)。本文利用过量表达和反义抑制技术获得两种转基因烟草植株，并用于研究紫黄质脱环氧化酶在叶黄素循环中的作用。 首先我们从烟草中克隆了编码VDE酶的基因，分别以正向和反向插入到具有潮霉素抗性选择标记的双元载体pCAMBIA1301，构建了Tvde基因的过量表达载体pCBTO和反义抑制表达载体pCBTA。然后通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化烟草(Nicotiana tabacum L.)，获得了过量表达和反义抑制两种转基因植株。PCR扩增潮霉素抗性基因hpt和Southern杂交检测结果表明，Tvde基因已整合到转基因烟草的基因组中，外源基因在转基因烟草基因组中以1个拷贝的形式存在。VDE酶活性测定表明，在反义抑制转化体中VDE酶活性被抑制60%，而在过量表达转化体中VDE酶活性提高了75%。通过色素的HPLC分析和荧光动力学测定结果表明，强光处理后，在反义抑制转化体和过量表达转化体中，Z的含量，DES，NPQ和Fv/Fm等数据说明转基因烟草中VDE含量与植物非光化学猝灭能力有直接关系，进而说明叶黄素循环具有热耗散的功能。

利用转基因植物生产生物可降解塑料(PHB)的研究

聚 3 一控基丁酸酯 (Poly – 3 - hydroxybutyrate,PHB) 及其它类型的聚 3-泾基链烷酸醋同属于聚酯类物质 , 是自然界中多种细菌的碳源及能源储备物。这种聚酯的物理化学特性与传统塑料相似 , 并具有生物可降解性 , 如能取代化学合成塑料将减少环境中的塑料废弃物 , 从源头治理 " 白色污染 " 问题。微生物发酵法生产的 PHB 价格过高 , 无法在市场上与化学合成塑料竞争。随着分子生物学的发展 , 人们逐渐将视线转向植物生物反应器。转基因植物能够利用二氧化碳为碳源、太阳能为能源合成目的产物 , 大大降低生产成本 , 为生产具有市场 竞争力的新型生物可降解塑料提供可行途径。在此领域虽然己取得一定进展 , 但远未达到商业化生产水平。大规模商业化生产要求转基因植物能够在确保环 境安全性的前提下高效、稳定地生产 PHB 。本文尝试改善植物中 PHB 的生产体系 ,为环保型塑料早日进入市场作出努力。 1. 由于表达框架中多次使用同一启动子会导致基因沉默 , 本文克隆了另一 种子特异性启动子 nap300, 以替换重复使用的7S启动子,减轻“共抑制”。将 nap300 与 GUS 基因相连进行功能鉴定。荧光检测和组织化学染色的结果都证明此仅 30Obp 的 DNA 序列足以调控基因进行种子特异性表达。尽管 B 盒作为 高度保守区在种子特异性表达中起重要作用 , 位于此处的两个碱基替代型突变 并未使 nap300 的活性明显降低 , 对启动子的时空表达模式也无明显影响。将 nap300 、 7S 分别与 phbA 基因 ( 编码 3-酮硫裂解酶) 相连 , 在相似表达环境中 对二者功能进行比较 , 发现两个启动子表达模式基本相同并在同一时期达到活 性高峰 , 因此 nap300 可用于改善 PHB 合成基因在植物体内的表达调控。通过 对种子特异性启动子的比较可加深对其表达模式的了解 , 为植物基因工程中的 精细调控提供依据。 2. 叶绿体基因工程是随着植物遗传转化技术发展刚刚兴起的生物技术 , 具 有超量表达外源基因 , 为原核基因提供适宜表达环境 , 消除 “位置效应”和基因沉默 , 环境安全性好等优点 , 较更适合用于植物生物反应器方面的研究。本研究在国内率先探讨将叶绿体转化技术引入植物生产生物可降解塑料这一领域 的可行性 ( 国外仅有日本一例 ), 构建了叶绿体转化及表达载体 pTRV-PHB, 通过基因枪法将 PHB 合成相关基因导入烟草叶绿体基因组。转基因烟草顺利达到同质化，其形态和生长发育均无异常。 Northern 点杂交检测表明与 PHB 合成相关的三个基因均能在转录水平表达 , 未出现核转化中经常发生的“基因沉默”现象。通过 RT-PCR 进一步检测表明叶绿体型转基因烟草中目的基因的表达水平明显比核转化植株中相应基因的表达水平高。气相色谱分析确证转基因植株具有合成 PHB 的能力。这些都表明叶绿体转化适合用于转基因植物生产 PHB的研究。虽然叶绿体型转基因烟草中产物含量偏低 , 并未达到预期结果 , 但经进一步改进与完善 , 终将会成功地用于生产高附加值产品的植物基因工程中。 3. 为初步探讨叶绿体转化中在同源重组反应介导下整合外源基因的机理 , 从油菜叶绿体基因组中分离两段序列作为同源片段 , 基因枪法转化烟草 , 结果显示即使供体所含同源片段与受体叶绿体基因组相应区域差异高达 10%, 转化效率也无降低。这一现象的发现有助于促进“通用载体”　的改进 , 扩展叶绿体转化受体范围乃至达到商业化应用水平。 4. 成功地通过二次转化获得整合并表达多基因的转基因烟草 , 缩短了研究周期 , 对相关转基因植物的研究有一定参考价值。本文还优化了油菜转化体系 , 使转基因油菜同时整合三个 PHB 合成相关基因的效率由 7.69% 增加至 16.0% 。 田间试验与产物分析正在进行中。

烟草NtFtsZ2-1基因在叶绿体分裂中的作用机制研究及NtFtsZ1-2基因启动子的克隆

根癌农杆菌通过将一段含有“癌”基因的T-DNA导入植物基因组中，引起植物的肿瘤：冠瘿。根癌农杆菌的这种能力来源于Ti质粒（Tumor inducing plasmid）。遗传工程中，根癌农杆菌的这一特性被用来将连接入Ti质粒T-DNA区两个边界之间的外源基因转入植物基因组。随着植物分子生物学的发展，T-DNA转化的原理被进一步阐明，农杆菌介导的转基因技术也得到进一步优化，更适合遗传工程操作。特别是Ti质粒毒性区和T-DNA区的反式作用（即位于不同质粒的T-DNA和毒性区也能侵染植物）被发现以来，双元表达载体的构建使遗传工程操作大为简便。 常用的双元表达载体大小都在11kb以上，尽管远远小于几百kb的野生型Ti质粒，但在实际的体外操作中还是不够简便。常用的植物双元表达载体pBI121的基因序列被测定（Frisch et al.，1995），数据显示非T-DNA区一半以上的序列被发现和功能无关，这使双元载体的进一步缩小成为可能。本文即通过PCR方法克隆到pBI121非T-DNA区中载体复制、三亲杂交必需的片段，结合载体pART27中的T-DNA区（含有真核、原核表达活性的嵌合npt II基因）创造了小的合成型植物表达双元载体pSY1（小于7kb）。然后将pBI121上带有35S启动子和nos终止子的GUS基因克隆到pSY1的T-DNA区中，得到pSY2（约10kb）。进一步用pROK2上的35S启动子和nos终止子区替换pSY2上的GUS表达区，得到pSY3（约8kb）。通过三亲法将pSY2转入根癌农杆菌中，根癌农杆菌再通过叶盘法侵染烟草叶片，获得愈伤组织，愈伤组织进一步分化出小苗。GUS组织化学染色表明GUS基因在转基因的愈伤组织和小苗中均有表达，PCR检测也证明GUS基因被导入了植物基因组。pSY系列载体能成功的用于植物遗传转化。

植物络合素合酶基因的功能分析及其应用

植物络合素（phytochelatins，PCs）是含有γ-Glu-Cys重复结构的小分子多肽，其结构通式为：（γ-Glu-Cys）n-Gly（n=2-11）。植物络合素（PCs）由植物络合素合酶（PCS）催化谷胱甘肽（GSH）聚合而成，能够络合重金属离子而具有解毒功能，这是植物解毒重金属胁迫的重要机制之一。本文克隆了来源于重金属抗性植物绊根草（Cynodon dactylon cv Goldensun）的植物络合素合酶基因，通过基因工程手段使其在烟草中过量表达，得到了一些有望用于植物修复（phytoremediation）的工程植株。同时，在水稻（Oryza sativa）种子中利用RNAi技术抑制植物络合素合酶基因的表达，以降低重金属离子在人类最重要的粮食作物水稻的籽粒中的积累。 1. 通过RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）方法从抗性植物绊根草中克隆了植物络合素合酶基因CdPCS1，其1515 bp的读码框编码一个含505个氨基酸的蛋白质，蛋白质序列分析表明它具有植物络合素合酶的结构特征，同时还具有磷酸化位点和亮氨酸拉链结构。 2. CdPCS1基因可以互补对铜和镉离子敏感的酵母突变株ABDE-1（cup1Δ）中缺失的金属硫蛋白基因CUP1的功能，也可以互补对砷离子敏感的酵母突变体FD236-6A（acr-3Δ）中的离子外排载体基因ARC3的缺失。 3. 将CdPCS1转入烟草，共获得过表达CdPCS1的烟草44个株系，其中融合GFP的株系16个。对T0代的转基因植株的PCs含量以及重金属抗性和吸收能力进行了分析，其中抗性实验表明，在300μmol/L 的Cd2+离子胁迫11天之后，野生型植株的叶片出现斑点状坏死，而两个转基因烟草株系S6和K49的植株没有出现受伤害症状。在100μmol/L的CdSO4处理一周后，转基因植株中的PCs含量比对照有不同程度的提高，最多提高了2.88倍。当用300μmol/L Cd2+处理9天再用600μmol/L Cd2+处理2天后，Cd的积累量比野生型植株增加了2倍多;用50μmol/L As3+处理7天再用100μmol/L As3+处理2天后，转基因植株对As的积累量最多增加了3倍多。说明转入绊根草PC合酶基因的烟草增加了植物络合素的合成，并由此增加了对镉离子的抗性以及对镉离子和砷离子的积累。 4. 对转基因烟草中的CdPCS1进行了亚细胞定位研究。在激光共聚焦显微镜和荧光显微镜下分别用转基因烟草叶片组织和叶肉细胞原生质体观察融合GFP的CdPCS1，结果表明融合蛋白定位于细胞核中。 5. .利用RNAi技术抑制水稻种子中植物络合素合酶基因的表达，共获得39个转基因株系。其中35个株系为种子特异性ZMM1启动子驱动OsPCS1基因的RNAi，其余4个株系由组成型的Ubiquitin启动子驱动。RT-PCR的分析结果表明：一个由ZMM1启动子驱动的RNAi转基因水稻株系的种子中，OsPCS1的mRNA水平比对照中的下降了一半。

roIC基因和MT基因特性及其表达的研究

植物种子萌发、开花结实和衰老等一系列生长发育过程，都受到植物激素的影响。细胞分裂素作为重要的生长调节物质，对其传统生物化学和生理学特性的研究已积累子大量资料。随着分子生物学的发展，对植物激素的研究又进一步从单纯的生物学描述阶段深入到分子水平研究的阶段。尤其是近年来对来自病原微生物植物激素相关基因的研究，为揭示细胞分裂素的作用机理和细胸分裂素的水平调节机制的阐明开辟了新的途径。 根瘤农杆菌T-DNA上ipt、iaaM和iaaH基因和发根农杆菌的rol基因表达产物与植物激素的代谢有关。rolC基因是位于发根农杆菌T-DNA区的12号开放读框，编码细胞分裂素-β-葡萄糖苷酶，水解结合态细胞分裂素为自由态细胞分裂素。ipt基因编码异戊烯基转移酶，是细胞分裂素合成过程中的关键酶。 本文用PCR方法从发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）1601质粒中扩增 rolC基因，并构建CaMV 35S启动子驱动下的双元表达载体。以农杆菌介导的叶盘法，分别对野生型烟草（Nicotiana tabacum L. cv. W38）和已转入异戊烯基转移酶基因（ipt）的3F1和3F2烟草进行转达化。Southern blot和Northern Dot Blot分析表明，rolC基因已导入烟草植株，并具有转录活性。转基因烟草的形态特征与细胞分裂素过量表达的植株表现出的特征一致。 用ELISA方法测定转基因烟草植株中激素的含量，结果显示，单独转rolC基因烟草和同时转入rolC和ipt两个基因的烟草，细胞分裂素的水平有不同程度的提高。转基因烟草表现多芽、节间缩短、叶色深绿等现象。同时，转基因烟草内部发生生理变化，如总自由氨基酸、脯氨酸在正常情况下较对照减少，气孔延迟关闭。在干旱胁迫下，转基因烟草随水势的降低、总自由氨基酸和脯氨酸的变化与对照不同。转基因烟草在开始干旱阶段较对照的总自由氨基酸和脯氨酸含量低，随着干旱胁迫的加深，植物中自由氨基酸的含量增加，但转基因植物自由氨基酸的含量高峰值出现时间较对照推迟。干旱胁迫48小时后，恢复给水，转基因植物较对照易恢复正常生长状态，表明转细胞分裂素基因植物抗旱能力增强。另外，叶片总蛋白SDS-PAGE电泳分析表明，转基因植物蛋白质含量高于对照，某些蛋白组分所占比例也明显提高。 综上所述，转rolC和ipt基因烟草的形态和生理变化，是细胞分裂素过量表达引起植物体内激素失衡的结果。

能用于三亲杂交的植物双元表达小载体pSY系列的构建及转基因鉴定

根癌农杆菌通过将一段含有“癌”基因的T-DNA导入植物基因组中，引起植物的肿瘤：冠瘿。根癌农杆菌的这种能力来源于Ti质粒（Tumor inducing plasmid）。遗传工程中，根癌农杆菌的这一特性被用来将连接入Ti质粒T-DNA区两个边界之间的外源基因转入植物基因组。随着植物分子生物学的发展，T-DNA转化的原理被进一步阐明，农杆菌介导的转基因技术也得到进一步优化，更适合遗传工程操作。特别是Ti质粒毒性区和T-DNA区的反式作用（即位于不同质粒的T-DNA和毒性区也能侵染植物）被发现以来，双元表达载体的构建使遗传工程操作大为简便。 常用的双元表达载体大小都在11kb以上，尽管远远小于几百kb的野生型Ti质粒，但在实际的体外操作中还是不够简便。常用的植物双元表达载体pBI121的基因序列被测定（Frisch et al.，1995），数据显示非T-DNA区一半以上的序列被发现和功能无关，这使双元载体的进一步缩小成为可能。本文即通过PCR方法克隆到pBI121非T-DNA区中载体复制、三亲杂交必需的片段，结合载体pART27中的T-DNA区（含有真核、原核表达活性的嵌合npt II基因）创造了小的合成型植物表达双元载体pSY1（小于7kb）。然后将pBI121上带有35S启动子和nos终止子的GUS基因克隆到pSY1的T-DNA区中，得到pSY2（约10kb）。进一步用pROK2上的35S启动子和nos终止子区替换pSY2上的GUS表达区，得到pSY3（约8kb）。通过三亲法将pSY2转入根癌农杆菌中，根癌农杆菌再通过叶盘法侵染烟草叶片，获得愈伤组织，愈伤组织进一步分化出小苗。GUS组织化学染色表明GUS基因在转基因的愈伤组织和小苗中均有表达，PCR检测也证明GUS基因被导入了植物基因组。pSY系列载体能成功的用于植物遗传转化。

二脂酰甘油酰基转移酶基因(DGAT1)的沉默对烟草油脂合成的影响

二脂酰甘油酰基转移酶 (DGAT; EC 2.3.1.20) 是催化三脂酰甘油（TAG）合成的最后也是最关键步骤的酶。TAG是真核细胞中最重要的能量存储形式。在植物中，TAG主要在种子、花粉和许多物种的果实中积累。然而，DGAT1基因的转录本也存在于植物的其它器官中，这些器官包括根、茎、叶、花瓣、花粉囊、未成熟的角果、幼苗以及正在发芽的种子等。迄今为止，许多针对DGAT1基因的研究都集中于DGAT1基因的表达在对种子油脂的积累以及对种子中TAG的脂肪酸组成所起的作用上。在本研究中，我们通过构建烟草DGAT1基因带有内含子的发卡RNA（hpRNA）结构，使之在转基因烟草植株中表达双链RNA（dsRNA），利用RNAi原理达到使烟草内源DGAT1基因沉默的目的。转基因沉默烟草植株的获得将会为更好地研究DGAT1基因的功能奠定基础。本实验不仅研究分析了DGAT1基因的抑制对烟草种子油脂积累的影响，还对表现出沉默性状的转基因植株Sil7的不同器官中TAG的含量以及DGAT1的转录水平等进行了研究分析。此外，通过对转基因烟草不同株系种子中的主要贮藏物质——油脂、蛋白质和糖的含量测定，初步揭示出在烟草种子中三者生物合成代谢之间存在的相关性。主要研究结果如下： 采用烟草DGAT1基因的第615～1293碱基之间679bp的片段构建了能表达发卡RNA（hpRNA）结构的表达载体，并转化烟草（Nicotiana tabacum）Wisconsin 38。Northern杂交分析发现,与野生型对照烟草（WT）相比，在沉默植株的花和发育状态种子中DGAT1基因的转录水平有很大降低，这表明该发卡结构能够高效率地引起烟草DGAT1基因的沉默。此外，在对Sil1至Sil12共12株转基因烟草进行油脂含量分析的结果表明，其中有8株表现出油脂降低的性状，转基因沉默效率达到67％。这表明：利用RNAi的方法可对目标基因进行特异降解来研究基因的功能，因此是一个在研究基因的表达功能上十分有效的方法，而且已成为植物基因工程的有力工具。 为了研究DGAT1基因的沉默对转基因植株不同器官的影响，本实验分析了转基因植株Sil7的不同器官中TAG的含量和脂肪酸组成，并采用RT-PCR方法对野生型对照和转基因植株中DGAT1基因的转录水平进行了比较分析。研究发现，转基因植株不同器官中DGAT1基因转录水平的降低与各器官中TAG含量的减少呈正相关。由此看来，植物中DGAT1的表达水平与植物的各个器官内TAG的含量之间存在着一定的对应关系。此外，在转基因植株Sil7不同器官中依然能够产生TAG，这说明或者DGAT1酶活性丧失而由其它的酶（如DGAT2和PDAT）参与TAG的合成，或者DGAT1酶活性只是部分地受到影响。本实验还对Sil7的根、茎、叶、花瓣和种子中TAG的脂肪酸组成进行了分析，结果发现，与烟草野生型对照相比，在Sil7的这些器官中，除种子中TAG的脂肪酸组成无明显变化外，其余器官中TAG的18:3/18:2脂肪酸比例均有明显升高。 对其中8株转基因烟草种子进行油脂含量分析发现，在转基因烟草中由于DGAT1基因的沉默引起种子中TAG含量的减少，从而引起了种子平均千粒重的下降。而在TAG含量和种子平均千粒重下降的同时，种子中其它贮藏物质－蛋白质和糖类的含量却增加了。该实验结果表明：在烟草种子中TAG的生物合成与蛋白质和糖类物质的合成之间存在着负的相关性。